Kvaliteten på forberedt encellet suspensjon er avgjørende for å oppnå høy kvalitet og pålitelige resultater for enhver encellet omics-metodikk. Og denne protokollen vil vise deg hvordan du isolerer celler raskt, forsiktig og robust fra selv svært utfordrende vev. Den største fordelen med denne protokollen er strømlinjeformet vevsbehandling som muliggjør vevsdissosiasjon og isolering av celler fra et stort antall prøver på kort tid med perfekt kvalitet.
Selv om denne metoden ble utviklet for mus og menneskelige tenner, kan den også brukes til andre ekstracellulære matriserike vev, inkludert brusk, bein eller tett bindevev. Prosedyren for å isolere tannmasser fra menneskelige og spesielt musetenner er manuelt utfordrende. Vi anbefaler alle å teste dette før de virkelige eksperimentene begynner.
Til å begynne med, hold den euthanized musen bak hodet og se på det ventrale aspektet av hodet slik at halen peker bort. Bruk den lille og skarpe saksen, fjern raskt huden fra mandibelen for å eksponere mandibulærbuen, det myke vevet mellom hver halvdel av mandiblene og de tilstøtende ansiktsmusklene. For å lage et dypt kutt fra hver side av mandibelen, klipp først gjennom massøren langs bukkal side av mandibelen opp til det temporomandibulære leddet og kutt deretter langs den indre delen av den mandible gjennom bunnen av munnhulen.
Klipp alle muskler og leddbånd langs mandibelen opp til temporomandibulærleddet fra både utsiden og innsiden av munnhulen. Ta tak i mandibelen ved hjelp av den bøyde spissen pinsett og fjern den. Deretter med saksen, kutt gjennom mandibulær symphysis for å dele den dissekerte mandibelen i to halvdeler.
Bruk en industriell lav loserviett for å gnage det gjenværende bløtvevet fra hver halvdel av mandibelen. Etter at begge delene av mandibelen er rengjort, legg dem i en ferdiglaget Petri-tallerken med iskald HBSS. For disseksjon av mandibulære snitt, fjern alveolarryggen med alle tre molarene og sprekk den mandibulære buen på stedet som tilsvarer posisjonen mellom første og andre molar.
Trekk snittet forsiktig ut av resten av tannkontakten. Fjern om nødvendig de resterende fragmentene av bein festet til snittet med pinsett og en skalpell. Plasser de dissekerte snittene i frisk iskald HBSS.
Etter å ha dissekert vevet av interesse, plasser det dissekerte bløtvevet i en dråpe fersk iskald HBSS midt i en 10 centimeter Petri-tallerken holdt på is. Bruk et rundformet nummer 10 skalpellblad, kutt vevet i minst mulig stykker. Etter å ha aggregert vevsstykkene i midten av dråpen, klipp vevets aggregater gjentatte ganger med samme skalpellblad og gjenta denne prosessen til materialet er tilstrekkelig hakket.
Overfør de ristede vevsstykkene ved hjelp av en en milliliter pipettespiss til en tidligere forberedt fordøyelsesblanding. Plasser deretter røret i en vinkel på 60 grader og sett hastigheten til 150 til 200 RPM for å sikre konstante fjæringsbevegelser inne i røret og inkubere i 15 til 20 minutter. Etter hvert tredje til fjerde minutt under inkubasjon, titrer suspensjonen kraftig ved hjelp av en milliliter pipettespiss for å oppløse alle klumpene.
På slutten av inkubasjonen, etter titrering av cellefjæringen for siste gang, legg sakte til iskald vaskeløsning til et sluttvolum på 12 milliliter. Sentrifuger cellefjæringen ved 300 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og fjern deretter supernatanten forsiktig med en 10 milliliter serologisk pipette. Resuspend pellet i vaskeoppløsningen for å oppnå den endelige konsentrasjonen på 700 til 1200 celler per mikroliter.
Før celleopphenget gjennom en 50 mikrometer cellesil for å fjerne de resterende klumpene eller delene av forkalket vev og hold røret på is til videre behandling. Deretter laster du cellene inn i et forberedt rør for fluorescerende aktivert cellesortering. Last røret inn i cellesorteringen og sett en streng gatingstrategi for å fjerne cellerester, dobler og døde celler som beskrevet i tekstmanuskriptet.
For det første ble CD45 antistofffarging og påfølgende FACS-analyse brukt til å avklare antall immunceller i den endelige encellede suspensjonen. Som en gratis metode ble det totale antallet CD45 positive immunceller i enkeltcellet RNA-sekvenseringsdata analysert. Ved hjelp av FACS ble 14,44 %CD45 positive celler identifisert.
Analyse av enkeltcellede RNA-sekvenseringsdata viste at 10,9 % av CD45-uttrykkende celler og reduksjonen av celler i enkeltcellede RNA-sekvenseringsdata kan skyldes ytterligere terskler under sekvenseringsanalyse. De viktigste tingene er å være rask og holde dette vevet eller cellene på is når det er mulig. Antall isolerte celler kan være svært lavt, spesielt under musmolarisolasjon.
Unngå celletap. Å redusere tiden for encellet isolasjon er svært viktig for suksessen til alle enkeltcelleeksperimenter. Og denne spesifikke metoden tillot virkelig å redusere denne tiden og bane vei for høykvalitets tanncelletype for mus og menneskelige systemer.