Name: assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Het werk in lombard laboratorium wordt ondersteund door de NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 en ME200030) en Glenn Foundation for Medical Research. Het werk in het Li-laboratorium wordt ondersteund door NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Alle dierproeven met gewervelde dieren werden goedgekeurd door en uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van het University of Michigan Committee on Use and Care of Animals.
1. Dag voor de test (Totale tijd: ~ 10 min)
<ol><li>Hydratatie van de sensorcartridge (staptijd: ~ 10 min)<ol>
<li>Open de extracellulaire fluxtestkit en verwijder de sensorcartridge en de gebruiksplaat. Sla laadgidsen op voor gebruik de volgende dag.</li>
		<li>Scheid de sensorcartridge (het bovenste groene ...

<ol>
	<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis.">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+(HSPCs).">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li><li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging.">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells.">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux.">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li><li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells:+new+perspectives+and+opportunities.">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li><li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases.">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).</li><li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent:+mechanism+of+cell+death.">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li></ol>

Dit method paper beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor de beoordeling van cellulaire bio-energetica (glycolyse en OxPHOS) in muis HSPC's met behulp van de Seahorse extracellulaire flux analyzer. Dit apparaat is een krachtig hulpmiddel dat tegelijkertijd de ECAR en OCR van levende cellen meet, die respectievelijk metrieken zijn van glycolyse en mitochondriale ademhaling. Het kan dus worden gebruikt om de cellulaire bio-energetica in realtime te beoordelen. Verder biedt het 96-well microplate-gebaseerde platform kwa...

Hematopoiese is het proces waarbij verschillende soorten volwassen bloedcellen met zeer gespecialiseerde functies worden gevormd uit HSC's1. HSC's zijn in staat tot zelfvernieuwing en differentiatie in verschillende multipotente en afstammingsspecifieke voorloperpopulaties. Deze voorlopers produceren uiteindelijk cellen van lymfoïde, myeloïde, erytroïde en megakaryocytenlijnen. Om hun zelfvernieuwingscapaciteit te behouden, blijven HSC's grotendeels rustig en wordt aangenomen dat ze, net als andere weefselstamcellen, afhankelijk zijn van glycolyse in plaats van mitochondriaal OxPHOS voor ATP-productie 2,3. Toegang tot de celcyclus leidt tot verbeterde ademhaling en OxPHOS, wat resulteert in verhoogde niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS), die schadelijk zijn voor HSC-onderhoud en -functie3. Herhaalde celdeling kan dus leiden tot een verminderd zelfvernieuwend vermogen van HSC's en uiteindelijk tot uitputting ervan.
Bij volwassen hematopoiese ondergaan HSC's voornamelijk asymmetrische celdeling, waarbij een van de dochtercellen HSC-potentieel behoudt en blijft vertrouwen op glycolytisch metabolisme. De andere dochtercel wordt een primitieve voorlopercel die zelfvernieuwingsvermogen verliest maar zich vermenigvuldigt en uiteindelijk aanleiding geeft tot gedifferentieerde functionele hematopoëtische cellen4. Wanneer HSC's differentiëren om stroomafwaartse voorlopers te produceren, wordt gedacht dat een omschakeling van glycolyse naar mitochondriaal metabolisme plaatsvindt om de energie en bouwstenen te leveren die nodig zijn om deze snelle overgang te ondersteunen5, zoals gesuggereerd door de observaties dat HSC's inactieve mitochondriale massa bezitten 6,7,8,9 . Daarentegen is mitochondriale activiteit (aangegeven door gekoppelde ROS-niveaus) veel hoger in afstammingsgebonden voorlopers dan in HSC's 9,10,11. Metabole veranderingen die optreden tijdens de vroegste stap van hematopoëse suggereren dus een directe en cruciale rol van mitochondriën bij het reguleren van het lot van HSC.
Disfunctionele mitochondriën die aanwezig zijn onder verschillende stressomstandigheden, zoals veroudering, kanker, diabetes en obesitas12, kunnen het zelfvernieuwingsvermogen van HSC verstoren, waardoor een onbalans in HSC / voorloperdifferentiatie wordt veroorzaakt door overmatige hoeveelheden ROS te produceren, de ATP-productie te verminderen en / of door andere metabole processen te veranderen 9,12,13 . Verstoringen in metabole homeostase in HSC/voorloper differentiatie kunnen een significante invloed hebben op de hematopoëse, wat mogelijk bijdraagt aan de ontwikkeling van hematologische afwijkingen13. Gezien de kritische invloeden van glycolyse en mitochondriaal OxPHOS op HSC-stengelheid en differentiatie, is het van belang om zowel metabole parameters onder normale als stressomstandigheden te onderzoeken. Waardevolle inzichten in de glycolytische en mitochondriale functie van HSC's en voorlopercellen kunnen worden verkregen door hun ECAR en OCR te beoordelen, die indicatoren zijn van respectievelijk cellulaire glycolyse en mitochondriale ademhaling.
