Name: assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Arbejdet i Lombard-laboratoriet støttes af NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 og ME200030) og Glenn Foundation for Medical Research. Arbejdet i Li-laboratoriet understøttes af NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Alle forsøg med hvirveldyr blev godkendt af og udført i overensstemmelse med reglerne fra University of Michigan Committee on Use and Care of Animals.
1. Dag før analysen (Samlet tid: ~ 10 min)
<ol><li>Hydrering af sensorpatronen (Trintid: ~10 min)<ol>
<li>Åbn det ekstracellulære fluxanalysesæt, og fjern sensorpatronen og hjælpepladeenheden. Gem lastevejledningslejligheder til brug den næste dag.</li>
		<li>Adskil sensorpatronen manuelt (den øverste grønne del med låg) fra værkt?...

<ol>
	<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis.">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+(HSPCs).">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li><li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging.">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells.">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux.">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li><li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells:+new+perspectives+and+opportunities.">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li><li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases.">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).</li><li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent:+mechanism+of+cell+death.">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li></ol>

Dette metodepapir beskriver en optimeret protokol til vurdering af cellulær bioenergetik (glykolyse og OxPHOS) i mus HSPC'er ved hjælp af Seahorse ekstracellulære fluxanalysator. Denne enhed er et kraftfuldt værktøj, der samtidig måler ECAR og OCR af levende celler, som er målinger af henholdsvis glykolyse og mitokondriel respiration. Således kan den bruges til at vurdere den cellulære bioenergetik i realtid. Endvidere tilbyder den 96-brønds mikropladebaserede platform kvantificering med høj gennemstrømning m...

Hæmatopoiesis er den proces, hvorved forskellige typer modne blodlegemer med højt specialiserede funktioner dannes ud fra HSC'er1. HSC'er er i stand til selvfornyelse og differentiering i forskellige multipotente og slægtsspecifikke stamfaderpopulationer. Disse forfædre producerer i sidste ende celler af lymfoide, myeloide, erythroid og megakaryocyt slægter. For at opretholde deres selvfornyelseskapacitet forbliver HSC'er stort set stillestående og menes ligesom andre vævsstamceller at stole på glykolyse snarere end mitokondriel OxPHOS til ATP-produktion 2,3. Indtræden i cellecyklussen fører til øget åndedræt og OxPHOS, hvilket resulterer i forhøjede niveauer af reaktive iltarter (ROS), som er skadelige for HSC-vedligeholdelse og funktion3. Gentagen celledeling kan således føre til nedsat selvfornyelseskapacitet hos HSC'er og i sidste ende til deres udmattelse.
I voksen hæmatopoiesis gennemgår HSC'er primært asymmetrisk celledeling, hvor en af dattercellerne bevarer HSC-potentialet og fortsætter med at stole på glykolytisk metabolisme. Den anden dattercelle bliver en primitiv stamcelle, der mister selvfornyelseskapacitet, men formerer sig og til sidst giver anledning til differentierede funktionelle hæmatopoietiske celler4. Når HSC'er differentierer for at producere nedstrøms forfædre, menes et skift fra glykolyse til mitokondriemetabolisme at forekomme for at levere den energi og byggesten, der er nødvendige for at understøtte denne hurtige overgang5, som foreslået af observationerne om, at HSC'er besidder inaktiv mitokondriemasse 6,7,8,9 . I modsætning hertil er mitokondrieaktivitet (angivet med sammenkædede ROS-niveauer) meget højere hos slægtsforpligtede forfædre end i HSC'er 9,10,11. Metaboliske ændringer, der opstår under det tidligste trin af hæmatopoiesis, antyder således en direkte og afgørende rolle mitokondrier i reguleringen af HSC-skæbnen.
Dysfunktionelle mitokondrier, der er til stede under forskellige stresstilstande, såsom aldring, kræft, diabetes og fedme12, kan forstyrre HSC's selvfornyelseskapacitet og fremkalde en ubalance i HSC / stamcelledifferentiering ved at producere for store mængder ROS, forringe ATP-produktionen og / eller ved at ændre andre metaboliske processer 9,12,13 . Forstyrrelser i metabolisk homeostase i HSC/stamfaderdifferentiering kan påvirke hæmatopoiesis betydeligt og potentielt bidrage til udviklingen af hæmatologiske abnormiteter13. I betragtning af de kritiske påvirkninger af glykolyse og mitokondriel OxPHOS på HSC-stamme og differentiering er det af interesse at undersøge både metaboliske parametre under normale og stressforhold. Værdifuld indsigt i HSC'ers og stamcellers glykolytiske og mitokondrielle funktion kan opnås ved at vurdere deres ECAR og OCR, som er indikatorer for henholdsvis cellulær glykolyse og mitokondriel respiration.
