Name: assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

يتم دعم العمل في مختبر لومبارد من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIGMS R01GM101171 و NIEHS R21ES032305) ووزارة الدفاع (CA190267 و CA170628 و NF170044 و ME200030) ومؤسسة غلين للبحوث الطبية. يتم دعم العمل في مختبر Li من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NHLBI 5R01HL150707).

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الفقارية وتنفيذها وفقا للوائح لجنة جامعة ميشيغان المعنية باستخدام الحيوانات ورعايتها.
1. قبل يوم من الفحص (الوقت الإجمالي: ~ 10 دقائق)
<ol><li>ترطيب خرطوشة المستشعر (وقت الخطوة: ~ 10 دقائق)<ol>
<li>افتح مجموعة مقايسة التدفق خارج الخلية وقم ب...

<ol>
	<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis.">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+(HSPCs).">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li><li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging.">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells.">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux.">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li><li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells:+new+perspectives+and+opportunities.">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li><li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases.">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).</li><li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent:+mechanism+of+cell+death.">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li></ol>

تصف ورقة الطريقة هذه بروتوكولا محسنا لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية (تحلل السكر و OxPHOS) في HSPCs للفأر باستخدام محلل التدفق خارج الخلية Seahorse. هذا الجهاز هو أداة قوية تقيس في وقت واحد ECAR و OCR للخلايا الحية ، والتي هي مقاييس تحلل السكر وتنفس الميتوكوندريا ، على التوالي. وبالتالي ، يمكن استخدامه لت...

