De kwaliteit van de bereide eencellige suspensie is cruciaal voor het verkrijgen van hoogwaardige en betrouwbare resultaten voor elke eencellige omics-methodologie. En dit protocol laat je zien hoe je cellen snel, voorzichtig en robuust kunt isoleren van zelfs zeer uitdagende weefsels. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de gestroomlijnde weefselverwerking die de weefseldissociatie en isolatie van cellen uit een groot aantal monsters in korte tijd met perfecte kwaliteit mogelijk maakt.
Hoewel deze methode is ontwikkeld voor muizen- en menselijke tanden, kan deze ook worden toegepast voor andere extracellulaire matrixrijke weefsels, waaronder kraakbeen, bot of dicht bindweefsel. De procedure van het isoleren van tandpulp van menselijke en vooral muizentanden is handmatig een uitdaging. We raden iedereen aan om dit te testen voordat de echte experimenten beginnen.
Houd om te beginnen de geëuthanaseerde muis achter zijn hoofd en kijk naar het ventrale aspect van zijn kop, zodat de staart weg wijst. Verwijder met de kleine en scherpe schaar snel de huid van de onderkaak om de mandibulaire boog, het zachte weefsel tussen elke helft van de kaken en de aangrenzende gezichtsspieren bloot te leggen. Om een diepe snede van elke kant van de onderkaak te maken, snijdt u eerst door de masseter langs de buccale kant van de onderkaak tot aan het temporomandibulaire gewricht en snijdt u vervolgens langs het binnenste deel van elke helft van de onderkaak door de basis van de mondholte.
Snijd alle spieren en ligamenten langs de onderkaak tot aan het temporomandibulaire gewricht van zowel buiten als binnen in de mondholte. Pak de onderkaak vast met behulp van het gebogen pincet en verwijder deze. Snijd vervolgens met de schaar door de mandibulaire symfyse om de ontleedde onderkaak in twee helften te splitsen.
Gebruik een industrieel laag pluisdoekje om het resterende zachte weefsel uit elke helft van de onderkaak te schuren. Nadat beide delen van de onderkaak zijn gereinigd, plaatst u ze in een vooraf bereid petrischaaltje met ijskoude HBSS. Verwijder voor de dissectie van mandibulaire snijtanden de alveolaire richel met alle drie de kiezen en scheur de mandibulaire boog dwars op de plaats die overeenkomt met de positie tussen de eerste en tweede kies.
Trek voorzichtig de snijtand uit de rest van de tandkom. Verwijder indien nodig de resterende botfragmenten die aan de snijtand zijn bevestigd met een pincet en een scalpel. Plaats de ontleedde snijtanden in verse ijskoude HBSS.
Na het ontleden van het weefsel van belang, plaats je het ontleedde zachte weefsel in een druppel verse ijskoude HBSS in het midden van een petrischaaltje van 10 centimeter die op ijs wordt bewaard. Snijd met behulp van een rond gevormd nummer 10 scalpelmes het weefsel in de kleinst mogelijke stukjes. Nadat u de weefselstukken in het midden van de druppel opnieuw hebt samengevoegd, snijdt u herhaaldelijk de weefselaggregaten met hetzelfde scalpelmes en herhaalt u dit proces totdat het materiaal voldoende is gehakt.
Breng de versnipperde stukjes weefsel met behulp van een pipetpunt van één milliliter over in een eerder bereid digestiemengsel. Plaats vervolgens de buis onder een hoek van 60 graden en stel de snelheid in op 150 tot 200 RPM om constante ophangingsbewegingen in de buis te garanderen en incubaleer gedurende 15 tot 20 minuten. Titreer na elke drie tot vier minuten tijdens de incubatie krachtig de suspensie met behulp van een pipetpunt van één milliliter om alle klonten te desintegreren.
Voeg aan het einde van de incubatie, na het titreren van de celsuspensie voor de laatste keer, langzaam ijskoude wasoplossing toe aan een eindvolume van 12 milliliter. Centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op 300 maal G en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant met een serologische pipet van 10 milliliter. Resuspend de pellet in de wasoplossing om de uiteindelijke concentratie van 700 tot 1.200 cellen per microliter te bereiken.
Laat de celsuspensie door een celzeef van 50 micrometer gaan om de resterende klonten of stukjes verkalkt weefsel te verwijderen en houd de buis op ijs tot verdere verwerking. Laad vervolgens voor fluorescerend geactiveerde celsortering de cellen in een voorbereide buis. Laad de buis in de celsorteerder en stel een strikte gating-strategie in om celresten, doubletten en dode cellen te verwijderen zoals beschreven in het tekstmanuscript.
Eerst werden de CD45-antilichaamkleuring en de daaropvolgende FACS-analyse gebruikt om het aantal immuuncellen in de uiteindelijke eencellige suspensie te verduidelijken. Als een complementaire methode werd het totale aantal CD45-positieve immuuncellen in de eencellige RNA-sequencinggegevens geanalyseerd. Met behulp van FACS werden 14,44% CD45-positieve cellen geïdentificeerd.
Analyse van eencellige RNA-sequencinggegevens toonde 10,9% van de CD45-tot expressie brengende cellen en de afname van cellen in eencellige RNA-sequencinggegevens kan worden veroorzaakt door extra drempels tijdens sequencinganalyse. De belangrijkste dingen zijn snel zijn en dit weefsel of deze cellen waar mogelijk op ijs houden. Het aantal geïsoleerde cellen kan erg laag zijn, vooral tijdens de isolatie van de muizenkiezer.
Vermijd celverlies. Het verkorten van de tijd van eencellige isolatie is erg belangrijk voor het succes van alle eencellige experimenten. En deze specifieke methode maakte het echt mogelijk om deze tijd te verkorten en de weg vrij te maken voor een hoogwaardig tandheelkundig celtype voor muizen en menselijke systemen.
