준비된 단세포 서스펜션의 품질은 모든 단일 세포 오믹스 방법론에 대해 고품질의 신뢰할 수 있는 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 그리고이 프로토콜은 매우 어려운 조직에서도 세포를 빠르고 부드럽게, 강력하게 격리하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 완벽한 품질로 짧은 시간에 많은 수의 샘플에서 세포의 조직 해리 및 격리를 가능하게하는 간소화 된 조직 처리입니다.
이 방법은 마우스와 인간의 치아를 위해 개발되었지만 연골, 뼈 또는 조밀 한 결합 조직을 포함한 다른 세포 외 매트릭스가 풍부한 조직에도 적용될 수 있습니다. 인간과 특히 마우스 치아에서 치과 펄프를 분리하는 절차는 수동으로 도전적입니다. 우리는 실제 실험이 시작되기 전에 모든 사람에게 이것을 테스트하는 것이 좋습니다.
먼저, 머리 뒤에 안락사 된 마우스를 잡고 꼬리가 멀리 가리키도록 머리의 복부 측면을 바라보세요. 작고 날카로운 가위를 사용하여 하악에서 피부를 신속하게 제거하여 하악 아치, 하악골의 각 절반과 인접한 얼굴 근육 사이의 연조직을 노출시하십시오. 하악의 각 면에서 깊은 컷을 만들기 위해, 먼저 하악의 buccal 측면을 따라 매스터를 통해 템포로만디큘러 관절까지 잘라 다음 구강의 기초를 통해 하악의 각 절반의 내부 부분을 따라 잘라.
구강 의 외부와 내부에서 모든 근육과 인대를 구두 의 외부와 내부에서 템포로 만드세요 관절까지 하악을 따라 절단. 구부러진 팁 핀셋을 사용하여 하악을 잡고 제거하십시오. 그런 다음 가위와 함께 하악 심교를 잘라 해부 된 하악을 두 부분으로 나눕뜨게합니다.
산업용 낮은 보풀 닦기를 사용하여 하악의 각 절반에서 나머지 연조직을 차게하십시오. 하악의 두 부분을 모두 청소한 후, 미리 준비된 페트리 요리에 얼음 차가운 HBSS를 넣습니다. 하악 절개 의 해부를 위해, 세 개의 어금니로 폐포 능선을 제거하고 제 1 과 제 2 어어 사이의 위치에 해당하는 장소에서 하악 아치를 횡적으로 균열.
조심스럽게 치과 소켓의 나머지 부분에서 절개를 당겨. 필요한 경우 핀셋과 메스로 절개에 부착된 뼈의 나머지 조각을 제거합니다. 해부된 절개를 신선한 얼음 차가운 HBSS에 넣습니다.
관심 있는 조직을 해부한 후, 해부된 연조직을 얼음 위에 보관한 10센티미터 페트리 접시 한가운데 신선한 얼음 차가운 HBSS 한방울에 넣습니다. 둥근 모양의 숫자 10 메스 블레이드를 사용하여 조직을 가능한 가장 작은 조각으로 자른다. 물방울 의 중간에 조직 조각을 다시 집계 한 후, 반복적으로 동일한 메스 블레이드조직 골재를 잘라 재료가 충분히 다진 때까지이 과정을 반복합니다.
잘게 썬 조직 조각을 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 이전에 준비된 소화 혼합물로 옮킨다. 그런 다음 튜브를 60도 각도로 배치하고 속도를 150 ~200 RPM으로 설정하여 튜브 내부의 일정한 서스펜션 움직임을 보장하고 15~20분 동안 배양합니다. 인큐베이션 중 3~4분마다 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 서스펜션을 적극적으로 적어 모든 덩어리를 분해합니다.
인큐베이션이 끝나면, 마지막으로 셀 서스펜션을 적신 후, 12밀리리터의 최종 부피에 얼음 냉세척 용액을 천천히 첨가한다. 섭씨 4도에서 5분간 300회 G로 셀 서스펜션을 원심분리한 다음 10밀리리터 세로지컬 파이펫으로 상퍼를 조심스럽게 제거합니다. 세척 용액에서 펠릿을 다시 중단하여 마이크로리터 당 700 에서 1, 200 세포의 최종 농도를 달성합니다.
50 마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 통과하여 석회화 된 조직의 나머지 덩어리 또는 조각을 제거하고 추가 처리가 될 때까지 튜브를 얼음에 유지합니다. 그런 다음 형광 활성 세포 분류를 위해 세포를 준비된 튜브에 적재하십시오. 튜브를 셀 선별기로 로드하고 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 세포 이물질, 이중 및 죽은 세포를 제거하기 위한 엄격한 게이팅 전략을 설정합니다.
먼저, CD45 항체 염색 및 후속 FACS 분석은 최종 단세포 현탁액에서 면역 세포의 수를 명확히 하기 위해 사용되었다. 무료 방법으로서, 단일 세포 RNA 염기서열 분석 데이터에서 총 CD45 양성 면역 세포를 분석하였다. FACS를 사용하여 14.44%의 CD45 양성 세포가 확인되었다.
단세포 RNA 염기서열 분석 결과 CD45 발현 세포의 10.9%와 단세포 RNA 염기서열 분석 데이터에서 세포의 감소는 시퀀싱 분석 중에 추가 임계값에 의해 발생할 수 있음을 보여주었다. 중요한 것은 빨리 되고 가능하면 얼음에 이 조직 또는 세포를 지키고 있습니다. 격리된 세포의 수는 특히 마우스 어금니 격리 중에 매우 낮을 수 있습니다.
세포 손실을 피하십시오. 단일 세포 격리 의 시간을 줄이는 것은 모든 단세포 실험의 성공을 위해 매우 중요합니다. 그리고 이 특정 방법은 정말이 시간을 줄이고 마우스와 인간 시스템에 대한 고품질 치과 세포 유형에 대한 길을 포장 할 수 있었습니다.