تكون الدم هو العملية التي يتم من خلالها تشكيل أنواع مختلفة من خلايا الدم الناضجة ذات الوظائف المتخصصة للغاية من HSCs1. HSCs قادرة على التجديد الذاتي والتمايز في مختلف مجموعات السلف متعددة القدرات والخاصة بالنسب. ينتج هؤلاء الأسلاف في نهاية المطاف خلايا من سلالات اللمفاوية والنخاعية والإريثرويد والخلايا النوية الضخمة. للحفاظ على قدرتها على التجديد الذاتي ، تظل HSCs هادئة إلى حد كبير ، ومثل الخلايا الجذعية الأخرى للأنسجة ، يعتقد أنها تعتمد على تحلل السكر بدلا من الميتوكوندريا OxPHOS لإنتاج ATP 2,3. يؤدي الدخول إلى دورة الخلية إلى تعزيز التنفس و OxPHOS ، مما يؤدي إلى مستويات مرتفعة من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والتي تضر بصيانة HSC ووظيفتها3. وبالتالي ، قد يؤدي الانقسام المتكرر للخلايا إلى انخفاض قدرة التجديد الذاتي ل HSCs وفي النهاية إلى استنفادها.
في تكون الدم لدى البالغين ، تخضع HSCs في المقام الأول لانقسام الخلايا غير المتماثل ، حيث تحتفظ إحدى الخلايا الابنة بإمكانات HSC وتستمر في الاعتماد على التمثيل الغذائي السكري. تصبح الخلية الابنة الأخرى خلية سلف بدائية تفقد قدرتها على التجديد الذاتي ولكنها تتكاثر وتؤدي في النهاية إلى خلايا مكونة للدم وظيفية متباينة4. عندما تتمايز HSCs لإنتاج أسلاف في اتجاه المصب ، يعتقد أن التحول من تحلل السكر إلى استقلاب الميتوكوندريا يحدث لتوفير الطاقة واللبنات الأساسية اللازمة لدعم هذا الانتقال السريع5 ، كما هو مقترح من الملاحظات التي تفيد بأن HSCs تمتلك كتلة ميتوكوندريا غير نشطة 6,7,8,9 . في المقابل ، فإن نشاط الميتوكوندريا (المشار إليه بمستويات ROS المرتبطة) أعلى بكثير في الأسلاف الملتزمين بالنسب منه في HSCs9،10،11. وبالتالي فإن التغيرات الأيضية التي تحدث خلال الخطوة الأولى من تكون الدم تشير إلى دور مباشر وحاسم للميتوكوندريا في تنظيم مصير HSC.
الميتوكوندريا المختلة وظيفيا الموجودة في ظل ظروف الإجهاد المختلفة ، مثل الشيخوخة والسرطان والسكري والسمنة 12 ، يمكن أن تتداخل مع قدرة التجديد الذاتي HSC ، مما يؤدي إلى اختلال التوازن في تمايز HSC / السلف عن طريق إنتاج كميات زائدة من ROS ، وإضعاف إنتاج ATP ، و / أو عن طريق تغيير عمليات التمثيل الغذائي الأخرى9,12,13 . يمكن أن تؤثر الاضطرابات في التوازن الأيضي في تمايز HSC / السلف بشكل كبير على تكون الدم ، مما قد يساهم في تطور تشوهات الدم13. بالنظر إلى التأثيرات الحرجة لتحلل السكر والميتوكوندريا OxPHOS على جذع HSC والتمايز ، فمن المهم التحقيق في كل من المعلمات الأيضية في ظل الظروف العادية والإجهاد. يمكن الحصول على رؤى قيمة حول وظيفة تحلل السكر والميتوكوندريا ل HSCs والخلايا السلفية من خلال تقييم ECAR و OCR ، وهما مؤشران على تحلل السكر الخلوي وتنفس الميتوكوندريا ، على التوالي.
محلل التدفق خارج الخلية من فرس البحر هو جهاز قوي مجهز بمسبارين لكل بئر لقياس ECAR و OCR في وقت واحد في الخلايا الحية ، وبالتالي يمكن استخدامه لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الوقت الفعلي ، استجابة لمختلف الركائز أو المثبطات. تحتوي خرطوشة الفحص المستخدمة مع المحلل على منافذ حقن لاستيعاب ما يصل إلى أربعة أدوية للحقن الآلي أثناء الفحص. يظهر مخطط لاختبار إجهاد تحلل السكر النموذجي في الشكل 1A. يبدأ الفحص بقياس ECAR للخلايا ، المحتضنة في وسط اختبار إجهاد تحلل السكر الذي يحتوي على الجلوتامين ولكن ليس الجلوكوز أو البيروفات. هذا يمثل التحمض الذي يحدث بسبب الأنشطة غير المحللة للسكر للخلايا ويتم الإبلاغ عنه على أنه تحمض غير جليكوليتيك. ويتبع ذلك حقن الجلوكوز بتركيز مشبع. عن طريق تحلل السكر ، يتم تحويل الجلوكوز في الخلية إلى بيروفات ، والتي يتم استقلابها بشكل أكبر في السيتوبلازم لإنتاج اللاكتات ، أو في الميتوكوندريا لإنتاج ثاني أكسيد الكربون2 والماء.
يؤدي تحويل الجلوكوز إلى اللاكتات إلى إنتاج صاف وإطلاق لاحق للبروتونات في الوسط خارج الخلية ، مما يؤدي إلى زيادة سريعة في ECAR14,15,16. تم الإبلاغ عن هذا التغيير الذي يحفز الجلوكوز في ECAR على أنه تحلل السكر في ظل الظروف القاعدية. تتكون الحقنة الثانية من oligomycin (مثبط ل ATP synthase ، المعروف أيضا باسم مجمع V17) ، والذي يمنع إنتاج ATP الميتوكوندريا. أثناء تثبيط OxPHOS بوساطة الأوليغومايسين ، تقوم الخلايا بتنظيم تحلل السكر إلى أقصى حد لتلبية متطلباتها النشطة. هذا يسبب زيادة أخرى في ECAR ، مما يكشف عن الحد الأقصى لقدرة تحلل السكر للخلايا. يشار إلى الفرق بين الحد الأقصى لقدرة تحلل السكر وانحلال السكر القاعدي باسم احتياطي تحلل السكر. أخيرا ، يتم حقن 2-DG ، مما يسبب انخفاضا كبيرا في ECAR ، وعادة ما يكون قريبا من مستويات التحمض غير المحلل. 2-DG هو تناظرية الجلوكوز التي ترتبط بشكل تنافسي إلى هيكسوكيناز ، مما يؤدي إلى تثبيط تحلل السكر18. وبالتالي ، فإن الانخفاض الناجم عن 2-DG في ECAR يؤكد أيضا أن تحلل السكر هو في الواقع مصدر ECAR الذي لوحظ بعد حقن الجلوكوز و oligomycin.
