Name: assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Il lavoro nel laboratorio lombardo è supportato dal NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 e ME200030) e Glenn Foundation for Medical Research. Il lavoro nel laboratorio Li è supportato da NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Tutti gli esperimenti sugli animali vertebrati sono stati approvati ed eseguiti in conformità con i regolamenti del Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università del Michigan.
1. Giorno prima del test (tempo totale: ~ 10 min)
<ol><li>Idratazione della cartuccia del sensore (tempo di passaggio: ~10 min)<ol>
<li>Aprire il kit di analisi del flusso extracellulare e rimuovere la cartuccia del sensore e il gruppo della piastra di utilità. Salva i piani guida di carico per utilizza...

<ol>
	<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis.">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+(HSPCs).">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li><li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging.">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells.">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux.">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li><li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells:+new+perspectives+and+opportunities.">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li><li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases.">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).</li><li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent:+mechanism+of+cell+death.">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li></ol>

Questo documento di metodo descrive un protocollo ottimizzato per la valutazione della bioenergetica cellulare (glicolisi e OxPHOS) negli HSPC di topo utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse. Questo dispositivo è un potente strumento che misura contemporaneamente l'ECAR e l'OCR delle cellule vive, che sono metriche della glicolisi e della respirazione mitocondriale, rispettivamente. Pertanto, può essere utilizzato per valutare la bioenergetica cellulare in tempo reale. Inoltre, la piattaforma basat...

