A qualidade da suspensão unicelular preparada é crucial para obter resultados de alta qualidade e confiáveis para qualquer metodologia de omics unicelular. E este protocolo mostrará como isolar as células de forma rápida, suave e robusta de tecidos até mesmo muito desafiadores. A principal vantagem deste protocolo é o processamento simplificado de tecidos que permite a dissociação tecidual e o isolamento das células de um grande número de amostras em um curto espaço de tempo com perfeita qualidade.
Embora este método tenha sido desenvolvido para dentes de camundongos e humanos, também pode ser aplicado para outros tecidos extracelulares ricos em matriz, incluindo cartilagem, osso ou tecido conjuntivo denso. O procedimento de isolar polpas dentárias de dentes humanos e especialmente de camundongos é manualmente desafiador. Aconselhamos a todos que testem isso antes que os experimentos de verdade comecem.
Para começar, segure o rato eutanizado atrás de sua cabeça olhando para o aspecto ventral de sua cabeça para que a cauda se destaque. Usando a tesoura pequena e afiada, remova rapidamente a pele da mandíbula para expor o arco mandibular, o tecido mole entre cada metade das mandíbulas e os músculos faciais adjacentes. Para fazer um corte profundo de cada lado da mandíbula, primeiro corte através do masseter ao longo do lado bucal da mandíbula até a articulação temporomandibular e, em seguida, corte ao longo da parte interna de cada metade da mandíbula através da base da cavidade oral.
Corte todos os músculos e ligamentos ao longo da mandíbula até a articulação temporomandibular tanto de fora quanto dentro da cavidade oral. Segure a mandíbula usando a pinça de ponta dobrada e remova-a. Em seguida, com a tesoura, corte através da profífisis mandibular para dividir a mandíbula dissecada em duas metades.
Use uma limpeza industrial de fiapos baixos para chafe o tecido mole restante de cada metade da mandíbula. Depois que ambas as partes da mandíbula forem limpas, coloque-as em uma placa de Petri pré-preparada com HBSS gelado. Para a dissecção de incisivos mandibulares, remova a crista alveolar com os três molares e quebre transversamente o arco mandibular no local correspondente à posição entre o primeiro e o segundo molar.
Puxe cuidadosamente o incisivo para fora do resto da tomada dentária. Se necessário, remova os fragmentos restantes de osso presos ao incisivo com pinças e um bisturi. Coloque os incisivos dissecados em HBSS frios frescos.
Depois de dissecar o tecido de interesse, coloque o tecido mole dissecado em uma gota de HBSS gelado fresco no meio de uma placa de Petri de 10 centímetros mantida no gelo. Usando uma lâmina de bisturi em forma redonda 10, corte o tecido nos menores pedaços possíveis. Depois de reagregar os pedaços de tecido no meio da gotícula, corte repetidamente os agregados teciduais com a mesma lâmina de bisturi e repita esse processo até que o material seja suficientemente picado.
Transfira as peças de tecido desfiado usando uma ponta de pipeta de um mililitro em uma mistura de digestão previamente preparada. Em seguida, coloque o tubo em um ângulo de 60 graus e defina a velocidade para 150 a 200 RPM para garantir movimentos constantes de suspensão dentro do tubo e incubar por 15 a 20 minutos. Após cada três a quatro minutos durante a incubação, titula vigorosamente a suspensão usando uma ponta de pipeta de um mililitro para desintegrar todos os aglomerados.
No final da incubação, depois de titular a suspensão celular pela última vez, adicione lentamente a solução de lavagem gelada a um volume final de 12 mililitros. Centrifugar a suspensão celular a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, remova cuidadosamente o supernasce com uma pipeta sorológica de 10 mililitros. Resuspenja a pelota na solução de lavagem para alcançar a concentração final de 700 a 1.200 células por microliter.
Passe a suspensão celular através de um coador de células de 50 micrômetros para remover os aglomerados ou pedaços restantes de tecido calcificado e manter o tubo no gelo até um processamento adicional. Em seguida, para a classificação celular fluorescente ativada, carregue as células em um tubo preparado. Carregue o tubo no classificador celular e configure uma estratégia de gating rigorosa para remover detritos celulares, dobras e células mortas, conforme descrito no manuscrito do texto.
Primeiro, a coloração de anticorpos CD45 e a análise subsequente do FACS foram utilizadas para esclarecer o número de células imunes na suspensão única final. Como método complementar, analisou-se o número total de células imunes positivas cd45 nos dados de sequenciamento de RNA unicelulares. Utilizando FACS, foram identificadas células positivas 14,44%CD45.
A análise dos dados de sequenciamento de RNA unicelulares mostrou que 10,9% das células expressas por CD45 e a diminuição das células em dados de sequenciamento de RNA unicelulares poderia ser causada por limiares adicionais durante a análise de sequenciamento. As coisas-chave são ser rápidos e manter este tecido ou células no gelo sempre que possível. O número de células isoladas pode ser muito baixo especialmente durante o isolamento molar do rato.
Evite a perda de celular. Reduzir o tempo de isolamento unicelular é muito importante para o sucesso de todos os experimentos unicelulares. E este método específico realmente permitiu reduzir esse tempo e abrir caminho para o tipo de células odontológicas de alta qualidade para sistemas de camundongos e humanos.