Seahorse ekstracellulære fluxanalysator er et kraftfuldt apparat udstyret med to sonder pr. brønd til samtidig måling af ECAR og OCR i levende celler og kan således bruges til at vurdere cellulær bioenergetik i realtid som reaktion på forskellige substrater eller hæmmere. Assaypatronen, der anvendes sammen med analysatoren, indeholder injektionsporte til at rumme op til fire lægemidler til automatiseret injektion under analysen. Et skema med en typisk glykolyse stresstest er vist i figur 1A. Assayet starter med måling af ECAR af celler, inkuberet i glykolyse stresstestmedium indeholdende glutamin, men ikke glucose eller pyruvat. Dette repræsenterer forsuring, der forekommer på grund af ikke-glykolytiske aktiviteter i cellerne og rapporteres som ikke-glykolytisk forsuring. Dette efterfølges af injektion af glucose i en mættende koncentration. Via glykolyse omdannes glukose i cellen til pyruvat, som yderligere metaboliseres i cytoplasmaet for at producere laktat eller i mitokondrier for at producere CO2 og vand.
Omdannelse af glukose til laktat forårsager nettoproduktion og efterfølgende frigivelse af protoner til det ekstracellulære medium, hvilket resulterer i en hurtig stigning i ECAR 14,15,16. Denne glukosestimulerede ændring i ECAR rapporteres som glykolyse under basale forhold. Den anden injektion består af oligomycin (en hæmmer af ATP-syntase, alias kompleks V17), som hæmmer mitokondriel ATP-produktion. Under oligomycinmedieret OxPHOS-hæmning opregulerer celler maksimalt glykolyse for at imødekomme deres energiske krav. Dette medfører en yderligere stigning i ECAR, hvilket afslører cellernes maksimale glykolytiske kapacitet. Forskellen mellem den maksimale glykolytiske kapacitet og basal glykolyse kaldes glykolytisk reserve. Endelig injiceres 2-GD, hvilket forårsager et signifikant fald i ECAR, normalt tæt på ikke-glykolytiske forsuringsniveauer. 2-DG er en glucoseanalog, der konkurrencedygtigt binder til hexokinase, hvilket resulterer i hæmning af glykolyse18. Således bekræfter det 2-DG-inducerede fald i ECAR yderligere, at glykolyse faktisk er kilden til ECAR observeret efter glucose- og oligomycininjektioner.
Figur 1B viser skemaet for en typisk mitokondriel stresstest. Assayet starter med baseline OCR-måling af cellerne, inkuberet i mitokondrielt stresstestmedium indeholdende glucose, glutamin og pyruvat. Efter basale OCR-målinger injiceres oligomycin i dette assay, som hæmmer kompleks V og derved reducerer elektronstrømmen gennem elektrontransportkæden (ETC)17. Følgelig reduceres OCR som reaktion på oligomycininjektion, og dette fald i OCR er forbundet med mitokondriel ATP-produktion. Den anden injektion består af carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP), en protonofor og en afkobling af mitokondriel OxPHOS17. FCCP kollapser den mitokondrielle protongradient ved at tillade strømmen af protoner over den mitokondrielle indre membran. På grund af FCCP-injektionen er elektronstrømmen gennem ETC dereprimeret, og kompleks IV forbruger ilt på det maksimale niveau. Forskellen mellem maksimal OCR og basal OCR kaldes den ekstra åndedrætskapacitet, som er et mål for cellens evne til at reagere på øget energibehov under stressforhold. Endelig injiceres en blanding af to ETC-hæmmere (rotenon, en kompleks I-hæmmer og antimycin A, en kompleks III-hæmmer17), som fuldstændigt lukker elektronstrømmen, og OCR falder til et lavt niveau. OCR målt efter rotenon og antimycin En injektion svarer til ikke-mitokondriel OCR drevet af andre processer inde i cellerne. Ikke-mitokondriel OCR muliggør beregning af basal respiration, protonlækage og maksimal respiration.
