तैयार एकल-सेल निलंबन की गुणवत्ता किसी भी एकल-सेल ओमिक्स पद्धति के लिए उच्च गुणवत्ता और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। और यह प्रोटोकॉल आपको दिखाएगा कि कोशिकाओं को तेजी से, धीरे से, और यहां तक कि बहुत चुनौतीपूर्ण ऊतकों से भी मजबूत रूप से अलग कैसे किया जाए। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ सुव्यवस्थित ऊतक प्रसंस्करण है जो ऊतक पृथक्करण और सही गुणवत्ता के साथ कम समय में बड़ी संख्या में नमूनों से कोशिकाओं के अलगाव को सक्षम बनाता है।
यद्यपि यह विधि माउस और मानव दांतों के लिए विकसित की गई थी, लेकिन इसे उपास्थि, हड्डी या घने संयोजी ऊतक सहित अन्य बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स-समृद्ध ऊतकों के लिए भी लागू किया जा सकता है। मानव और विशेष रूप से माउस के दांतों से दंत लुगदी को अलग करने की प्रक्रिया मैन्युअल रूप से चुनौतीपूर्ण है। हम सभी को सलाह देते हैं कि वास्तविक प्रयोग शुरू होने से पहले इसका परीक्षण करें।
शुरू करने के लिए, अपने सिर के वेंट्रल पहलू पर देख रहे अपने सिर के पीछे euthanized माउस को पकड़ो ताकि पूंछ दूर हो। छोटे और तेज कैंची का उपयोग करते हुए, मैंडिबुलर आर्क को उजागर करने के लिए मैंडिबल से त्वचा को जल्दी से हटा दें, मैंडिबल्स के प्रत्येक आधे हिस्से और आसन्न चेहरे की मांसपेशियों के बीच नरम ऊतक। मैंडिबल के प्रत्येक पक्ष से एक गहरी कटौती करने के लिए, पहले टेम्पोरोमैंडिबुलर संयुक्त तक मैंडिबल के बुक्कल पक्ष के साथ मैसेटर के माध्यम से काटें और फिर मौखिक गुहा के आधार के माध्यम से मैंडिबल के प्रत्येक आधे हिस्से के आंतरिक भाग के साथ काटें।
मौखिक गुहा के बाहर और अंदर दोनों से temporomandibular संयुक्त तक मैंडिबल के साथ सभी मांसपेशियों और स्नायुबंधन में कटौती। मुड़ी हुई टिप चिमटी का उपयोग करके मैंडिबल को समझें और इसे हटा दें। फिर कैंची के साथ, विच्छेदित मैंडिबल को दो हिस्सों में विभाजित करने के लिए मैंडिबुलर सिम्फिसिस के माध्यम से काटें।
मैंडिबल के प्रत्येक आधे हिस्से से शेष नरम ऊतक को चाफ करने के लिए एक औद्योगिक कम लिंट वाइप का उपयोग करें। मैंडिबल के दोनों हिस्सों को साफ करने के बाद, उन्हें बर्फ के ठंडे एचबीएसएस के साथ एक पूर्व-तैयार पेट्री डिश में रखें। मैंडिबुलर इनसीजर के विच्छेदन के लिए, सभी तीन दाढ़ों के साथ वायुकोशीय रिज को हटा दें और पहले और दूसरे दाढ़ के बीच की स्थिति के अनुरूप जगह में मैंडिबुलर आर्क को अनुप्रस्थ रूप से क्रैक करें।
ध्यान से दंत सॉकेट के बाकी हिस्सों से incisor बाहर खींचें। यदि आवश्यक हो, तो चिमटी और एक स्केलपेल के साथ कृंतक से जुड़ी हड्डी के शेष टुकड़ों को हटा दें। ताजा बर्फ ठंडा HBSS में विच्छेदित incisors जगह.
ब्याज के ऊतक को विच्छेदन करने के बाद, विच्छेदित नरम ऊतक को बर्फ पर रखे गए 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश के बीच में ताजा बर्फ के ठंडे एचबीएसएस की एक बूंद में रखें। एक गोल आकार की संख्या 10 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके, ऊतक को सबसे छोटे संभव टुकड़ों में काट लें। बूंद के बीच में ऊतक के टुकड़ों को फिर से एकत्रित करने के बाद, बार-बार एक ही स्केलपेल ब्लेड के साथ ऊतक समुच्चय में कटौती करें और इस प्रक्रिया को दोहराएं जब तक कि सामग्री पर्याप्त रूप से कीमा न बनाया जाए।
एक मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग करके कटा हुआ ऊतक टुकड़ों को पहले से तैयार पाचन मिश्रण में स्थानांतरित करें। फिर ट्यूब को 60 डिग्री के कोण पर रखें और ट्यूब के अंदर निरंतर निलंबन आंदोलनों को सुनिश्चित करने के लिए गति को 150 से 200 आरपीएम पर सेट करें और 15 से 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान हर तीन से चार मिनट के बाद, सभी clumps को विघटित करने के लिए एक मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग करके निलंबन को सख्ती से टाइटरेट करें।
इनक्यूबेशन के अंत में, अंतिम बार सेल निलंबन को टाइटरेट करने के बाद, धीरे-धीरे 12 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में बर्फ ठंडा धोने का समाधान जोड़ें। चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और फिर सावधानीपूर्वक 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ supernatant को हटा दें। 700 से 1, 200 कोशिकाओं प्रति माइक्रोलीटर की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए धोने के समाधान में गोली को फिर से निलंबित करें।
शेष clumps या कैल्सीफाइड ऊतक के टुकड़ों को हटाने के लिए एक 50 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन पास और आगे प्रसंस्करण तक बर्फ पर ट्यूब रखें। फिर फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के लिए, कोशिकाओं को एक तैयार ट्यूब में लोड करें। सेल सॉर्टर में ट्यूब लोड करें और पाठ पांडुलिपि में वर्णित सेल मलबे, डबल्स और मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए एक सख्त गेटिंग रणनीति सेट करें।
सबसे पहले, CD45 एंटीबॉडी धुंधला और बाद के FACS विश्लेषण का उपयोग अंतिम एकल-सेल निलंबन में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या को स्पष्ट करने के लिए किया गया था। एक मानार्थ विधि के रूप में, एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण डेटा में CD45 सकारात्मक प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कुल संख्या का विश्लेषण किया गया था। FACS का उपयोग करते हुए, 14.44% CD45 सकारात्मक कोशिकाओं की पहचान की गई थी।
एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण डेटा के विश्लेषण से पता चला है कि CD45-व्यक्त कोशिकाओं का 10.9% और एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण डेटा में कोशिकाओं की कमी अनुक्रमण विश्लेषण के दौरान अतिरिक्त थ्रेशोल्डिंग के कारण हो सकती है। महत्वपूर्ण चीजें तेजी से हो रही हैं और जब भी संभव हो इस ऊतक या कोशिकाओं को बर्फ पर रख रही हैं। अलग-थलग कोशिकाओं की संख्या विशेष रूप से माउस दाढ़ अलगाव के दौरान बहुत कम हो सकती है।
सेल हानि से बचें। एकल-सेल अलगाव के समय को कम करना सभी एकल-सेल प्रयोगों की सफलता के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। और इस विशिष्ट विधि ने वास्तव में इस समय को कम करने और माउस और मानव प्रणालियों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले दंत कोशिका प्रकार के लिए मार्ग प्रशस्त करने की अनुमति दी।