De Seahorse extracellulaire flux analyzer is een krachtig apparaat uitgerust met twee sondes per put om tegelijkertijd ECAR en OCR in levende cellen te meten en kan dus worden gebruikt om cellulaire bio-energetica in realtime te beoordelen, in reactie op verschillende substraten of remmers. De testcartridge die met de analysator wordt gebruikt, bevat injectiepoorten om maximaal vier geneesmiddelen voor geautomatiseerde injectie tijdens de test te houden. Een schema van een typische glycolyse stresstest is weergegeven in figuur 1A. De test begint met het meten van ECAR van cellen, geïncubeerd in glycolyse stresstestmedium dat glutamine bevat, maar geen glucose of pyruvaat. Dit vertegenwoordigt verzuring die optreedt als gevolg van niet-glycolytische activiteiten van de cellen en wordt gerapporteerd als niet-glycolytische verzuring. Dit wordt gevolgd door de injectie van glucose in een verzadigingsconcentratie. Via glycolyse wordt glucose in de cel omgezet in pyruvaat, dat verder wordt gemetaboliseerd in het cytoplasma om lactaat te produceren, of in mitochondriën om CO2 en water te produceren.
Omzetting van glucose in lactaat veroorzaakt nettoproductie en daaropvolgende afgifte van protonen in het extracellulaire medium, wat resulteert in een snelle toename van de ECAR 14,15,16. Deze glucose-gestimuleerde verandering in ECAR wordt gerapporteerd als glycolyse onder basale omstandigheden. De tweede injectie bestaat uit oligomycine (een remmer van ATP-synthase, ook bekend als complex V17), dat de mitochondriale ATP-productie remt. Tijdens oligomycine-gemedieerde OxPHOS-remming upreguleren cellen de glycolyse maximaal om aan hun energetische eisen te voldoen. Dit veroorzaakt een verdere toename van ECAR, waardoor de maximale glycolytische capaciteit van de cellen wordt onthuld. Het verschil tussen de maximale glycolytische capaciteit en basale glycolyse wordt glycolytische reserve genoemd. Ten slotte wordt 2-DG geïnjecteerd, wat een aanzienlijke daling van de ECAR veroorzaakt, meestal dicht bij niet-glycolytische verzuringsniveaus. 2-DG is een glucose-analoog dat concurrerend bindt aan hexokinase, wat resulteert in remming van glycolyse18. De door 2 DG geïnduceerde afname van ECAR bevestigt dus verder dat glycolyse inderdaad de bron is van ECAR waargenomen na glucose- en oligomycine-injecties.
Figuur 1B toont het schema voor een typische mitochondriale stresstest. De test begint met baseline OCR-meting van de cellen, geïncubeerd in mitochondriaal stresstestmedium dat glucose, glutamine en pyruvaat bevat. Na basale OCR-metingen wordt oligomycine geïnjecteerd in deze test, die complexe V remt, waardoor de elektronenstroom door de elektronentransportketen (ETC)17 wordt verminderd. Bijgevolg wordt OCR verminderd als reactie op oligomycine-injectie en deze afname van OCR is gekoppeld aan mitochondriale ATP-productie. De tweede injectie bestaat uit carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP), een protonofoor en een ontkoppelaar van mitochondriaal OxPHOS17. FCCP stort de mitochondriale protongradiënt in door de stroom van protonen over het mitochondriale binnenmembraan mogelijk te maken. Door de FCCP-injectie wordt de elektronenstroom door de ETC onderdrukt en verbruikt complex IV zuurstof op het maximale niveau. Het verschil tussen maximale OCR en basale OCR wordt de reserve ademhalingscapaciteit genoemd, wat een maat is voor het vermogen van de cel om te reageren op een verhoogde energievraag onder stressomstandigheden. Ten slotte wordt een mengsel van twee ETC-remmers (rotenon, een complex I-remmer en antimycine A, een complexeIII-remmer 17) geïnjecteerd, waardoor de elektronenstroom volledig wordt afgesloten en OCR tot een laag niveau afneemt. OCR gemeten na rotenon en antimycine A-injectie komt overeen met niet-mitochondriale OCR aangedreven door andere processen in de cellen. Niet-mitochondriale OCR maakt de berekening van basale ademhaling, protonenlekkage en maximale ademhaling mogelijk.