يعرض الشكل 1B المخطط لاختبار إجهاد الميتوكوندريا النموذجي. يبدأ الفحص بقياس OCR الأساسي للخلايا ، المحتضنة في وسط اختبار إجهاد الميتوكوندريا الذي يحتوي على الجلوكوز والجلوتامين والبيروفات. بعد قياسات التعرف الضوئي على الحروف القاعدية، يتم حقن الأوليغوميسين في هذا الفحص، الذي يمنع V المعقد، وبالتالي يقلل من تدفق الإلكترون عبر سلسلة نقل الإلكترون (ETC)17. وبالتالي ، يتم تقليل OCR استجابة لحقن oligomycin ، ويرتبط هذا الانخفاض في OCR بإنتاج ATP الميتوكوندريا. يتكون الحقن الثاني من سيانيد الكربونيل -4 (ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) ، وهو بروتونوفور ومفكك من الميتوكوندريا OxPHOS17. ينهار FCCP تدرج بروتون الميتوكوندريا عن طريق السماح بتدفق البروتونات عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا. بسبب حقن FCCP ، يتم تقليل تدفق الإلكترون عبر ETC ، ويستهلك IV المعقد الأكسجين عند المستوى الأقصى. يشار إلى الفرق بين الحد الأقصى من التعرف الضوئي على الحروف والتعرف الضوئي على الحروف القاعدي باسم القدرة التنفسية الاحتياطية ، وهو مقياس لقدرة الخلية على الاستجابة لزيادة الطلب على الطاقة في ظل ظروف الإجهاد. أخيرا ، يتم حقن خليط من اثنين من مثبطات ETC (الروتينون ، مثبط I المعقد ، ومضاد المايسين A ، مثبط III المعقد17) ، مما يؤدي إلى إيقاف تدفق الإلكترون تماما ، وينخفض OCR إلى مستوى منخفض. OCR يقاس بعد الروتينون ومضاد المايسين يتوافق حقن A مع OCR غير الميتوكوندريا مدفوعة بعمليات أخرى داخل الخلايا. يتيح التعرف الضوئي على الحروف غير الميتوكوندريا حساب التنفس القاعدي وتسرب البروتون والتنفس الأقصى.
يمثل التنفس القاعدي الفرق بين OCR الأساسي و OCR غير الميتوكوندريا. يشير تسرب البروتون إلى الفرق بين التعرف الضوئي على الحروف بعد حقن الأوليغوميسين والتعرف الضوئي على الحروف غير الميتوكوندريا. يمثل التنفس الأقصى الفرق بين التعرف الضوئي على الحروف بعد حقن FCCP والتعرف الضوئي على الحروف غير الميتوكوندريا. يتم حساب كفاءة الاقتران كنسبة مئوية من معدل إنتاج ATP إلى معدل التنفس القاعدي. توفر ورقة الطريقة هذه بروتوكولا مفصلا لقياس ECAR و OCR في HSPCs سالبة النسب باستخدام محلل التدفق خارج الخلية Seahorse XFe96. يصف هذا البروتوكول أساليب عزل HSPCs السلبية لسلالة الفئران ، ويشرح تحسين كثافة بذر الخلايا وتركيزات الأدوية المختلفة المستخدمة في اختبارات التدفق خارج الخلية ، ويصف استراتيجيات العلاج من تعاطي المخدرات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430626</td>
			<td>Used to filter-sterilize the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>3rd drug injection during glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Enrichment buffer (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480017</td>
			<td>Used for washings during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A661-3</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>2nd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive. Used for coating cell microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O2793-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Used as cells strainer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26400044</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Used to wash cells after assay for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P235-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100103</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100243</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100603</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108403</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences now Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For ECAR and OCR measurments in real time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Prepared 1 N solution. Used for pH normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480015</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF prep station</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Used for non-CO2 37 &#176;C incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 extracellular FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100 or 102601-100</td>
			<td>Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading 
			drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer

