Name: assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Die Arbeit im lombardischen Labor wird vom NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 und ME200030) und der Glenn Foundation for Medical Research unterstützt. Die Arbeit im Li-Labor wird vom NIH (NHLBI 5R01HL150707) unterstützt.

Alle Tierversuche mit Wirbeltieren wurden von den Vorschriften des Ausschusses für die Verwendung und Pflege von Tieren der University of Michigan genehmigt und in Übereinstimmung mit diesen durchgeführt.
1. Tag vor dem Assay (Gesamtzeit: ~10 min)
<ol><li>Hydratation der Sensorkartusche (Schrittzeit: ~10 min)<ol>
<li>Öffnen Sie das extrazelluläre Flux-Assay-Kit, und entfernen Sie die Sensorkassette und die Utility-Plate-Baugruppe. Speichern Sie Ladehilfswohnungen für die Verwendung am ...

<ol>
	<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis.">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging.">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells.">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux.">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li><li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells:+new+perspectives+and+opportunities.">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. 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K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li></ol>

Diese Methodenarbeit beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik (Glykolyse und OxPHOS) in Maus-HSPCs mit dem extrazellulären Flussanalysator Seahorse. Dieses Gerät ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das gleichzeitig die ECAR und OCR lebender Zellen misst, bei denen es sich um Metriken der Glykolyse bzw. der mitochondrialen Atmung handelt. So kann es verwendet werden, um die zelluläre Bioenergetik in Echtzeit zu beurteilen. Darüber hinaus bietet die 96-Well-Microplate-basierte P...

Hämatopoese ist der Prozess, bei dem verschiedene Arten von reifen Blutzellen mit hochspezialisierten Funktionen aus HSCs1 gebildet werden. HSCs sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und in verschiedene multipotente und linienspezifische Vorläuferpopulationen zu differenzieren. Diese Vorläufer produzieren letztendlich Zellen von lymphatischen, myeloischen, erythroiden und Megakaryozytenlinien. Um ihre Selbsterneuerungskapazität aufrechtzuerhalten, bleiben HSCs weitgehend ruhig und es wird angenommen, dass sie, wie andere Gewebestammzellen, auf Glykolyse und nicht auf mitochondriales OxPHOS für die ATP-Produktion angewiesen sind 2,3. Der Eintritt in den Zellzyklus führt zu einer verbesserten Atmung und OxPHOS, was zu erhöhten Werten an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führt, die sich nachteilig auf die HSC-Aufrechterhaltung und -Funktionauswirken 3. Eine wiederholte Zellteilung kann daher zu einer verminderten Selbsterneuerungskapazität von HSCs und letztlich zu deren Erschöpfung führen.
Bei der adulten Hämatopoese durchlaufen HSCs hauptsächlich eine asymmetrische Zellteilung, bei der eine der Tochterzellen das HSC-Potenzial behält und weiterhin auf den glykolytischen Stoffwechsel angewiesen ist. Die andere Tochterzelle wird zu einer primitiven Vorläuferzelle, die die Selbsterneuerungsfähigkeit verliert, sich aber vermehrt und schließlich zu differenzierten funktionellen hämatopoetischen Zellen führt4. Wenn HSCs differenzieren, um nachgeschaltete Vorläufer zu produzieren, wird angenommen, dass ein Wechsel von der Glykolyse zum mitochondrialen Stoffwechsel erfolgt, um die Energie und die Bausteine zu liefern, die zur Unterstützung dieses schnellen Übergangs benötigt werden5, wie die Beobachtungen nahelegen, dass HSCs inaktive mitochondriale Massebesitzen 6,7,8,9 . Im Gegensatz dazu ist die mitochondriale Aktivität (angezeigt durch verknüpfte ROS-Spiegel) bei der Abstammung gebundenen Vorläufer viel höher als bei HSCs 9,10,11. Metabolische Veränderungen, die während des frühesten Schritts der Hämatopoese auftreten, deuten daher auf eine direkte und entscheidende Rolle der Mitochondrien bei der Regulierung des HSC-Schicksals hin.
