Kvaliteten på förberedd encellig suspension är avgörande för att uppnå högkvalitativa och tillförlitliga resultat för alla encelliga omikmetodik. Och detta protokoll kommer att visa dig hur du isolerar celler snabbt, försiktigt och robust från även mycket utmanande vävnader. Den största fördelen med detta protokoll är den strömlinjeformade vävnadsbehandlingen som möjliggör vävnadssociation och isolering av celler från ett stort antal prover på kort tid med perfekt kvalitet.
Även om denna metod utvecklades för mus och mänskliga tänder, kan det också tillämpas för andra extracellulära matrisrika vävnader, inklusive brosk, ben eller tät bindväv. Förfarandet för att isolera tandmassa från mänskliga och särskilt muständer är manuellt utmanande. Vi råder alla att testa detta innan de verkliga experimenten börjar.
Till att börja med, håll den avlivade musen bakom huvudet och titta på den ventrala aspekten av huvudet så att svansen pekar bort. Använd den lilla och skarpa saxen, ta snabbt bort huden från underkäken för att exponera mandibularbågen, mjukvävnaden mellan varje halva av mandiblesna och de intilliggande ansiktsmusklerna. För att göra ett djupt snitt från varje sida av underkäken, skär först genom massören längs den buccal sidan av underkäken upp till den temporomandibulära leden och skär sedan längs den inre delen av varje halva av underkäken genom basen av munhålan.
Skär alla muskler och ligament längs underkäken upp till temporomandibular gemensamma från både utsidan och insidan av munhålan. Ta tag i underkäken med de böjda spetstettarna och ta bort den. Sedan med saxen, skär genom mandibular symphysis för att dela den dissekerade underkäken i två halvor.
Använd en industriell våtservett för att skava den återstående mjukvävnaden från varje halva av underkäken. När båda delarna av underkäken har rengjorts, placera dem i en förberedd Petri-skål med iskall HBSS. För dissekering av mandibular framtänder, ta bort alveolar åsen med alla tre molars och tvärgående knäcka mandibularbågen på den plats som motsvarar positionen mellan den första och andra molaren.
Dra försiktigt ut snedsatsen ur resten av tandhålan. Vid behov, ta bort de återstående benfragmenten som är fästa vid snedsatsen med pincett och en skalpell. Placera de dissekerade snedställningarna i färska iskalla HBSS.
Efter dissekering av vävnaden av intresse, placera den dissekerade mjukvävnaden i en droppe färsk iskall HBSS i mitten av en 10 centimeter Petriskål som hålls på is. Skär vävnaden i minsta möjliga bitar med hjälp av ett rundat format nummer 10 skalpellblad. Efter att ha aggregerat vävnadsbitarna i mitten av droppen, skär upprepade gånger vävnadsaggregaten med samma skalpellblad och upprepa denna process tills materialet är tillräckligt malet.
Överför de strimlade vävnadsbitarna med en en milliliter pipettspets till en tidigare förberedd matsmältningsblandning. Placera sedan röret i en vinkel på 60 grader och ställ in hastigheten på 150 till 200 RPM för att säkerställa konstanta fjädringsrörelser inuti röret och inkubera i 15 till 20 minuter. Efter var tredje till fjärde minut under inkubation titrerar du suspensionen kraftigt med en en milliliter pipettspets för att sönderdela alla klumpar.
I slutet av inkubationen, efter titrering av cellfjädringen för sista gången, tillsätt långsamt iskall tvättlösning till en slutlig volym på 12 milliliter. Centrifugera cellfjädringen vid 300 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius och ta sedan försiktigt bort supernatanten med en 10 ml serologisk pipett. Återanvänd pelleten i tvättlösningen för att uppnå den slutliga koncentrationen av 700 till 1 200 celler per mikroliter.
Passera cellupphängningen genom en 50 mikrometer cellsil för att avlägsna de återstående klumparna eller bitarna av förkalkad vävnad och hålla röret på is tills vidare bearbetning. Ladda sedan cellerna i ett förberett rör för fluorescerande aktiverad cellsortering. Ladda röret i cellsorteraren och sätt en strikt gatingstrategi för att ta bort cellrester, dubbletter och döda celler enligt beskrivningen i textmanuskriptet.
För det första användes CD45 antikroppsfärgning och efterföljande FACS-analys för att klargöra antalet immunceller i den slutliga encelliga suspensionen. Som en gratis metod analyserades det totala antalet CD45 positiva immunceller i encelliga RNA-sekvenseringsdata. Med hjälp av FACS identifierades 14,44%CD45 positiva celler.
Analys av encelliga RNA-sekvenseringsdata visade 10,9% av CD45-uttryckande celler och minskningen av celler i encelliga RNA-sekvenseringsdata kan orsakas av ytterligare tröskel under sekvenseringsanalys. De viktigaste sakerna är att vara snabb och hålla denna vävnad eller celler på is när det är möjligt. Antalet isolerade celler kan vara mycket lågt, särskilt under mus molar isolering.
Undvik cellförlust. Att minska tiden för encellsisolering är mycket viktigt för att alla encellsexperiment ska lyckas. Och denna specifika metod gjorde det verkligen möjligt att minska denna tid och bana väg för högkvalitativ tandcellstyp för mus och mänskliga system.