調製された単一細胞懸濁液の品質は、任意の単一細胞オミクスの方法論のための高品質で信頼性の高い結果を得るために重要です。そして、このプロトコルは、非常に困難な組織から細胞を迅速かつ穏やかに、かつ堅牢に分離する方法を示します。このプロトコルの主な利点は、組織解離と完全な品質と短時間で多数のサンプルからの細胞の分離を可能にする合理化された組織処理です。
この方法はマウスやヒトの歯のために開発されましたが、軟骨、骨、または密結合組織を含む他の細胞外マトリックスが豊富な組織にも適用される可能性があります。歯髄をヒト、特にマウスの歯から分離する手順は、手動で困難です。実際の実験が始まる前にこれをテストすることをお勧めします。
まず、安楽死させたマウスを頭の後ろに持ち、尾が離れて指し出るように頭の腹側の側面を見てください。小さくて鋭いはさみを使用して、下顎骨のアーチ、下顎骨の各半分と隣接する顔の筋肉の間の軟部組織を露出させるために、すぐに下顎骨から皮膚を取り除きます。下顎骨の両側から深い切り口を作るために、まず下顎関節までの下顎側の頬側に沿ってマッセターを切り抜き、次に口腔の基部を通して下顎骨の各半分の内側に沿って切断する。
口腔の外側と内側の両方から顎関節まで下顎骨に沿ってすべての筋肉と靭帯を切断します。曲がった先端ピンセットを使用して下顎を握り、それを取り外します。その後、はさみで、下顎の共生を切り裂き、解剖された下顎骨を2つの半分に分割する。
工業用低糸口ワイプを使用して、下顎骨の各半分から残りの軟部組織を切り落とします。下顎の両方の部分を洗浄した後、氷冷HBSSで事前に準備されたペトリ皿に入れます。下顎切歯の解剖のために、3つの大臼歯すべてを有する歯槽尾根を取り除き、第1モルと第2モルの間の位置に対応する場所で下顎骨アーチを横方向に割る。
歯ソケットの残りの部分から慎重に切歯を引き出します。必要に応じて、ピンセットとメスで切歯に取り付けられた骨の残りの断片を除去します。解剖した切歯を新鮮な氷冷HBSSに入れる。
目的の組織を解剖した後、解剖した軟部組織を氷の上に保管された10センチメートルのペトリ皿の真ん中に新鮮な氷冷HBSSの液滴に入れます。丸い形の10個のメスの刃を使用して、組織を可能な限り小さな部分に切ります。液滴の中央に組織片を再凝集させた後、同じメスの刃で組織凝集体を繰り返し切断し、材料が十分にミンチされるまでこのプロセスを繰り返す。
1ミリリットルのピペットチップを使用して、細断された組織片を、以前に調製した消化混合物に移します。その後、チューブを60度の角度に置き、チューブ内の一定の懸濁液の動きを確保し、15〜20分間インキュベートするために150〜200RPMの速度を設定します。インキュベーション中に3〜4分ごとに、すべての塊を崩壊させるために1ミリリットルのピペットチップを使用して懸濁液を激しく刺激する。
インキュベーションの終わりに、最後の時間の細胞懸濁液を刺激した後、12ミリリットルの最終体積に氷冷洗浄液をゆっくりと加える。セル懸濁液を摂氏4度で5分間5分間Gの300倍にして、10ミリリットルの血清ピペットで上清を慎重に取り除きます。洗浄液中のペレットを再懸濁して、マイクロリットル当たり700~1,200細胞の最終濃度を達成する。
50マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を通過し、残りの塊または石灰化した組織の破片を取り除き、さらに処理されるまでチューブを氷の上に保ちます。次に、蛍光活性化細胞選別のために、細胞を調製されたチューブにロードします。細胞のソーターにチューブをロードし、テキスト原稿に記載されているように細胞の破片、ダブレット、および死んだ細胞を除去するための厳格なゲートリング戦略を設定します。
まず、CD45抗体染色とその後のFACS分析を用いて、最終的な単細胞懸濁液中の免疫細胞の数を明らかにした。無料の方法として、単細胞RNAシーケンシングデータにおけるCD45陽性免疫細胞の総数を分析した。FACSを用いて、14.44%CD45陽性細胞を同定した。
単一細胞RNAシーケンシングデータの分析は、CD45発現細胞の10.9%を示し、単細胞RNAシーケンシングデータにおける細胞の減少は、シーケンシング分析中の追加の閾値化によって引き起こされる可能性がある。重要なことは、速く、可能な限りこの組織や細胞を氷の上に保つことです。分離細胞の数は、特にマウスの臼歯の分離時に非常に少なくなる可能性があります。
細胞損失を避ける。単一細胞の分離の時間を短縮することは、すべての単一細胞実験の成功のために非常に重要です。そして、この特定の方法は本当にこの時間を減らし、マウスおよび人間のシステムのための高品質の歯科細胞タイプのための道を開くことを可能にした。