Basale ademhaling vertegenwoordigt het verschil tussen baseline OCR en niet-mitochondriale OCR. Protonlek verwijst naar het verschil tussen OCR na oligomycine-injectie en niet-mitochondriale OCR. Maximale ademhaling vertegenwoordigt het verschil tussen OCR na FCCP-injectie en niet-mitochondriale OCR. De koppelingsefficiëntie wordt berekend als het percentage atp-productiesnelheid ten opzichte van de basale ademhalingsfrequentie. Dit method paper biedt een gedetailleerd protocol voor het meten van ECAR en OCR in afstammingsnegatieve HSPC's met behulp van de Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyzer. Dit protocol beschrijft benaderingen voor het isoleren van muizenlijnnegatieve HSPC's, verklaart de optimalisatie van celzaaidichtheid en concentraties van verschillende geneesmiddelen die worden gebruikt in extracellulaire fluxtests en beschrijft strategieën voor medicamenteuze behandeling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430626</td>
			<td>Used to filter-sterilize the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>3rd drug injection during glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Enrichment buffer (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480017</td>
			<td>Used for washings during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A661-3</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>2nd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive. Used for coating cell microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O2793-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Used as cells strainer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26400044</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Used to wash cells after assay for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P235-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100103</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100243</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100603</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108403</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences now Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For ECAR and OCR measurments in real time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Prepared 1 N solution. Used for pH normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480015</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF prep station</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Used for non-CO2 37 &#176;C incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 extracellular FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100 or 102601-100</td>
			<td>Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading 
			drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer

Onder steady state blijven hematopoëtische stamcellen (HSC's) grotendeels rustig en wordt aangenomen dat ze voornamelijk afhankelijk zijn van glycolyse om aan hun energetische behoeften te voldoen. Onder stressomstandigheden zoals infectie of bloedverlies worden HSC's echter proliferatief en produceren ze snel stroomafwaartse voorlopercellen, die op hun beurt verder differentiëren en uiteindelijk volwassen bloedcellen produceren. Tijdens dit overgangs- en differentiatieproces verlaten HSC's rust en ondergaan ze snel een metabole omschakeling van glycolyse naar oxidatieve fosforylering (OxPHOS). Verschillende stressomstandigheden, zoals veroudering, kanker, diabetes en obesitas, kunnen de mitochondriale functie negatief beïnvloeden en kunnen dus de metabole herprogrammering en differentiatie van HSC's en voorlopercellen tijdens hematopoëse veranderen. Waardevolle inzichten in glycolytische en mitochondriale functies van HSC's en voorlopercellen onder normale en stressomstandigheden kunnen worden verkregen door de beoordeling van hun extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR), die indicatoren zijn van respectievelijk cellulaire glycolyse en mitochondriale ademhaling. 
Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om ECAR en OCR te meten in van het beenmerg afgeleide afstammingsnegatieve celpopulaties van muizen, die zowel hematopoëtische stam als primitieve voorlopercellen (HSPC's) omvatten, met behulp van de extracellulaire fluxanalysator. Dit protocol beschrijft benaderingen voor het isoleren van afstammingsneg-negatieve cellen uit het beenmerg van muizen, verklaart optimalisatie van celzaaidichtheid en concentraties van 2-deoxy-D-glucose (2-DG, een glucose-analoog dat glycolyse remt) en verschillende OxPHOS-gerichte geneesmiddelen (oligomycine, FCCP, rotenon en antimycine A) die in deze testen worden gebruikt, en beschrijft behandelingsstrategieën voor geneesmiddelen. Belangrijke parameters van glycolytische flux, zoals glycolyse, glycolytische capaciteit en glycolytische reserve, en OxPHOS-parameters, zoals basale ademhaling, maximale ademhaling, protonlek, ATP-productie, reserve ademhalingscapaciteit en koppelingsefficiëntie, kunnen in deze testen worden gemeten. Dit protocol maakt ECAR- en OCR-metingen op niet-adherente HSPC's mogelijk en kan worden gegeneraliseerd om de analyseomstandigheden voor elk type suspensiecellen te optimaliseren.