Basal respiration repræsenterer forskellen mellem baseline OCR og ikke-mitokondriel OCR. Protonlækage refererer til forskellen mellem OCR efter oligomycininjektion og ikke-mitokondriel OCR. Maksimal respiration repræsenterer forskellen mellem OCR efter FCCP-injektion og ikke-mitokondriel OCR. Koblingseffektivitet beregnes som procentdelen af ATP-produktionshastighed til basal respirationshastighed. Dette metodepapir giver en detaljeret protokol til måling af ECAR og OCR i afstamningsnegative HSPC'er ved hjælp af Seahorse XFe96 ekstracellulær fluxanalysator. Denne protokol beskriver tilgange til at isolere museafstamningsnegative HSPC'er, forklarer optimeringen af cellesåningstæthed og koncentrationer af forskellige lægemidler, der anvendes i ekstracellulære fluxassays, og beskriver lægemiddelbehandlingsstrategier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430626</td>
			<td>Used to filter-sterilize the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>3rd drug injection during glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Enrichment buffer (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480017</td>
			<td>Used for washings during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A661-3</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>2nd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive. Used for coating cell microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O2793-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Used as cells strainer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26400044</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Used to wash cells after assay for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P235-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100103</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100243</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100603</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108403</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences now Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For ECAR and OCR measurments in real time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Prepared 1 N solution. Used for pH normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480015</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF prep station</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Used for non-CO2 37 &#176;C incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 extracellular FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100 or 102601-100</td>
			<td>Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading 
			drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer

Under steady state forbliver hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) stort set stillestående og menes at være overvejende afhængige af glykolyse for at imødekomme deres energiske behov. Under stresstilstande som infektion eller blodtab bliver HSC'er imidlertid proliferative og producerer hurtigt nedstrøms stamceller, som igen differentierer yderligere og i sidste ende producerer modne blodlegemer. Under denne overgangs- og differentieringsproces forlader HSC'er fra quiescens og gennemgår hurtigt en metabolisk switch fra glykolyse til oxidativ phosphorylering (OxPHOS). Forskellige stresstilstande, såsom aldring, kræft, diabetes og fedme, kan påvirke mitokondriefunktionen negativt og dermed ændre den metaboliske omprogrammering og differentiering af HSC'er og forfædre under hæmatopoiesis. Værdifuld indsigt i glykolytiske og mitokondrielle funktioner hos HSC'er og forfædre under normale og stressforhold kan opnås gennem vurderingen af deres ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) og iltforbrugshastighed (OCR), som er indikatorer for henholdsvis cellulær glykolyse og mitokondriel respiration. 
Her tilvejebringes en detaljeret protokol til måling af ECAR og OCR i museknoglemarvsafledte slægtsnegative cellepopulationer, som omfatter både hæmatopoietisk stamme og primitive stamceller (HSPC'er) ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator. Denne protokol beskriver tilgange til at isolere afstamningsnegative celler fra museknoglemarv, forklarer optimering af cellesåningstæthed og koncentrationer af 2-deoxy-D-glucose (2-DG, en glukoseanalog, der hæmmer glykolyse) og forskellige OxPHOS-målrettede lægemidler (oligomycin, FCCP, rotenon og antimycin A), der anvendes i disse assays, og beskriver lægemiddelbehandlingsstrategier. Nøgleparametre for glykolytisk flux, såsom glykolyse, glykolytisk kapacitet og glykolytisk reserve og OxPHOS-parametre, såsom basal respiration, maksimal respiration, protonlækage, ATP-produktion, ledig åndedrætskapacitet og koblingseffektivitet, kan måles i disse assays. Denne protokol tillader ECAR- og OCR-målinger på ikke-klæbende HSPC'er og kan generaliseres for at optimere analysebetingelserne for enhver type suspensionsceller.

Ved hjælp af denne protokol blev celleantallet og koncentrationerne af forskellige OxPHOS-målrettede lægemidler (anvendt i de ekstracellulære fluxassays) optimeret til at måle ECAR og OCR af HSPC'er isoleret fra 24 uger gamle kvindelige C57BL / 6-mus. For det første blev glykolyseststresstesten udført for at optimere celleantal og oligomycinkoncentration. Et varierende antal HSPC'er pr. brønd fra 5 × 104 til 2,5 × 105 blev anvendt i dette assay. Som vist i figur 2A</st...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Metoden, der præsenteres her, opsummerer optimerede protokoller til vurdering af cellulær bioenergetik i ikke-klæbende musehæmatopoietisk stamme og primitive stamceller (HSPC'er) ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator til måling af den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) og iltforbrugshastighed (OCR) for HSPC'er i realtid.