Dysfunktionale Mitochondrien, die unter verschiedenen Stressbedingungen wie Alterung, Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit auftreten 12, können die HSC-Selbsterneuerungskapazität beeinträchtigen und ein Ungleichgewicht in der HSC / Vorläuferdifferenzierung induzieren, indem sie übermäßige Mengen an ROS produzieren, die ATP-Produktion beeinträchtigen und / oder andere Stoffwechselprozesse verändern9,12,13 . Störungen in der metabolischen Homöostase bei der HSC/Vorläufer-Differenzierung könnten die Hämatopoese signifikant beeinflussen und möglicherweise zur Entwicklung hämatogischer Anomalien beitragen13. Angesichts der kritischen Einflüsse von Glykolyse und mitochondrialem OxPHOS auf die HSC-Stammheit und -Differenzierung ist es von Interesse, sowohl metabolische Parameter unter normalen als auch unter Stressbedingungen zu untersuchen. Wertvolle Einblicke in die glykolytische und mitochondriale Funktion von HSCs und Vorläuferzellen können durch die Bewertung ihrer ECAR und OCR gewonnen werden, die Indikatoren für die zelluläre Glykolyse bzw. die mitochondriale Atmung sind.
Der extrazelluläre Flussanalysator von Seahorse ist ein leistungsstarkes Gerät, das mit zwei Sonden pro Bohrung ausgestattet ist, um ECAR und OCR in lebenden Zellen gleichzeitig zu messen und somit zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in Echtzeit als Reaktion auf verschiedene Substrate oder Inhibitoren verwendet werden kann. Die mit dem Analysator verwendete Assay-Kartusche enthält Injektionsanschlüsse, um bis zu vier Medikamente für die automatisierte Injektion während des Assays aufzunehmen. Ein Schema eines typischen Glykolyse-Stresstests ist in Abbildung 1A dargestellt. Der Assay beginnt mit der Messung von ECAR von Zellen, die in Glykolyse-Stresstestmedium inkubiert werden, das Glutamin, aber nicht Glucose oder Pyruvat enthält. Dies stellt eine Versauerung dar, die aufgrund nicht-glykolytischer Aktivitäten der Zellen auftritt, und wird als nicht-glykolytische Versauerung berichtet. Es folgt die Injektion von Glukose in einer gesättigten Konzentration. Über die Glykolyse wird Glukose in der Zelle in Pyruvat umgewandelt, das im Zytoplasma weiter metabolisiert wird, um Laktat zu produzieren, oder in Mitochondrien, um CO 2 und Wasser zu produzieren.
Die Umwandlung von Glukose in Laktat verursacht eine Nettoproduktion und anschließende Freisetzung von Protonen in das extrazelluläre Medium, was zu einem raschen Anstieg des ECAR14,15,16 führt. Diese glukosestimulierte Veränderung der ECAR wird als Glykolyse unter basalen Bedingungen berichtet. Die zweite Injektion besteht aus Oligomycin (einem Inhibitor der ATP-Synthase, auch bekannt als Komplex V17), das die mitochondriale ATP-Produktion hemmt. Während der Oligomycin-vermittelten OxPHOS-Hemmung regulieren die Zellen die Glykolyse maximal, um ihren energetischen Bedarf zu decken. Dies führt zu einem weiteren Anstieg der ECAR, der die maximale glykolytische Kapazität der Zellen offenbart. Die Differenz zwischen der maximalen glykolytischen Kapazität und der basalen Glykolyse wird als glykolytische Reserve bezeichnet. Schließlich wird 2-DG injiziert, was zu einem signifikanten Rückgang der ECAR führt, in der Regel in der Nähe von nicht-glykolytischen Säuerungsgraden. 2-DG ist ein Glukoseanalogon, das kompetitiv an die Hexokinase bindet, was zu einer Hemmung der Glykolyse18 führt. Somit bestätigt die 2-DG-induzierte Abnahme der ECAR weiter, dass die Glykolyse tatsächlich die Quelle von ECAR ist, die nach Glukose- und Oligomycin-Injektionen beobachtet wurde.