Met behulp van dit protocol werden het celnummer en de concentraties van verschillende OxPHOS-gerichte geneesmiddelen (gebruikt in de extracellulaire flux-assays) geoptimaliseerd om ECAR en OCR van HSPC's te meten die zijn geïsoleerd van 24 weken oude vrouwelijke C57BL / 6-muizen. Eerst werd de glycolyse-stresstest uitgevoerd om het celgetal en de oligomycineconcentratie te optimaliseren. Een wisselend aantal HSPC's per put variërend van 5 × 104 tot 2,5 × 105 werden gebruikt in deze test. Zoals ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Tijdens hematopoiese ondergaan hematopoëtische stamcellen een metabole omschakeling van glycolyse naar oxidatieve fosforylering. Dit protocol kan worden gebruikt om glycolytische en mitochondriale functies van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen van muizen te beoordelen. Deze methode kan worden gebruikt om cellulaire bio-energetica in realtime te beoordelen.Het 96-well microplate-gebaseerde platform biedt kwantificering met hoge doorvoer met hoge gevoeligheid, waardoor gelijktijdige analyse van meerdere monsters met behulp van een enkele plaat mogelijk is. Deze techniek kan worden gebruikt om de effecten van chemicaliën of genetische manipulaties op het HSC-metabolisme onder verschillende omstandigheden te onderzoeken. Het kan helpen bij het ophelderen van metabole routes die HSC-pluripotentie ondersteunen.Hoewel de huidige studie voornamelijk gericht is op hematopoietische stengels en voorlopercellen van muizen, kunnen het protocol en deze aanpak gemakkelijk worden aangepast om de analyseomstandigheden voor elk type suspensiecellen te optimaliseren. Open een dag voor de test de extracellulaire fluxtestkit om de sensorcartridge en de gebruiksplaatassemblage te verwijderen. Bewaar de laadgeleiderflats voor gebruik de volgende dag.Scheid nu handmatig de sensorcartridge van de gebruiksplaat en plaats deze ondersteboven naast de gebruiksplaat. Vul met behulp van een meerkanaalspipet elke put van de gebruiksplaat met 200 microliter kalibrant die bij de fluxtestkit is geleverd en plaats de sensorcartridge vervolgens terug op de gebruiksplaat en zorg ervoor dat de sensoren volledig in het kalibrant worden ondergedompeld. Incubeer vervolgens de gebruiksplaat met kalibrant en geassembleerde sensorpatroon in een niet-koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius 's nachts na de bevochtigingsomstandigheden die in het manuscript worden genoemd.Bereid op de dag van de test 2,5 milliliter van de cellijmoplossing per 96-well celkweekmicroplaat zoals beschreven in het tekstmanuscript. Open de 96-well celkweekmicroplaat die bij de fluxtestkit is geleverd en doseer 25 microliter van de bereide cellijmoplossing op de bodem van elke put. Bedek de microplaat met het deksel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de kap.Verwijder na incubatie de overtollige cellijmoplossing en gooi deze weg met behulp van een meerkanaalspipet of aspirator en was elke put tweemaal met 200 microliter steriel ultrapuur water. Droog de plaat zonder deksel in de kap gedurende 30 tot 45 minuten aan de lucht. Centrifugeer de geprepareerde muizenlijnnegatieve HSPC's bij 200 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u de celkorrel in het juiste testmedium en centrifugeert u de celsuspensie opnieuw. Herhaal deze procedure nog een keer en resuspend de cellen in het juiste verwarmde testmedium tot de concentratie van 250.000 cellen per 50 microliter of vijf miljoen cellen per milliliter. Gebruik een meerkanaalspipet om 50 microliter van de celsuspensie toe te voegen langs de zijkant van elke put van de met cellijm beklede 96-well celkweekmicroplaat en voeg vervolgens 50 microliter van het testmedium toe aan de hoekachtergrondmeetputten.Maak een centrifugebalansplaat door 50 microliter water toe te voegen per put van een niet-gecoate 96-well celkweekmicroplaat. Centrifugeer de cellen gedurende één minuut bij kamertemperatuur op 200 maal G. Incubeer de plaat in een niet-koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius gedurende 25 tot 30 minuten voor celaanhechting.Bevestig na 30 minuten visueel onder een microscoop dat de cellen stabiel aan het microplaatoppervlak zijn gehecht. Begin met het bereiden van alle vereiste oplossingen in het voorverwarmde glycolyse-stresstesttestmedium zoals vermeld in het tekstmanuscript en verwijder de gehydrateerde sensorcartridge uit de incubator. Til de sensorcartridge uit het kalibrant en vervang deze op dezelfde gebruiksplaat met de kalibrant om de luchtbellen te verwijderen.Plaats de 80-laadgeleider plat op de bovenkant van de sensorcartridge en oriënteer deze zodat de letter A zich in de linkerbovenhoek bevindt. Doseer met