في ظل الحالة المستقرة ، تظل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هادئة إلى حد كبير ويعتقد أنها تعتمد في الغالب على تحلل السكر لتلبية احتياجاتها النشطة. ومع ذلك ، في ظل ظروف الإجهاد مثل العدوى أو فقدان الدم ، تصبح HSCs تكاثرية وتنتج بسرعة خلايا السلف في المصب ، والتي بدورها تتمايز بشكل أكبر ، مما يؤدي في النهاية إلى إنتاج خلايا الدم الناضجة. خلال عملية الانتقال والتمايز هذه ، تخرج HSCs من السكون وتخضع بسرعة لتبديل التمثيل الغذائي من تحلل السكر إلى الفسفرة التأكسدية (OxPHOS). يمكن أن تؤثر ظروف الإجهاد المختلفة ، مثل الشيخوخة والسرطان والسكري والسمنة ، سلبا على وظيفة الميتوكوندريا ، وبالتالي يمكن أن تغير إعادة برمجة التمثيل الغذائي والتمايز بين HSCs والأسلاف أثناء تكون الدم. يمكن الحصول على رؤى قيمة حول وظائف تحلل السكر والميتوكوندريا ل HSCs والأسلاف في ظل الظروف العادية وظروف الإجهاد من خلال تقييم معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR) ، وهما مؤشران على تحلل السكر الخلوي وتنفس الميتوكوندريا ، على التوالي. 
هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل لقياس ECAR و OCR في مجموعات الخلايا السلبية المشتقة من نخاع عظم الفأر ، والتي تشمل كلا من الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية البدائية (HSPCs) ، باستخدام محلل التدفق خارج الخلية. يصف هذا البروتوكول أساليب عزل الخلايا السلبية النسب من نخاع عظام الفأر ، ويشرح تحسين كثافة بذر الخلايا وتركيزات 2-deoxy-D-glucose (2-DG ، وهو تناظري للجلوكوز يمنع تحلل السكر) والعديد من الأدوية التي تستهدف OxPHOS (oligomycin، FCCP، rotenone، وantimycin A) المستخدمة في هذه المقاييس، ويصف استراتيجيات العلاج من تعاطي المخدرات. يمكن قياس المعلمات الرئيسية للتدفق المحلل للسكر ، مثل تحلل السكر ، والقدرة على تحلل السكر ، واحتياطي تحلل السكر ، ومعلمات OxPHOS ، مثل التنفس القاعدي ، والتنفس الأقصى ، وتسرب البروتون ، وإنتاج ATP ، والقدرة التنفسية الاحتياطية ، وكفاءة الاقتران ، في هذه المقاييس. يسمح هذا البروتوكول بقياسات ECAR و OCR على HSPCs غير الملتصقة ويمكن تعميمه لتحسين ظروف التحليل لأي نوع من خلايا التعليق.