Abbildung 1B zeigt den Schaltplan für einen typischen mitochondrialen Stresstest. Der Assay beginnt mit der OCR-Basismessung der Zellen, die in mitochondrialem Stresstestmedium, das Glukose, Glutamin und Pyruvat enthält, inkubiert werden. Nach basalen OCR-Messungen wird Oligomycin in diesen Assay injiziert, das den Komplex V hemmt und dadurch den Elektronenfluss durch die Elektronentransportkette (ETC) reduziert17. Folglich wird die OCR als Reaktion auf die Oligomycin-Injektion reduziert, und diese Abnahme der OCR ist mit der mitochondrialen ATP-Produktion verbunden. Die zweite Injektion besteht aus Carbonylcyanid-4 (Trifluormethoxy)-phenylhydrazon (FCCP), einem Protonophor und einem Entkoppler des mitochondrialen OxPHOS17. FCCP kollabiert den mitochondrialen Protonengradienten, indem es den Fluss von Protonen durch die mitochondriale innere Membran ermöglicht. Aufgrund der FCCP-Injektion wird der Elektronenfluss durch das ETC unterdrückt, und Komplex IV verbraucht Sauerstoff auf dem maximalen Niveau. Der Unterschied zwischen maximaler OCR und basaler OCR wird als freie Atemkapazität bezeichnet, die ein Maß für die Fähigkeit der Zelle ist, auf einen erhöhten Energiebedarf unter Stressbedingungen zu reagieren. Schließlich wird eine Mischung aus zwei ETC-Inhibitoren (Rotenon, ein Komplex-I-Inhibitor, und Antimycin A, ein Komplex-III-Inhibitor17) injiziert, wodurch der Elektronenfluss vollständig abgeschaltet wird, und die OCR sinkt auf ein niedriges Niveau. OCR, gemessen nach Rotenon und Antimycin A-Injektion entspricht einer nicht-mitochondrialen OCR, die durch andere Prozesse in den Zellen angetrieben wird. Die nicht-mitochondriale OCR ermöglicht die Berechnung der Basalatmung, des Protonenlecks und der maximalen Atmung.
Die Basalatmung stellt den Unterschied zwischen der Baseline-OCR und der nicht-mitochondrialen OCR dar. Protonenleck bezieht sich auf den Unterschied zwischen OCR nach Oligomycin-Injektion und nicht-mitochondrialer OCR. Die maximale Atmung stellt den Unterschied zwischen OCR nach FCCP-Injektion und nicht-mitochondrialer OCR dar. Die Kopplungseffizienz wird als Prozentsatz der ATP-Produktionsrate zur Basalatmungsrate berechnet. Dieses Methodenpapier enthält ein detailliertes Protokoll zur Messung von ECAR und OCR in liniennegativen HSPCs mit dem extrazellulären Flussanalysator Seahorse XFe96. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Isolierung von Mauslinien-negativen HSPCs, erklärt die Optimierung der Zellaussaatdichte und der Konzentrationen verschiedener Medikamente, die in extrazellulären Flussassays verwendet werden, und beschreibt medikamentöse Behandlungsstrategien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430626</td>
			<td>Used to filter-sterilize the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>3rd drug injection during glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Enrichment buffer (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480017</td>
			<td>Used for washings during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A661-3</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>2nd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive. Used for coating cell microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O2793-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Used as cells strainer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26400044</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Used to wash cells after assay for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P235-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100103</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100243</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100603</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108403</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences now Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For ECAR and OCR measurments in real time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Prepared 1 N solution. Used for pH normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480015</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF prep station</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Used for non-CO2 37 &#176;C incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 extracellular FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100 or 102601-100</td>
			<td>Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading 
			drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer

Im stationären Zustand bleiben hämatopoetische Stammzellen (HSCs) weitgehend ruhig und es wird angenommen, dass sie überwiegend auf Glykolyse angewiesen sind, um ihren energetischen Bedarf zu decken. Unter Stressbedingungen wie Infektionen oder Blutverlust werden HSCs jedoch proliferativ und produzieren schnell nachgeschaltete Vorläuferzellen, die sich wiederum weiter differenzieren und schließlich reife Blutzellen produzieren. Während dieses Übergangs- und Differenzierungsprozesses verlassen HSCs die Ruhephase und durchlaufen schnell einen metabolischen Wechsel von der Glykolyse zur oxidativen Phosphorylierung (OxPHOS). Verschiedene Stresszustände wie Alterung, Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit können sich negativ auf die mitochondriale Funktion auswirken und somit die metabolische Reprogrammierung und Differenzierung von HSCs und Vorläufern während der Hämatopoese verändern. Wertvolle Einblicke in die glykolytischen und mitochondrialen Funktionen von HSCs und Vorläufern unter Normal- und Stressbedingungen können durch die Beurteilung ihrer extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) und Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gewonnen werden, die Indikatoren für die zelluläre Glykolyse bzw. die mitochondriale Atmung sind. 
Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Messung von ECAR und OCR in Mausknochenmark-abgeleiteten liniennegativen Zellpopulationen bereitgestellt, die sowohl hämatopoetische Stamm- als auch primitive Vorläuferzellen (HSPCs) umfassen, mit dem extrazellulären Flussanalysator. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Isolierung von liniennegativen Zellen aus dem Knochenmark der Maus, erklärt die Optimierung der Zellaussaatdichte und der Konzentrationen von 2-Desoxy-D-Glukose (2-DG, ein Glukoseanalogon, das die Glykolyse hemmt) und verschiedener OxPHOS-zielgerichteter Medikamente (Oligomycin, FCCP, Rotenon und Antimycin A), die in diesen Assays verwendet werden, und beschreibt medikamentöse Behandlungsstrategien. Schlüsselparameter des glykolytischen Flusses, wie Glykolyse, glykolytische Kapazität und glykolytische Reserve, und OxPHOS-Parameter wie Basalatmung, maximale Atmung, Protonenleck, ATP-Produktion, freie Atemkapazität und Kopplungseffizienz können in diesen Assays gemessen werden. Dieses Protokoll ermöglicht ECAR- und OCR-Messungen an nicht adhärenten HSPCs und kann verallgemeinert werden, um die Analysebedingungen für jede Art von Suspensionszellen zu optimieren.

Mit diesem Protokoll wurden die Zellzahl und die Konzentrationen verschiedener OxPHOS-Targeting-Medikamente (die in den extrazellulären Flussassays verwendet werden) optimiert, um ECAR und OCR von HSPCs zu messen, die aus 24 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen isoliert wurden. Zunächst wurde der Glykolyse-Stresstest durchgeführt, um die Zellzahl und die Oligomycinkonzentration zu optimieren. In diesem Assay wurde eine unterschiedliche Anzahl von HSPCs pro Bohrloch im Bereich von 5 × 104 bis 2,5 × 10<s...

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Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Während der Hämatopoese durchlaufen hämatopoetische Stammzellen einen metabolischen Wechsel von der Glykolyse zur oxidativen Phosphorylierung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um glykolytische und mitochondriale Funktionen von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen der Maus zu beurteilen. Mit dieser Methode kann die zelluläre Bioenergetik in Echtzeit beurteilt werden.Die 96-Well-Microplate-basierte Plattform bietet eine Quantifizierung mit hohem Durchsatz und hoher Empfindlichkeit, die die gleichzeitige Analyse mehrerer Proben mit einer einzigen Platte ermöglicht. Diese Technik kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Chemikalien oder genetischen Manipulationen auf den HSC-Stoffwechsel unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen. Es kann helfen, Stoffwechselwege aufzuklären, die die HSC-Pluripotenz aufrechterhalten.Obwohl sich die aktuelle Studie hauptsächlich auf hämatopoetische Stämme und Vorläuferzellen der Maus konzentriert, könnten das Protokoll und dieser Ansatz leicht angepasst werden, um die Analysebedingungen für jede Art von Suspensionszellen zu optimieren. Öffnen Sie einen Tag vor dem Assay das extrazelluläre Flussmittel-Assay-Kit, um die Sensorkassette und die Utility-Plate-Baugruppe zu entfernen. Speichern Sie die Ladehilfswohnungen für die Verwendung am nächsten Tag.Trennen Sie nun die Sensorkassette manuell von der Utility-Platte und legen Sie sie kopfüber neben die Utility-Platte. Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette jede Vertiefung der Gebrauchsplatte mit 200 Mikrolitern Kalibrant, die im Lieferumfang des Flux-Assay-Kits enthalten sind, und legen Sie dann die Sensorpatrone wieder auf die Utility-Platte, wobei Sie sicherstellen, dass die Sensoren vollständig in das Kaliber eingetaucht sind. Dann inkubieren Sie die Gebrauchsplatte mit Kalibrant und montierte Sensorkartusche in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht nach den im Manuskript genannten Befeuchtungsbedingungen.Am Tag des Assays bereiten Sie 2,5 Milliliter der Zellklebelösung pro 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Öffnen Sie die 96-Well-Zellkultur-Mikroplatte, die im Lieferumfang des Flux-Assay-Kits enthalten ist, und dosieren Sie 25 Mikroliter der vorbereiteten Zellklebelösung am Boden jeder Vertiefung. Decken Sie die Mikrotiterplatte mit dem Deckel ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Haube.Entfernen und entsorgen Sie nach der Inkubation die überschüssige Zellklebelösung mit einer Mehrkanalpipette oder einem Aspirator und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 Mikrolitern sterilem Reinstwasser. Trocknen Sie die Platte ohne Deckel in der Kapuze 30 bis 45 Minuten an der Luft. Zentrifugieren Sie die vorbereiteten negativen HSPCs der Mauslinie bei 200 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Zellpellet in das entsprechende Assay-Medium und zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal und suspendieren Sie die Zellen im entsprechenden erwärmten Assay-Medium auf die Konzentration von 250.000 Zellen pro 50 Mikroliter oder fünf Millionen Zellen pro Milliliter. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter der Zellsuspension entlang der Seite jeder Vertiefung der mit Zellkleber beschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte hinzuzufügen, und fügen Sie dann 50 Mikroliter des Assay-Mediums in die Eck-Hintergrundmessquellen hinzu.Erstellen Sie eine Zentrifugenwaagplatte, indem Sie 50 Mikroliter Wasser pro Bohrloch einer unbeschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikroplatte hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für eine Minute bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Platte in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 25 bis 30 Minuten zur Zellbefestigung.Nach 30 Minuten unter dem Mikroskop visuell bestätigen, dass die Zellen stabil an der Mikroplattenoberfläche haften. Beginnen Sie mit der Vorbereitung aller erforderlichen Lösungen im vorerwärmten Glykolyse-Stresstestmedium, wie im Textmanuskript erwähnt, und entfernen Sie die hydratisierte Sensorkartusche aus dem Inkubator. Heben Sie die Sensorpatrone aus dem Kalibrant heraus und ersetzen Sie sie auf derselben Gebrauchsplatte mit dem Kalibrant, um die Luftblasen zu entfernen.Legen Sie die 80-Ladeführung flach auf die Oberseite der Sensorkassette und richten Sie sie so aus, dass sich der Buchstabe A in der oberen linken Ecke befindet. Dosieren Sie mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter 100-Millimollar-Glucoselösung in Port A.Ersetzen Sie die 80-Ladeführung flach durch die BC-Ladeführung flach und richten Sie den Buchstaben B in der oberen linken Ecke aus. Geben Sie 22 Mikroliter 20 mikromolare Oligomycinlösung in Port B ab.Richten Sie die BC-Ladeführung flach aus, um den Buchstaben C in der oberen linken Ecke für das Laden von Port C zu finden, und geben Sie 25 Mikroliter 500 millimolare 2-Desoxy-d-Glucoselösung in Port C ab.Dann entfernen und entsorgen Sie die Ladeführung flach.Erstellen oder laden Sie nun die Vorlage für den Glykolyse-Stresstest auf der Steuerung. Geben Sie die Details zu Injektionsstrategien, Behandlungsbedingungen und Zelltypen ein und klicken Sie auf Gruppen generieren. Gehen Sie zur Plattenkarte und weisen Sie jeder zu analysierenden Gruppe Vertiefungen zu.Stellen Sie im Protokoll sicher, dass Kalibrierung und Gleichgewicht im Initialisierungsschritt überprüft werden. Stellen Sie für die Basismessung und die Messungen nach jeder Injektion die Anzahl der Messzyklen auf drei ein und mischen, warten, messen Sie die Zeiten auf drei Minuten, null Minuten, drei Minuten. Klicken Sie in der Software auf Start Run.Entfernen Sie den Deckel von der mit Verbindungen beladenen und hydratisierten Sensorpatrone und legen Sie ihn auf das Arbeitsfach des extrazellulären Flussmittelanalysators. Starten Sie den Kalibrierungslauf. Nehmen Sie die Mikrotiterplatte mit den ausgesäten Zellen aus dem Inkubator.Ohne die Zellen zu stören, fügen Sie langsam 130 Mikroliter des vorgewärmten Glykolyse-Stresstestmediums pro Vertiefung hinzu, um das mittlere Volumen in jedem Vertiefungsraum auf 180 Mikroliter zu erhöhen, und bringen Sie die Platte für weitere 15 bis 20 Minuten in den Inkubator zurück. Klicken Sie in der Software auf Fach öffnen, um das Thermofach von Seahorse zu öffnen. Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, ersetzen Sie die Gebrauchsplatte durch diese Assay-Mikroplatte, die die Zellen enthält, und drücken Sie die Wägezellenplatte, um die Messungen zu starten.Entfernen Sie nach Abschluss der Messungen das Assay-Medium von der Platte, ohne die Zellen zu stören, und waschen Sie sie vorsichtig mit 250 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung, ohne die Zellen zu verdrängen. Geben Sie nun 10 Mikroliter Radioimmunpräzipitations-Lysepuffer, ergänzt mit 1X Protease-Inhibitor-Cocktail zu jeder Vertiefung und rühren Sie die Platte auf einem Shaker für 10 Minuten. Den ganzen Teller bei minus 80 Grad Celsius einfrieren.Tauen Sie die Platte auf und führen Sie einen Proteinmesstest zur Datennormalisierung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Rufen Sie die Daten ab und analysieren Sie sie, indem Sie die Datendatei mit der Wave-Desktop-Software öffnen. Klicken Sie auf Normalisieren, fügen Sie die Normalisierungswerte für jedes Bohrloch ein und klicken Sie dann auf Übernehmen, um die Daten zu normalisieren.Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie Glykolyse-Stresstest-Berichtsgenerator, um die analysierten Daten in einen Berichtsgenerator zu exportieren. Die nicht-glykolytische Ansäuerungsrate steigt mit zunehmender Zellzahl von 50.000 auf 250.000, steigt aber nur minimal zwischen 200.000 und 250.000. Die Injektion von 10 millimolarer Glukose stimuliert die Glykolyse bei allen Zellzahlen mit einem maximalen Anstieg der ECAR, der bei 250.000 Zellen pro Bohrung beobachtet wird.Die Injektion von zwei Mikromolaren Oligomycin erhöht ECAR jedoch nicht weiter. Die OCR-Daten, die in den gleichen Glykolyse-Stresstests erhalten wurden, zeigen einen signifikanten Abfall nach der Oligomycin-Injektion aufgrund der Komplex-5-Hemmung. Glykolyse-Stresstestparameter wurden berechnet und 250.000 Zellen pro Vertiefung in zwei Mikromolaren Oligomycin für weitere Studien ausgewählt.Der mitochondriale Stresstest zeigte, dass zwei mikromolare Oligomycin-Injektionen eine signifikante Reduktion der OCR über die Hemmung von Komplex 5 verursachen. FCCP stimuliert OCR in HSPCs in einer dosisabhängigen Weise mit einem maximalen Anstieg an zwei Mikromolaren. Eine Mischung aus 0,5 Mikromolar Rotenon und 0,5 Mikromolar Antimycin A Injektion senkt OCR auf ihr minimales Niveau, das dem nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch entspricht.Mitochondriale Stresstestparameter wurden berechnet und zwei Mikromolare FCCP wurden für weitere Studien ausgewählt. Angesichts des hohen Durchsatzcharakters dieser Technik könnte das hier beschriebene Protokoll leicht angepasst werden, um eine große Anzahl bioenergetischer Modulatoren in hämatopoetischen Stammzellen, hämatopoetischen Vorläuferzellen und bösartigen hämatopoetischen Zellen zu screenen. Die Seepferdchenanalyse wird in der Literatur häufig verwendet, um den Stoffwechsel in einer Vielzahl von Kontexten in Gegenwart verschiedener Substrate und Inhibitoren zu messen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Forschung

Biologie

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolierung, Charakterisierung und hohem Durchsatz extrazelluläre Flux-Analyse der Maus primäre renale tubuläre Epithelzellen

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...