behulp van een meerkanaalspipet 20 microliter 100 millimolaire glucoseoplossing in poort A. Vervang de 80-laadgeleider plat door de BC-laadgeleider plat, waarbij u de letter B in de linkerbovenhoek oriënteert. Doseer 22 microliter van 20 micromolaire oligomycine-oplossing in poort B.Heroriënteer de BC-laadgeleider plat om de letter C in de linkerbovenhoek te lokaliseren voor het laden van poort C en doseer 25 microliter van 500 millimolar 2-deoxy-d-glucoseoplossing in poort C. Verwijder en gooi vervolgens de laadgeleiderflats weg.Maak of laad nu de sjabloon voor de glycolyse-stresstest op de controller. Voer de details in over injectiestrategieën, behandelingsomstandigheden en celtypen en druk op Groepen genereren. Ga naar de plaatkaart en wijs putten toe aan elke groep die moet worden geanalyseerd.Zorg er in het protocol voor dat kalibratie en evenwicht worden gecontroleerd in de initialisatiestap. Stel voor de nulmeting en metingen na elke injectie het aantal meetcycli in op drie en meng, wacht, meet tijden op drie minuten, nul minuten, drie minuten. Klik op Start Uitvoeren in de software.Verwijder het deksel van de met verbindingen geladen en gehydrateerde sensorcartridge en plaats deze op de werklade van de extracellulaire fluxanalysator. Begin de kalibratierun. Haal de microplaat met de zaadcellen uit de couveuse.Zonder de cellen te storen, voegt u langzaam 130 microliter van het voorverwarmde glycolyse-stresstesttestmedium per put toe om het gemiddelde volume in elke put tot 180 microliter te maken en breng de plaat nog eens 15 tot 20 minuten terug naar de incubator. Klik op Lade openen in de software om de thermische lade van Seahorse te openen. Nadat de kalibratie is voltooid, vervangt u de gebruiksplaat door deze testmicroplaat met de cellen en drukt u op de loadcelplaat om de metingen te starten.Nadat de metingen zijn voltooid, verwijdert u het testmedium van de plaat zonder de cellen te storen en wast u ze voorzichtig met 250 microliter fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder de cellen te ontwrichten. Voeg nu 10 microliter radioimmunoprecipitatie lysisbuffer aangevuld met 1X proteaseremmer cocktail toe aan elke put en roer de plaat gedurende 10 minuten op een shaker. Vries de hele plaat in bij min 80 graden Celsius.Ontdooi de plaat en voer een eiwitmeting uit voor gegevensnormalisatie volgens de instructies van de fabrikant. Haal de gegevens op en analyseer deze door het gegevensbestand te openen met de Wave-desktopsoftware. Klik op Normaliseren, plak de normalisatiewaarden voor elk putje en klik vervolgens op Toepassen om de gegevens te normaliseren.Klik op Exporteren en selecteer glycolyse stresstestrapportgenerator om de geanalyseerde gegevens naar een rapportgenerator te exporteren. De niet-glycolytische verzuring stijgt met een verhoogd celgetal van 50.000 tot 250.000, maar neemt slechts minimaal toe tussen 200.000 en 250.000. Injectie van 10 millimolaire glucose stimuleert glycolyse bij alle celaantallen met een maximale toename van ECAR waargenomen bij 250.000 cellen per put.Injectie van twee micromolair oligomycine verhoogt de ECAR echter niet verder. De OCR-gegevens verkregen in dezelfde reeks glycolyse-stresstests tonen een significante daling na oligomycine-injectie als gevolg van complex 5-remming. Glycolyse stress testparameters werden berekend en 250.000 cellen per put in twee micromolaire oligomycine werden geselecteerd voor verdere studies.De mitochondriale stresstest toonde aan dat twee micromolaire oligomycine-injectie een significante vermindering van OCR veroorzaakt via de remming van complex 5. FCCP stimuleert OCR in HSPC's op een dosisafhankelijke manier met een maximale toename waargenomen bij twee micromolair. Een mengsel van 0,5 micromolair rotenon en 0,5 micromolair antimycine A-injectie verlaagt OCR tot het minimale niveau dat overeenkomt met het niet-mitochondriale zuurstofverbruik.Mitochondriale stresstestparameters werden berekend en twee micromolaire FCCP werd geselecteerd voor verdere studies. Gezien de hoge doorvoer van deze techniek, kan het hier beschreven protocol gemakkelijk worden aangepast om een groot aantal bio-energetische modulatoren in hematopoëtische stamcellen, hematopoëtische voorlopers en kwaadaardige hematopoëtische cellen te screenen. Zeepaardjesanalyse wordt veel gebruikt in de literatuur om het metabolisme in een breed scala van contexten te meten in de aanwezigheid van verschillende substraten en remmers.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolatie, karakterisering en High Throughput extracellulaire Flux-analyse van muis primaire renale tubulaire epitheliale cellen

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...