باستخدام هذا البروتوكول ، تم تحسين عدد الخلايا وتركيزات الأدوية المختلفة التي تستهدف OxPHOS (المستخدمة في اختبارات التدفق خارج الخلية) لقياس ECAR و OCR من HSPCs المعزولة من الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 24 أسبوعا. أولا ، تم إجراء اختبار إجهاد تحلل السكر لتحسين عدد الخلايا وتركيز oligomycin. تم استخدام ع?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

تلخص الطريقة المعروضة هنا البروتوكولات المحسنة لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الخلايا الجذعية المكونة للدم غير الملتصقة بالفئران والخلايا السلفية البدائية (HSPCs) باستخدام محلل التدفق خارج الخلية لقياس معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR) ل HSPCs في الوقت الفعلي.

تقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الخلايا الجذعية المكونة للدم للفأر والخلايا السلفية البدائية باستخدام محلل التدفق خارج الخلية

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

أثناء تكون الدم ، تخضع الخلايا الجذعية المكونة للدم لتحول استقلابي من تحلل السكر إلى الفسفرة التأكسدية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم وظائف تحلل السكر والميتوكوندريا للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الوقت الفعلي.توفر المنصة القائمة على الصفائح الدقيقة التي يبلغ عددها 96 بئرا تقديرا كميا عالي الإنتاجية مع حساسية عالية ، مما يسمح بالتحليل المتزامن لعينات متعددة باستخدام لوحة واحدة. يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في آثار المواد الكيميائية أو التلاعب الجيني على استقلاب HSC في ظل ظروف متنوعة. يمكن أن يساعد في توضيح المسارات الأيضية التي تحافظ على تعدد قدرات HSC.على الرغم من أن الدراسة الحالية تركز بشكل أساسي على السيقان المكونة للدم في الفئران والخلايا السلفية ، إلا أنه يمكن بسهولة تكييف البروتوكول وهذا النهج لتحسين ظروف التحليل لأي نوع من الخلايا المعلقة. قبل يوم واحد من الفحص ، افتح مجموعة فحص التدفق خارج الخلية لإزالة خرطوشة المستشعر وتجميع لوحة المرافق. احفظ شقق دليل التحميل لاستخدامها في اليوم التالي.الآن افصل خرطوشة المستشعر يدويا عن لوحة الأداة المساعدة وضعها رأسا على عقب بجوار لوحة الأداة المساعدة. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، املأ كل بئر من لوحة المرافق ب 200 ميكرولتر من العيار المضمن في مجموعة فحص التدفق ، ثم ضع خرطوشة المستشعر مرة أخرى على لوحة المرافق ، مع التأكد من غمر المستشعرات بالكامل في العيار. ثم احتضن لوحة المرافق بخرطوشة مستشعر معايرة ومجمعة في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها بعد ظروف الترطيب المذكورة في المخطوطة.في يوم الفحص ، قم بإعداد 2.5 ملليلتر من محلول لاصق الخلية لكل صفيحة صغيرة لزراعة الخلايا في 96 بئرا كما هو موضح في مخطوطة النص. افتح الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا المضمنة في مجموعة فحص التدفق وقم بتوزيع 25 ميكرولتر من محلول لاصق الخلية المحضر في قاع كل بئر. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة بالغطاء واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل الغطاء.بعد الحضانة ، قم بإزالة والتخلص من محلول لاصق الخلايا الزائد باستخدام ماصة متعددة القنوات أو شفاط واغسل كل بئر مرتين ب 200 ميكرولتر من الماء المعقم فائق النقاء. جفف اللوحة بالهواء بدون غطاء داخل الغطاء لمدة 30 إلى 45 دقيقة. جهاز الطرد المركزي لسلالة الفأر المعدة سلبية HSPCs عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.