Kvaliteten af forberedt enkeltcellet affjedring er afgørende for at opnå pålidelige resultater af høj kvalitet for enhver enkeltcellet omikmetode. Og denne protokol vil vise dig, hvordan du isolerer celler hurtigt, forsigtigt og robust fra selv meget udfordrende væv. Den største fordel ved denne protokol er den strømlinede vævsbehandling, som gør det muligt for vævs dissociation og isolering af celler fra et stort antal prøver på kort tid med perfekt kvalitet.
Selv om denne metode blev udviklet til mus og menneskelige tænder, Det kan også anvendes til andre ekstracellulære matrix-rige væv, herunder brusk, knogle, eller tæt bindevæv. Proceduren for isolering af tandmasser fra menneskelige og især musetænder er manuelt udfordrende. Vi råder alle til at teste dette, før de virkelige eksperimenter begynder.
Til at begynde med skal du holde den aflivede mus bag hovedet og se på det ventrale aspekt af hovedet, så halen peger væk. Brug den lille og skarpe saks, hurtigt fjerne huden fra underkæben til at udsætte mandibulære bue, det bløde væv mellem hver halvdel af mandibles og de tilstødende ansigtsmuskler. For at gøre et dybt snit fra hver side af underkæben, først skære gennem massøren langs den buccal side af underkæben op til temporomandibulære fælles og derefter skære langs den indre del af hver halvdel af underkæben gennem bunden af mundhulen.
Skær alle muskler og ledbånd langs underkæben op til temporomandibulære fælles fra både udvendige og indersiden af mundhulen. Tag underkæben ved hjælp af den bøjede spids pincet og fjern den. Derefter med saksen, skære gennem mandibular symphysis at opdele dissekerede underkæbe i to halvdele.
Brug en industriel lav fnugtørsker til at gnave det resterende bløde væv fra hver halvdel af underkæben. Når begge dele af underkæben er renset, skal du placere dem i en færdiglavet petriskål med iskold HBSS. Til dissektion af mandibulære snit fjernes alveolærryggen med alle tre kindtænder og revner på tværs af mandibulær buen på det sted, der svarer til positionen mellem den første og anden molar.
Træk forsigtigt snittet ud af resten af tandstikket. Hvis det er nødvendigt, fjerne de resterende fragmenter af knoglen fastgjort til fortænderne med pincet og en skalpel. Anbring de dissekerede snit i frisk iskold HBSS.
Efter dissekering af væv af interesse, placere dissekeret blødt væv i en dråbe frisk iskold HBSS i midten af en 10 centimeter Petriskål holdes på is. Ved hjælp af et rundt formet nummer 10 skalpelblad skæres vævet i de mindst mulige stykker. Efter re-sammenlægning vævsstykker i midten af dråben, gentagne gange skære væv aggregater med den samme skalpel klinge og gentage denne proces, indtil materialet er tilstrækkeligt hakket.
Overfør de strimlede vævsstykker ved hjælp af en en milliliter pipettespids til en tidligere forberedt fordøjelsesblanding. Placer derefter røret i en vinkel på 60 grader og indstil hastigheden til 150 til 200 RPM for at sikre konstante suspensionsbevægelser inde i røret og inkubere i 15 til 20 minutter. Efter hvert tredje til fire minut under inkubation titreres suspensionen kraftigt ved hjælp af en milliliter pipettespids for at opløse alle klumperne.
I slutningen af inkubationen, efter titrating celle suspension for sidste gang, langsomt tilføje iskold vask opløsning til et sidste volumen på 12 milliliter. Centrifuge celle suspensionen ved 300 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius og derefter forsigtigt fjerne supernatant med en 10 milliliter serologisk pipette. Brugpillen igen i vaskeopløsningen for at opnå den endelige koncentration på 700 til 1.200 celler pr. mikroliter.
Pass celle suspension gennem en 50 mikrometer celle si til at fjerne de resterende klumper eller stykker af forkalket væv og holde røret på isen indtil videre behandling. Derefter indlæses cellerne i et forberedt rør for fluorescerende aktiveret cellesortering. Læg røret i cellesorteringsglasset, og sæt en streng gatingstrategi for at fjerne celleaffald, doubleter og døde celler som beskrevet i tekstmanuskriptet.
For det første blev CD45 antistoffarvning og efterfølgende FACS-analyse brugt til at afklare antallet af immuncellerne i den endelige encellede suspension. Som en gratis metode blev det samlede antal CD45-positive immunceller i de encellede RNA-sekventeringsdata analyseret. Ved hjælp af FACS blev der identificeret 14,44 % CD45-positive celler.
Analyse af enkeltcellede RNA-sekventeringsdata viste, at 10,9 % af CD45-udtrykkende celler og faldet i celler i enkeltcellede RNA-sekventeringsdata kunne skyldes yderligere tærskeling under sekventeringsanalyse. De vigtigste ting er at være hurtige og holde dette væv eller celler på is, når det er muligt. Antallet af isolerede celler kan være meget lavt, især under muse molarisolering.
Undgå celletab. Reduktion af tiden for encellet isolation er meget vigtigt for succesen af alle encellede eksperimenter. Og denne specifikke metode virkelig lov til at reducere denne gang og bane vejen for høj kvalitet dental celle type for mus og menneskelige systemer.