L'ematopoiesi è il processo mediante il quale vari tipi di cellule del sangue mature con funzioni altamente specializzate sono formate da HSC1. Le HSC sono in grado di auto-rinnovarsi e differenziarsi in varie popolazioni progenitrici multipotenti e specifiche del lignaggio. Questi progenitori alla fine producono cellule di lignaggi linfoidi, mieloidi, eritroidi e megacariociti. Per mantenere la loro capacità di auto-rinnovamento, le HSC rimangono in gran parte quiescenti e, come altre cellule staminali tissutali, si ritiene che si basino sulla glicolisi piuttosto che sull'OxPHOS mitocondriale per la produzione di ATP 2,3. L'ingresso nel ciclo cellulare porta a una migliore respirazione e OxPHOS, con conseguenti livelli elevati di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che sono dannosi per il mantenimento e la funzione HSC3. La divisione cellulare ripetuta può quindi portare a una ridotta capacità di auto-rinnovamento delle HSC e, in definitiva, al loro esaurimento.
Nell'emopoiesi adulta, le HSC subiscono principalmente una divisione cellulare asimmetrica, durante la quale una delle cellule figlie mantiene il potenziale HSC e continua a fare affidamento sul metabolismo glicolitico. L'altra cellula figlia diventa una cellula progenitrice primitiva che perde la capacità di auto-rinnovamento ma prolifera e alla fine dà origine a cellule ematopoietiche funzionali differenziate4. Quando le HSC si differenziano per produrre progenitori a valle, si pensa che si verifichi un passaggio dalla glicolisi al metabolismo mitocondriale per fornire l'energia e gli elementi costitutivi necessari per supportare questa rapida transizione5, come suggerito dalle osservazioni che le HSC possiedono massa mitocondriale inattiva 6,7,8,9 . Al contrario, l'attività mitocondriale (indicata dai livelli di ROS collegati) è molto più alta nei progenitori impegnati nel lignaggio rispetto alle HSC 9,10,11. I cambiamenti metabolici che si verificano durante la prima fase dell'ematopoiesi suggeriscono quindi un ruolo diretto e cruciale dei mitocondri nella regolazione del destino HSC.
I mitocondri disfunzionali presenti in varie condizioni di stress, come l'invecchiamento, il cancro, il diabete e l'obesità12, possono interferire con la capacità di auto-rinnovamento HSC, inducendo uno squilibrio nella differenziazione HSC / progenitore producendo quantità eccessive di ROS, compromettendo la produzione di ATP e / o alterando altri processi metabolici 9,12,13 . Le perturbazioni nell'omeostasi metabolica nel differenziamento HSC/progenitore potrebbero avere un impatto significativo sull'ematopoiesi, contribuendo potenzialmente allo sviluppo di anomalie ematologiche13. Date le influenze critiche della glicolisi e dell'OxPHOS mitocondriale sulla staminalità e la differenziazione dell'HSC, è interessante studiare sia i parametri metabolici in condizioni normali che di stress. Preziose informazioni sulla funzione glicolitica e mitocondriale delle HSC e delle cellule progenitrici possono essere ottenute valutando la loro ECAR e OCR, che sono indicatori di glicolisi cellulare e respirazione mitocondriale, rispettivamente.
L'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse è un potente apparato dotato di due sonde per pozzo per misurare contemporaneamente ECAR e OCR in cellule vive e quindi può essere utilizzato per valutare la bioenergetica cellulare in tempo reale, in risposta a vari substrati o inibitori. La cartuccia di analisi utilizzata con l'analizzatore contiene porte di iniezione per contenere fino a quattro farmaci per l'iniezione automatica durante il test. Uno schema di un tipico test di stress della glicolisi è mostrato nella Figura 1A. Il test inizia con la misurazione dell'ECAR delle cellule, incubate in mezzo di prova da stress di glicolisi contenente glutammina ma non glucosio o piruvato. Ciò rappresenta l'acidificazione che si verifica a causa delle attività non glicolitiche delle cellule ed è riportata come acidificazione non glicolitica. Questo è seguito dall'iniezione di glucosio a una concentrazione saturante. Attraverso la glicolisi, il glucosio nella cellula viene convertito in piruvato, che viene ulteriormente metabolizzato nel citoplasma per produrre lattato, o nei mitocondri per produrre CO2 e acqua.
La conversione del glucosio in lattato provoca la produzione netta e il successivo rilascio di protoni nel mezzo extracellulare, con conseguente rapido aumento dell'ECAR 14,15,16. Questo cambiamento stimolato dal glucosio in ECAR è riportato come glicolisi in condizioni basali. La seconda iniezione consiste in oligomicina (un inibitore dell'ATP sintasi, noto anche come complesso V17), che inibisce la produzione mitocondriale di ATP. Durante l'inibizione dell'OxPHOS mediata dall'oligomicina, le cellule sovraregolano al massimo la glicolisi per soddisfare le loro esigenze energetiche. Ciò provoca un ulteriore aumento dell'ECAR, rivelando la massima capacità glicolitica delle cellule. La differenza tra la capacità glicolitica massima e la glicolisi basale è indicata come riserva glicolitica. Infine, viene iniettato 2-DG, che provoca un calo significativo dell'ECAR, di solito vicino ai livelli di acidificazione non glicolitica. 2-DG è un analogo del glucosio che si lega in modo competitivo all'esochinasi, con conseguente inibizione della glicolisi18. Pertanto, la diminuzione indotta da 2-DG nell'ECAR conferma ulteriormente che la glicolisi è effettivamente la fonte di ECAR osservata dopo iniezioni di glucosio e oligomicina.
La Figura 1B mostra lo schema per un tipico test di stress mitocondriale. Il test inizia con la misurazione OCR al basale delle cellule, incubate in mezzo di prova da stress mitocondriale contenente glucosio, glutammina e piruvato. A seguito di misurazioni OCR basali, l'oligomicina viene iniettata in questo test, che inibisce il complesso V, riducendo così il flusso di elettroni attraverso la catena di trasporto degli elettroni (ETC)17. Di conseguenza, l'OCR è ridotto in risposta all'iniezione di oligomicina e questa diminuzione dell'OCR è legata alla produzione mitocondriale di ATP. La seconda iniezione consiste in carbonile cianuro-4 (trifluorometossico) fenilidrazone (FCCP), un protonoforo e un disaccoppiatore di OxPHOS17 mitocondriale. FCCP collassa il gradiente protonico mitocondriale consentendo il flusso di protoni attraverso la membrana interna mitocondriale. A causa dell'iniezione FCCP, il flusso di elettroni attraverso l'ETC viene depresso e il complesso IV consuma ossigeno al massimo livello. La differenza tra OCR massimo e OCR basale è indicata come capacità respiratoria di riserva, che è una misura della capacità della cellula di rispondere all'aumento della domanda di energia in condizioni di stress. Infine, viene iniettata una miscela di due inibitori ETC (rotenone, un inibitore del complesso I e antimicina A, un inibitore del complesso III17), che arresta completamente il flusso di elettroni e l'OCR diminuisce a un livello basso. L'OCR misurato dopo l'iniezione di rotenone e antimicina A corrisponde all'OCR non mitocondriale guidato da altri processi all'interno delle cellule. L'OCR non mitocondriale consente il calcolo della respirazione basale, della perdita di protoni e della respirazione massima.
La respirazione basale rappresenta la differenza tra OCR basale e OCR non mitocondriale. La perdita di protoni si riferisce alla differenza tra oCR dopo iniezione di oligomicina e OCR non mitocondriale. La respirazione massima rappresenta la differenza tra oCR dopo iniezione di FCCP e OCR non mitocondriale. L'efficienza di accoppiamento è calcolata come percentuale del tasso di produzione di ATP rispetto alla frequenza di respirazione basale. Questo documento di metodo fornisce un protocollo dettagliato per misurare ECAR e OCR in HSPC negativi alla linea utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse XFe96. Questo protocollo descrive gli approcci per isolare gli HSPC negativi al lignaggio del topo, spiega l'ottimizzazione della densità di semina cellulare e delle concentrazioni di vari farmaci utilizzati nei saggi di flusso extracellulare e descrive le strategie di trattamento farmacologico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430626</td>
			<td>Used to filter-sterilize the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>3rd drug injection during glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Enrichment buffer (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480017</td>
			<td>Used for washings during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A661-3</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>2nd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive. Used for coating cell microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O2793-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Used as cells strainer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26400044</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Used to wash cells after assay for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P235-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100103</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100243</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100603</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108403</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences now Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For ECAR and OCR measurments in real time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Prepared 1 N solution. Used for pH normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480015</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF prep station</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Used for non-CO2 37 &#176;C incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 extracellular FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100 or 102601-100</td>
			<td>Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading 
			drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer

Allo stato stazionario, le cellule staminali ematopoietiche (HSC) rimangono in gran parte quiescenti e si ritiene che dipendano prevalentemente dalla glicolisi per soddisfare le loro esigenze energetiche. Tuttavia, in condizioni di stress come infezioni o perdita di sangue, le HSC diventano proliferative e producono rapidamente cellule progenitrici a valle, che a loro volta si differenziano ulteriormente, producendo infine cellule del sangue mature. Durante questo processo di transizione e differenziazione, le HSC escono dalla quiescenza e subiscono rapidamente un passaggio metabolico dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa (OxPHOS). Varie condizioni di stress, come l'invecchiamento, il cancro, il diabete e l'obesità, possono avere un impatto negativo sulla funzione mitocondriale e quindi possono alterare la riprogrammazione metabolica e la differenziazione delle HSC e dei progenitori durante l'ematopoiesi. Preziose informazioni sulle funzioni glicolitiche e mitocondriali di HSC e progenitori in condizioni normali e di stress possono essere ottenute attraverso la valutazione del loro tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e del tasso di consumo di ossigeno (OCR), che sono indicatori di glicolisi cellulare e respirazione mitocondriale, rispettivamente. 
Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per misurare ECAR e OCR in popolazioni di cellule derivate dal midollo osseo di topo, che includono sia cellule staminali ematopoietiche che cellule progenitrici primitive (HSPC), utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. Questo protocollo descrive gli approcci per isolare le cellule negative al lignaggio dal midollo osseo del topo, spiega l'ottimizzazione della densità di semina cellulare e le concentrazioni di 2-deossi-D-glucosio (2-DG, un analogo del glucosio che inibisce la glicolisi) e vari farmaci mirati a OxPHOS (oligomicina, FCCP, rotenone e antimicina A) utilizzati in questi saggi e descrive le strategie di trattamento farmacologico. In questi saggi possono essere misurati i parametri chiave del flusso glicolitico, come la glicolisi, la capacità glicolitica e la riserva glicolitica e i parametri OxPHOS, come la respirazione basale, la respirazione massima, la perdita di protoni, la produzione di ATP, la capacità respiratoria di riserva e l'efficienza di accoppiamento. Questo protocollo consente misurazioni ECAR e OCR su HSPC non aderenti e può essere generalizzato per ottimizzare le condizioni di analisi per qualsiasi tipo di cella di sospensione.

Utilizzando questo protocollo, il numero di cellule e le concentrazioni di vari farmaci mirati a OxPHOS (utilizzati nei saggi di flusso extracellulare) sono stati ottimizzati per misurare ECAR e OCR di HSPC isolati da topi C57BL/6 di 24 settimane. In primo luogo, è stato eseguito il test di stress della glicolisi per ottimizzare il numero di cellule e la concentrazione di oligomicina. In questo test è stato utilizzato un numero variabile di HSPC per pozzo che va da 5 × 104 a2,5 × 10 5. Come most...

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Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Il metodo qui presentato riassume i protocolli ottimizzati per la valutazione della bioenergetica cellulare nelle cellule staminali ematopoietiche non aderenti del topo e nelle cellule progenitrici primitive (HSPC) utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) degli HSPC in tempo reale.

Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Durante l'ematopoiesi, le cellule staminali ematopoietiche subiscono un passaggio metabolico dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare le funzioni glicolitiche e mitocondriali delle cellule staminali ematopoietiche del topo e delle cellule progenitrici. Questo metodo può essere utilizzato per valutare la bioenergetica cellulare in tempo reale.La piattaforma basata su micropiastre a 96 pozzetti offre una quantificazione ad alta produttività con elevata sensibilità, consentendo l'analisi simultanea di più campioni utilizzando una singola piastra. Questa tecnica può essere utilizzata per sondare gli effetti di sostanze chimiche o manipolazioni genetiche sul metabolismo HSC in varie condizioni. Può aiutare a chiarire le vie metaboliche che sostengono la pluripotenza HSC.Sebbene l'attuale studio si concentri principalmente su staminali ematopoietiche di topo e cellule progenitrici, il protocollo e questo approccio potrebbero essere facilmente adattati per ottimizzare le condizioni di analisi per qualsiasi tipo di cellule in sospensione. Un giorno prima del test, aprire il kit di analisi del flusso extracellulare per rimuovere la cartuccia del sensore e il gruppo della piastra di utilità. Salvare i piani guida di carico per utilizzarli il giorno successivo.Ora separa manualmente la cartuccia del sensore dalla piastra dell'utilità e posizionala a testa in giù accanto alla piastra dell'utilità. Utilizzando una pipetta multicanale, riempire ogni pozzetto della piastra di utilità con 200 microlitri di calibrante inclusi nel kit di analisi del flusso, quindi riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità, assicurandosi di immergere completamente i sensori nel calibrante. Quindi incubare la piastra di utilità con calibrante e cartuccia sensore assemblata in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius durante la notte seguendo le condizioni di umidificazione menzionate nel manoscritto.Il giorno del test, preparare 2,5 millilitri della soluzione adesiva cellulare per micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti come descritto nel manoscritto di testo. Aprire la micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti inclusa nel kit di analisi del flusso ed erogare 25 microlitri della soluzione adesiva cellulare preparata sul fondo di ciascun pozzetto. Coprire la micropiastra con il coperchio e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente all'interno della cappa.Dopo l'incubazione, rimuovere e scartare la soluzione adesiva cellulare in eccesso utilizzando una pipetta multicanale o un aspiratore e lavare ogni pozzetto due volte con 200 microlitri di acqua ultrapura sterile. Asciugare all'aria la piastra senza il coperchio all'interno del cappuccio per 30-45 minuti. Centrifugare gli HSPC negativi del lignaggio del topo preparati a 200 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.Dopo aver scartato il surnatante, risospesere il pellet cellulare nel mezzo di saggio appropriato e nuovamente centrifugare la sospensione cellulare. Ripetere questa procedura ancora una volta e risospese le cellule nel mezzo di saggio riscaldato appropriato alla concentrazione di 250.000 cellule per 50 microlitri o cinque milioni di cellule per millilitri. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri della sospensione cellulare lungo il lato di ciascun pozzetto della micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti rivestita con adesivo cellulare, quindi aggiungere 50 microlitri del mezzo di saggio nei pozzetti di misurazione di fondo angolari.Creare una piastra di bilanciamento centrifuga aggiungendo 50 microlitri di acqua per pozzetto di una micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti non rivestita. Centrifugare le celle a 200 volte G per un minuto a temperatura ambiente. Incubare la piastra in un incubatore non di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 25-30 minuti per l'attacco cellulare.Dopo 30 minuti, confermare visivamente al microscopio che le cellule sono stabilmente aderenti alla superficie della micropiastra. Iniziare preparando tutte le soluzioni necessarie nel mezzo di analisi del test di stress di glicolisi preriscaldato come menzionato nel manoscritto di testo e rimuovere la cartuccia del sensore idrato dall'incubatore. Sollevare la cartuccia del sensore dal calibrante e sostituirla sulla stessa piastra di utilità con il calibrante per rimuovere le bolle d'aria.Posizionare la guida di caricamento 80 piatta sulla parte superiore della cartuccia del sensore orientandola in modo che la lettera A si trovi nell'angolo in alto a sinistra. Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 20 microlitri di soluzione di glucosio da 100 millimolari nella porta A.Sostituire la guida di carico piatta 80 con la guida di carico BC piatta, orientando la lettera B nell'angolo in alto a sinistra. Erogare 22 microlitri di 20 micromolari soluzione di oligomicina nella porta B.Riorientare la guida di carico BC piatta per individuare la lettera C nell'angolo in alto a sinistra per la porta di carico C ed erogare 25 microlitri di 500 millimolari soluzione 2-deossi-d-glucosio nella porta C.Quindi rimuovere e scartare i piatti della guida di carico.Ora crea o carica il modello per il test di stress della glicolisi sul controller. Immettere i dettagli relativi alle strategie di iniezione, alle condizioni di trattamento e ai tipi di cellule e premere Genera gruppi. Vai alla mappa della piastra e assegna i pozzetti a ciascun gruppo da analizzare.Nel protocollo, assicurarsi che la calibrazione e l'equilibrio siano controllati nella fase di inizializzazione. Per la misurazione e le misurazioni di base dopo ogni iniezione, impostare il numero di cicli di misurazione su tre e mescolare, attendere, misurare i tempi a tre minuti, zero minuti, tre minuti. Fare clic su Avvia esecuzione sul software.Rimuovere il coperchio dalla cartuccia del sensore caricata e idratata e posizionarla sul vassoio di lavoro dell'analizzatore di flusso extracellulare. Iniziare l'esecuzione della calibrazione. Estrarre la micropiastra contenente le cellule seminate dall'incubatrice.Senza disturbare le cellule, aggiungere lentamente 130 microlitri del mezzo di prova della glicolisi preriscaldato per pozzetto per comporre il volume medio in ciascun pozzetto a 180 microlitri e restituire la piastra all'incubatore per altri 15-20 minuti. Fare clic su Apri vassoio sul software per aprire il vassoio termico di Seahorse. Al termine della calibrazione, sostituire la piastra di utilità con questa micropiastra di analisi contenente le celle e premere la piastra della cella di carico per avviare le misurazioni.Al termine delle misurazioni, rimuovere il mezzo di saggio dalla piastra senza disturbare le cellule e lavarle delicatamente con 250 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato senza spostare le cellule. Ora aggiungi 10 microlitri di tampone di lisi di radioimmunoprecipitazione integrato con 1X cocktail inibitore della proteasi a ciascun pozzetto e agita la piastra su uno shaker per 10 minuti. Congelare l'intera piastra a meno 80 gradi Celsius.Scongelare la piastra ed eseguire un test di misurazione delle proteine per la normalizzazione dei dati seguendo le istruzioni del produttore. Recupera e analizza i dati aprendo il file di dati utilizzando il software desktop Wave. Fare clic su Normalizza, incollare i valori di normalizzazione per ciascun pozzetto e quindi fare clic su Applica per normalizzare i dati.Fare clic su Esporta e selezionare il generatore di report di stress test di glicolisi per esportare i dati analizzati in un generatore di report. Il tasso di acidificazione non glicolitica aumenta con l'aumento del numero di cellule da 50.000 a 250.000, ma aumenta solo in minima parte tra 200.000 e 250.000. L'iniezione di glucosio 10 millimolare stimola la glicolisi a tutti i numeri di cellule con un aumento massimo di ECAR osservato a 250.000 cellule per pozzetto.Tuttavia, l'iniezione di due micromolari di oligomicina non aumenta ulteriormente l'ECAR. I dati OCR ottenuti nella stessa serie di test di stress della glicolisi mostrano un calo significativo dopo l'iniezione di oligomicina a causa dell'inibizione del complesso 5. Sono stati calcolati i parametri del test di stress della glicolisi e sono state selezionate 250.000 cellule per pozzetto in due micromolari di oligomicina per ulteriori studi.Lo stress test mitocondriale ha dimostrato che l'iniezione di oligomicina micromolare provoca una significativa riduzione dell'OCR attraverso l'inibizione del complesso 5. FCCP stimola l'OCR negli HSPC in modo dose-dipendente con un aumento massimo osservato a due micromolari. Una miscela di 0,5 micromolari rotenone e 0,5 micromolari antimicina A iniezione riduce l'OCR al suo livello minimo corrispondente al consumo di ossigeno non mitocondriale.Sono stati calcolati i parametri della prova di stress mitocondriale e due micromolari di FCCP sono stati selezionati per ulteriori studi. Data la natura ad alto rendimento di questa tecnica, il protocollo qui descritto potrebbe essere facilmente adattato per lo screening di un gran numero di modulatori bioenergetici in cellule staminali ematopoietiche, progenitori ematopoietici e cellule ematopoietiche maligne. L'analisi del cavalluccio marino è ampiamente utilizzata in letteratura per misurare il metabolismo in un'ampia varietà di contesti in presenza di vari substrati e inibitori.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

Ricerca

Biologia

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolamento, caratterizzazione e Throughput elevato flusso extracellulare analisi di cellule epiteliali tubolari renali primari del Mouse

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...