بعد التخلص من السوبرناتانت ، أعد تعليق بيليه الخلية في وسط الفحص المناسب ، ومرة أخرى الطرد المركزي لتعليق الخلية. كرر هذا الإجراء مرة أخرى وأعد تعليق الخلايا في وسط الفحص الدافئ المناسب بتركيز 250،000 خلية لكل 50 ميكرولتر أو خمسة ملايين خلية لكل ملليلتر. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولتر من تعليق الخلية على طول جانب كل بئر من الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا المغلفة بالمادة اللاصقة للخلية 96 بئرا ، ثم أضف 50 ميكرولتر من وسيط الفحص إلى آبار قياس خلفية الزاوية.قم بإنشاء لوحة توازن أجهزة الطرد المركزي عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الماء لكل بئر من صفيحة صغيرة غير مغلفة من 96 بئرا لزراعة الخلايا. الطرد المركزي للخلايا في 200 مرة G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. احتضان الصفيحة في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 25 إلى 30 دقيقة لمرفق الخلية.بعد 30 دقيقة ، تأكد بصريا تحت المجهر من أن الخلايا ملتصقة بثبات بسطح الصفيحة الدقيقة. ابدأ بإعداد جميع الحلول المطلوبة في وسيط فحص إجهاد تحلل السكر المسخن مسبقا كما هو مذكور في مخطوطة النص وقم بإزالة خرطوشة المستشعر المائي من الحاضنة. ارفع خرطوشة المستشعر من العيار واستبدلها على نفس لوحة الأداة بالمعايرة لإزالة فقاعات الهواء.ضع دليل التحميل 80 مسطحا في الجزء العلوي من خرطوشة المستشعر التي توجهها بحيث يكون الحرف A موجودا في الزاوية العلوية اليسرى. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتوزيع 20 ميكرولتر من محلول الجلوكوز 100 مللي مولا في المنفذ A.استبدل دليل التحميل 80 مسطحا بدليل تحميل BC مسطحا ، مع توجيه الحرف B في الزاوية العلوية اليسرى. قم بتوزيع 22 ميكرولتر من محلول أوليغوميسين ميكرومولار 20 ميكرومولار في المنفذ B.أعد توجيه دليل تحميل BC مسطحا لتحديد موقع الحرف C في الزاوية العلوية اليسرى لتحميل المنفذ C وقم بتوزيع 25 ميكرولتر من محلول 500 millimolar 2-deoxy-d-glucose في المنفذ C.ثم قم بإزالة وتجاهل مسطحات دليل التحميل.الآن قم بإنشاء أو تحميل القالب لاختبار إجهاد تحلل السكر على وحدة التحكم. أدخل التفاصيل المتعلقة باستراتيجيات الحقن وظروف العلاج وأنواع الخلايا، واضغط على إنشاء مجموعات. انتقل إلى خريطة اللوحة وقم بتعيين آبار لكل مجموعة ليتم تحليلها.في البروتوكول، تأكد من التحقق من المعايرة والتوازن في خطوة التهيئة. بالنسبة للقياس الأساسي والقياسات بعد كل حقنة ، اضبط عدد دورات القياس على ثلاث دورات واخلط وانتظر وقياس الأوقات إلى ثلاث دقائق وصفر دقائق وثلاث دقائق. انقر فوق بدء التشغيل على البرنامج.قم بإزالة الغطاء من خرطوشة المستشعر المحملة والمائية بالمركبات وضعها على درج العمل الخاص بمحلل التدفق خارج الخلية. ابدأ تشغيل المعايرة. أخرج الصفيحة الدقيقة التي تحتوي على الخلايا البذرية من الحاضنة.دون إزعاج الخلايا ، أضف ببطء 130 ميكرولتر من اختبار إجهاد تحلل السكر المسخن مسبقا متوسط لكل بئر لتكوين الحجم المتوسط في كل بئر إلى 180 ميكرولتر وإعادة اللوحة إلى الحاضنة لمدة 15 إلى 20 دقيقة إضافية. انقر فوق فتح الدرج على البرنامج لفتح الدرج الحراري لفرس البحر. بعد انتهاء المعايرة، استبدل لوحة الأداة المساعدة بلوحة الفحص الدقيقة هذه التي تحتوي على الخلايا واضغط على لوحة خلية التحميل لبدء القياسات.