A indução de derivados de somite de células-tronco pluripotentes induzidas, ou iPSC, é um passo crítico para o uso de células-tronco pluripotentes para aplicações de terapia regenerativa ou pesquisa de doenças. Esta técnica pode ser usada para diferenciar células iPS humanas em derivados de somite, como myotome, dermatome, esclerotome e células de sintetoma em condições quimicamente definidas. Utilizando iPSC estabelecido a partir de um paciente que sofre de um distúrbio musculoesquelético intratável, este método pode ser usado para modelar o fenótipo da doença e para testar as novas terapias medicamentosas.
Este método também pode ser aplicado para promover nossa compreensão da biologia e dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do mesoderme paraxial durante a embriogênese humana. Quatro dias antes de iniciar a indução de mesoderme presomótico, cubra um prato de 10 centímetros com quatro mililitros de solução de matriz extracelular para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, substitua a solução de matriz extracelular por oito mililitros de meio de cultura celular livre de alimentadores.
Para começar a cultivar sem alimentador, lave a cultura humana iPSC com PBS, e adicione um mililitro de solução CTK ao prato de cultura. Quando as células começarem a se desprender do fundo do prato, lave a cultura duas vezes com PBS fresco para remover totalmente todas as células alimentadoras SNL antes de adicionar um mililitro de meio de cultura celular livre de alimentador ao prato. Use um raspador de células para desprender manualmente as células-tronco e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros.
Pipete suavemente a solução celular três vezes com uma ponta de pipeta de 1.000 microliter, e transfira as células para o prato de cultura extracelular revestido de matriz. Em seguida, devolva as células à incubadora de cultura celular por três dias. Ao final da incubação, substitua o meio de cultura celular livre de alimentador por oito mililitros de meio de indução de mesoderme presomótico, e inicie a diferenciação de mesoderme pré-médico na incubadora de cultura celular pelos próximos quatro dias, mudando o meio no terceiro dia.
No final da incubação, isole a proteína delta 1 células positivas por citometria de fluxo, e colete as células classificadas por centrifugação. Resuspend a pelota em um mililitro de meio de indução de mesoderme somitic para contar, e sementes uma vez 10 a quinta células em cada poço de uma placa de 12 poços revestido de matriz extracelular contendo um mililitro de meio de indução de mesoderme somitic complementado com 10 micromolar da rho quinase, ou ROCK, inibidor Y-27632. Em seguida, devolva as células à incubadora de cultura celular por mais quatro dias, mudando o meio não contendo o inibidor nos dias um e três da cultura.
Para diferenciação de sclerotome das células esclerotomes, lave as células esclerotomes com PBS antes de destacar as células com 0,2 mililitros de reagente de dissociação celular por poço. Após três minutos em temperatura ambiente, adicione 0,8 mililitros de meio basal quimicamente definido para cada poço, e desprende as células com um raspador de células. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação, e resuspenque a pelota em um mililitro de indução de syndetome para contar.
Semente cinco vezes 10 para a quarta células em cada poço de uma placa de 24 poços revestido de matriz extracelular contendo um mililitro de indução de syndetome, e retornar a placa à incubadora de cultura celular por três dias. No terceiro dia de indução de syndetome, substitua o meio por indução de syndetome dois, e devolva a placa à incubadora por 18 dias, alterando o meio a cada três dias. Após a diferenciação do mesoderme presomótico, mais de 85% das células são positivas para a proteína delta 1, um marcador de mesoderme presomótico, mas negativo para PAX3, um marcador de mesoderme somítico.
Esta população torna-se pax3 células de mesoderme somitic positivo após quatro dias de indução de mesoderme somítico. Além disso, a coloração da cadherina-11, um marcador de mesoderme somitico epitelializado, só se acumula nas junções célula-célula, após a adição de CHIR99021. A diferenciação para dermomyotome, miotome, dermatome, esclerotome e síndico pode ser avaliada por imunocitoquímica e fluorescência PAX3.
Semelhante aos fibroblastos dérmicos humanos, as células dermatome derivadas do iPSC produzem colágeno e ácido hialurônico, conforme avaliado pela ELISA. Para demonstrar a reatividade comparável do sintetme derivado do iPSC humano e dos tenócitos adultos humanos, um ensaio de estimulação de estiramento mecânico pode ser realizado. Antes da passagem do IPSC, confirme que a confluência de cultura está entre 70 e 80% e as células divididas na proporção de um para dois para um para quatro em conformidade.
Essa passagem é fundamental para a diferenciação bem sucedida dos iPSCs. Para futuras terapias baseadas em células que utilizam este método, é necessário estabelecer uma nova condição livre de germes que não inclua nenhum componente derivado de animais não humanos.