Vurdering af cellulær bioenergetik i hæmatopoietisk stamme og primitive stamceller ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Under hæmatopoiesis gennemgår hæmatopoietiske stamceller en metabolisk switch fra glykolyse til oxidativ fosforylering. Denne protokol kan bruges til at vurdere glykolytiske og mitokondrielle funktioner af mus hæmatopoietiske stam- og stamceller. Denne metode kan bruges til at vurdere cellulær bioenergetik i realtid.Den 96-brønds mikropladebaserede platform tilbyder kvantificering med høj kapacitet med høj følsomhed, hvilket muliggør samtidig analyse af flere prøver ved hjælp af en enkelt plade. Denne teknik kan bruges til at undersøge virkningerne af kemikalier eller genetiske manipulationer på HSC-metabolisme under forskellige forhold. Det kan hjælpe med at belyse metaboliske veje, der opretholder HSC pluripotens.Selvom den nuværende undersøgelse hovedsageligt er fokuseret på musehæmatopoietiske stængler og stamceller, kunne protokollen og denne tilgang let tilpasses til at optimere analysebetingelserne for enhver form for suspensionsceller. En dag før analysen skal du åbne det ekstracellulære fluxanalysesæt for at fjerne sensorpatronen og hjælpepladeenheden. Gem lasteguidelejlighederne til brug den næste dag.Adskil nu sensorpatronen manuelt fra hjælpepladen, og læg den på hovedet ved siden af værktøjspladen. Brug en flerkanalspipette til at fylde hver brønd på hjælpepladen med 200 mikroliter calibrant, der følger med fluxanalysesættet, og læg derefter sensorpatronen tilbage på værktøjspladen, og sørg for at nedsænke sensorerne helt i kalibreren. Derefter inkuberes brugspladen med kalibrering og samlet sensorpatron i en ikke-kuldioxidinkubator ved 37 grader Celsius natten over efter de befugtningsforhold, der er nævnt i manuskriptet.På analysedagen fremstilles 2,5 ml celleklæbemiddelopløsning pr. 96-brønds cellekulturmikroplade som beskrevet i tekstmanuskriptet. Åbn mikropladen med cellekultur med 96 brønde, der følger med fluxanalysesættet, og dispenser 25 mikroliter af den tilberedte celleklæbemiddelopløsning i bunden af hver brønd. Dæk mikropladen med låget og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur inde i emhætten.Efter inkubation fjernes og kasseres den overskydende celleklæbemiddelopløsning ved hjælp af en flerkanalspipette eller aspirator og vaskes hver brønd to gange med 200 mikroliter sterilt ultrarent vand. Lufttør pladen uden låg inde i emhætten i 30 til 45 minutter. Centrifugering af den forberedte museafstigelse negative HSPC'er ved 200 gange G i fem minutter ved stuetemperatur.Efter kassation af supernatanten skal cellepillen resuspenderes i det relevante analysemedium og centrifugeres igen cellesuspensionen. Gentag denne procedure endnu en gang, og genophæng cellerne i det passende opvarmede analysemedium til koncentrationen på 250.000 celler pr. 50 mikroliter eller fem millioner celler pr. Milliliter. Brug en flerkanalspipette til at tilføje 50 mikroliter cellesuspension langs siden af hver brønd i den celleklæbende belagte mikroplade med 96 brøndcellekultur, og tilsæt derefter 50 mikroliter analysemediet i hjørnebaggrundsmålingsbrøndene.Opret en centrifugebalanceplade ved at tilføje 50 mikroliter vand pr. Brønd af en ikke-belagt cellekulturmikroplade med 96 brønde. Centrifugering af cellerne ved 200 gange G i et minut ved stuetemperatur. Inkuber pladen i en ikke-kuldioxidinkubator ved 37 grader Celsius i 25 til 30 minutter til cellefastgørelse.Efter 30 minutter bekræftes visuelt under et mikroskop, at cellerne er stabilt klæbet til mikropladeoverfladen. Begynd med at forberede alle de nødvendige opløsninger i det forvarmede glykolyse stresstestassaymedium som nævnt i tekstmanuskriptet, og fjern den hydrerede sensorpatron fra inkubatoren. Løft sensorpatronen ud af kalibreringsmidlet, og udskift den på den samme brugsplade med kalibreringsmidlet for at fjerne luftboblerne.Placer 80-indlæsningsstyret fladt på toppen af sensorpatronen, der orienterer den, så bogstavet A er placeret i øverste venstre hjørne. Brug en flerkanalspipette til at dispensere 20 mikroliter 100 millimolær glucoseopløsning i port A.Udskift 80-lasteguiden fladt med BC-lasteguiden fladt og orienter bogstavet B i øverste venstre hjørne. Dispenser 22 mikroliter 20 mikromolære oligomycinopløsninger i port B.Ret BC-lasteguiden fladt for at lokalisere bogstavet C i øverste venstre hjørne til lastning af port C og dispenser 25 mikroliter 500 millimolær 2-deoxy-d-glucoseopløsning i port C.Fjern og kassér derefter lasteføringsfladerne.Opret eller indlæs nu skabelonen