بعد انتهاء القياسات ، قم بإزالة وسيط الفحص من اللوحة دون إزعاج الخلايا واغسلها بلطف ب 250 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات دون إزاحة الخلايا. الآن أضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت لتحلل الترسيب المناعي الإشعاعي المكمل بكوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني 1X إلى كل بئر وحرك الطبق على شاكر لمدة 10 دقائق. قم بتجميد اللوحة بأكملها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.قم بإذابة اللوحة وقم بإجراء فحص قياس البروتين لتطبيع البيانات باتباع تعليمات الشركة المصنعة. استرجع البيانات وقم بتحليلها عن طريق فتح ملف البيانات باستخدام برنامج Wave لسطح المكتب. انقر فوق تطبيع ، والصق قيم التطبيع لكل بئر ثم انقر فوق تطبيق لتطبيع البيانات.انقر فوق تصدير وحدد مولد تقرير اختبار إجهاد تحلل السكر لتصدير البيانات التي تم تحليلها إلى مولد تقرير. يرتفع معدل التحمض غير المحلل للسكري مع زيادة عدد الخلايا من 50،000 إلى 250،000 ، ولكنه يزيد فقط بشكل ضئيل بين 200،000 إلى 250،000. حقن الجلوكوز 10 ملليمولار يحفز تحلل السكر في جميع أعداد الخلايا مع زيادة قصوى في ECAR لوحظ في 250،000 خلية لكل بئر.ومع ذلك ، فإن حقن اثنين من الميكرومولار من oligomycin لا يزيد من ECAR. تظهر بيانات التعرف الضوئي على الحروف التي تم الحصول عليها في نفس المجموعة من اختبارات إجهاد تحلل السكر انخفاضا كبيرا بعد حقن الأوليغوميسين بسبب تثبيط 5 المعقد. تم حساب معلمات اختبار إجهاد تحلل السكر وتم اختيار 250،000 خلية لكل بئر في اثنين من الميكرومولات من oligomycin لمزيد من الدراسات.أظهر اختبار إجهاد الميتوكوندريا أن حقنتين أوليغوميسين ميكرومولار تسببان انخفاضا كبيرا في التعرف الضوئي على الحروف عن طريق تثبيط المركب 5. يحفز FCCP التعرف الضوئي على الحروف في HSPCs بطريقة تعتمد على الجرعة مع زيادة قصوى لوحظت في اثنين من المولار الدقيقة. مزيج من 0.5 ميكرومولار روتينون و 0.5 ميكرومولار مضاد للمايسين حقن يقلل من التعرف الضوئي على الحروف إلى أدنى مستوى له يتوافق مع استهلاك الأكسجين غير الميتوكوندريا.تم حساب معلمات اختبار إجهاد الميتوكوندريا وتم اختيار اثنين من الميكرومولار من FCCP لمزيد من الدراسات. وبالنظر إلى طبيعة الإنتاجية العالية لهذه التقنية، يمكن بسهولة تكييف البروتوكول الموصوف هنا لفحص عدد كبير من المعدلات الحيوية في الخلايا الجذعية المكونة للدم، والأسلاف المكونة للدم، والخلايا المكونة للدم الخبيثة. يستخدم تحليل فرس البحر على نطاق واسع في الأدبيات لقياس التمثيل الغذائي في مجموعة واسعة من السياقات في وجود العديد من الركائز والمثبطات.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

العزلة وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

العزلة وتحليل الخلايا الجذعية المكونة للدم من المشيمة

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral بوساطة خلال ضربة قاضية السابقين فيفو تكون الكريات الحمر في الإنسان خلايا الجذعية المكونة للدم

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

تحليل الجريان خارج الخلية عزل وتوصيف وإنتاجية عالية للماوس الأساسي كلوي أنبوبي الخلايا الظهارية

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

قياس استقلاب الطاقة في اكسبلانتيد نسيج الشبكية باستخدام تحليل الجريان خارج الخلية

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...