til glykolyse-stresstesten på controlleren. Angiv oplysninger om injektionsstrategier, behandlingsbetingelser og celletyper, og tryk på Generer grupper. Gå til pladekortet og tildel brønde til hver gruppe, der skal analyseres.I protokollen skal du sikre dig, at kalibrering og ligevægt kontrolleres i initialiseringstrinnet. For baselinemåling og målinger efter hver injektion skal du indstille antallet af målecyklusser til tre og blande, vente, måle tider til tre minutter, nul minutter, tre minutter. Klik på Start kør på softwaren.Fjern låget fra de ilagte forbindelser og den hydratiserede sensorpatron, og læg det på arbejdsbakken på den ekstracellulære fluxanalysator. Start kalibreringskørslen. Tag mikropladen indeholdende de frøede celler ud af inkubatoren.Uden at forstyrre cellerne tilsættes langsomt 130 mikroliter af det forvarmede glykolyse-stresstestassaymedium pr. Brønd for at udgøre mediumvolumenet i hver brønd til 180 mikroliter og returnere pladen til inkubatoren i yderligere 15 til 20 minutter. Klik på Åbn bakke på softwaren for at åbne den termiske bakke i Seahorse. Når kalibreringen er overstået, skal du udskifte hjælpepladen med denne analysemikroplade, der indeholder cellerne, og trykke på vejecellepladen for at starte målingerne.Når målingerne er overstået, skal du fjerne analysemediet fra pladen uden at forstyrre cellerne og vaske dem forsigtigt med 250 mikroliter fosfatbufret saltvand uden at løsne cellerne. Tilsæt nu 10 mikroliter radioimmunoprecipitationslysebuffer suppleret med 1X proteasehæmmercocktail til hver brønd og omrør pladen på en ryster i 10 minutter. Frys hele pladen ved minus 80 grader Celsius.Tø pladen op og udfør et proteinmålingsassay til datanormalisering efter producentens anvisninger. Hent og analysér dataene ved at åbne datafilen ved hjælp af Wave desktop-software. Klik på Normaliser, indsæt normaliseringsværdierne for hver brønd, og klik derefter på Anvend for at normalisere dataene.Klik på Eksporter og vælg glykolyse stresstestrapportgenerator for at eksportere de analyserede data til en rapportgenerator. Den ikke-glykolytiske forsuringshastighed stiger med øget celleantal fra 50.000 til 250.000, men stiger kun minimalt mellem 200.000 og 250.000. Injektion af 10 millimolær glucose stimulerer glykolyse ved alle celletal med en maksimal stigning i ECAR observeret ved 250.000 celler pr. Brønd.Injektion af to mikromolære oligomycin øger imidlertid ikke ECAR yderligere. OCR-data opnået i det samme sæt glykolyse-stresstest viser et signifikant fald efter oligomycininjektion på grund af kompleks 5-hæmning. Glykolyse stresstestparametre blev beregnet, og 250.000 celler pr. Brønd i to mikromolære oligomycin blev udvalgt til yderligere undersøgelser.Den mitokondrielle stresstest viste, at to mikromolære oligomycininjektioner forårsager en signifikant reduktion i OCR via hæmning af kompleks 5. FCCP stimulerer OCR i HSPC'er på en dosisafhængig måde med en maksimal stigning observeret ved to mikromolære. En blanding af 0,5 mikromolær rotenon og 0,5 mikromolær antimycin A-injektion reducerer OCR til sit minimale niveau svarende til ikke-mitokondrielt iltforbrug.Mitokondrielle stresstestparametre blev beregnet, og to mikromolære FCCP blev udvalgt til yderligere undersøgelser. I betragtning af denne tekniks høje gennemstrømningskarakter kunne den protokol, der er beskrevet her, let tilpasses til at screene et stort antal bioenergetiske modulatorer i hæmatopoietiske stamceller, hæmatopoietiske forfædre og maligne hæmatopoietiske celler. Seahorse analyse er meget udbredt i litteraturen til at måle metabolisme i en lang række sammenhænge i nærvær af forskellige substrater og hæmmere.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fænotypisk analyse og isolering af murine hæmatopoietiske stamceller og Lineage-progenitorer

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering af mus afledt fra induceret pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og progenitorceller Præget af Fem fluorescerende proteiner ved hjælp af konfokal og multiphoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brugergrænseflade til softwareassisteret sporing af proteinkoncentration i dynamiske cellulære protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolation, karakterisering og High Throughput ekstracellulære Flux analyse af musen primær Renal tubulær epitelceller

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Måling af energimetabolisme i eksplanterede retinale væv ved hjælp af ekstracellulære Flux analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...