Name: assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

ロンバード研究所での研究は、NIH(NIGMS R01GM101171、NIEHS R21ES032305)、国防総省(CA190267、CA170628、NF170044、ME200030)、およびGlenn Foundation for Medical Researchによってサポートされています。李研究室での作業はNIH(NHLBI 5R01HL150707)によってサポートされています。

すべての脊椎動物実験は、ミシガン大学動物の使用および世話に関する委員会の規則に従って承認され、実施された。
アッセイ前日(合計時間:〜10分)
<ol><li>センサーカートリッジの水分補給(ステップ時間:〜10分)<ol>
<li>細胞外フラックスアッセイキットを開き、センサーカートリッジとユーティリティプレートアセンブリを取り外します。翌日に使用するためにローデ?...

<ol>
	<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis.">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+(HSPCs).">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li><li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging.">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells.">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux.">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li><li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells:+new+perspectives+and+opportunities.">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li><li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases.">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).</li><li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent:+mechanism+of+cell+death.">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li></ol>

この方法論文は、タツノオトシゴ細胞外フラックス分析装置を用いてマウスHSPCにおける細胞生体エネルギー学(解糖系およびOxPHOS)の評価のための最適化されたプロトコールを記載している。この装置は、解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標である生細胞のECARおよびOCRを同時に測定する強力なツールである。したがって、細胞生体エネルギー学をリアルタイムで評価するために使用するこ...

造血は、高度に専門化された機能を有する様々なタイプの成熟血液細胞がHSCs1から形成されるプロセスである。HSCは、自己複製および様々な多能性および系統特異的な前駆集団への分化が可能である。これらの前駆細胞は、最終的にリンパ系、骨髄系、赤血球系、および巨核球系譜の細胞を産生する。自己複製能力を維持するために、HSCは大部分が静止したままであり、他の組織幹細胞と同様に、ATP産生のためにミトコンドリアOxPHOSではなく解糖系に依存すると考えられている2,3。細胞周期に入ると、呼吸とOxPHOSが増強され、HSCの維持と機能に有害な活性酸素種(ROS)のレベルが上昇します3。したがって、細胞分裂を繰り返すと、HSCの自己複製能力が低下し、最終的には枯渇する可能性があります。
成体造血では、HSCは主に非対称細胞分裂を受け、その間、娘細胞の1つがHSC電位を保持し、解糖系代謝に依存し続ける。もう一方の娘細胞は、自己複製能を失うが増殖し、最終的に分化した機能造血細胞4を生じさせる原始前駆細胞となる。HSCが分化して下流の祖先を産生すると、HSCが不活性なミトコンドリア塊を有するという観察によって示唆されるように、解糖系からミトコンドリア代謝への切り替えが起こると考えられている5、HSCが不活性なミトコンドリア塊6、7、8、9.対照的に、ミトコンドリア活性(リンクされたROSレベルによって示される)は、HSCs9、10、11よりも系統コミットされた前駆細胞においてはるかに高い。したがって、造血の初期段階で起こる代謝変化は、HSCの運命を調節する上でのミトコンドリアの直接的かつ重要な役割を示唆している。
老化、癌、糖尿病、肥満などの様々なストレス条件下で存在する機能不全のミトコンドリア12は、HSCの自己複製能力を妨害し、過剰な量のROSを産生し、ATP産生を損ない、および/または他の代謝プロセスを変化させることによってHSC/前駆分化の不均衡を誘発する可能性がある9,12,13.HSC/前駆分化における代謝恒常性における摂動は、造血に重大な影響を及ぼし、血液学的異常の発症に寄与する可能性がある13。解糖系およびミトコンドリアOxPHOSがHSCのステムネスおよび分化に及ぼす重大な影響を考えると、正常およびストレス条件下で両方の代謝パラメータを調査することが興味深い。HSCおよび前駆細胞の解糖系およびミトコンドリア機能に関する貴重な洞察は、細胞の解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標であるECARおよびOCRをそれぞれ評価することによって得ることができる。
タツノオトシゴ細胞外フラックス分析計は、生細胞中のECARおよびOCRを同時に測定するためにウェルあたり2つのプローブを備えた強力な装置であり、したがって、様々な基質または阻害剤に応答して、細胞の生体エネルギーをリアルタイムで評価するために使用することができる。分析装置で使用されるアッセイカートリッジには、アッセイ中に自動注入用の最大 4 つの薬物を保持する注入ポートが含まれています。典型的な解糖系ストレス試験のスキームを 図1Aに示す。アッセイは、グルコースまたはピルビン酸を含まないグルタミンを含む解糖系ストレス試験培地中でインキュベートした細胞のECARの測定から始まる。これは、細胞の非解糖系活性のために起こる酸性化を表し、非解糖系酸性化として報告されている。これに続いて、飽和濃度でのグルコースの注射が続く。解糖系を介して、細胞内のグルコースはピルビン酸に変換され、これはさらに細胞質内で代謝されて乳酸塩を生成し、またはミトコンドリア内でCO2 および水を生成する。
グルコースから乳酸への変換は、細胞外培地へのプロトンの正味産生およびその後の放出を引き起こし、その結果、ECAR14、15、16の急速な増加をもたらす。ECARにおけるこのグルコース刺激変化は、基礎条件下で解糖系として報告される。2回目の注射は、ミトコンドリアATP産生を阻害するオリゴマイシン(ATP合成酵素、別名複合体V17の阻害剤)からなる。オリゴマイシン媒介性OxPHOS阻害の間、細胞は解糖系を最大限アップレギュレートして、その精力的要求を満たす。これはECARのさらなる増加を引き起こし、細胞の最大解糖系能力を明らかにする。最大解糖系容量と基礎解糖系との差を解糖系予備量と呼ぶ。最後に、2-DGが注入され、これはECARの有意な低下を引き起こし、通常は非解糖系酸性化レベルに近い。2-DGは、ヘキソキナーゼに競合的に結合し、解糖系18の阻害をもたらすグルコース類似体である。したがって、ECARの2-DG誘導性減少は、解糖系が実際にグルコースおよびオリゴマイシン注射後に観察されるECARの供給源であることをさらに確認する。
図1B は、典型的なミトコンドリアストレス試験の概略を示す。アッセイは、細胞のベースラインOCR測定から始まり、グルコース、グルタミン、およびピルビン酸を含むミトコンドリアストレス試験培地中でインキュベートする。基礎OCR測定に続いて、このアッセイにおいてオリゴマイシンが注入され、これは錯体Vを阻害し、それによって電子輸送鎖(ETC)を通る電子流を減少させる17。その結果、オリゴマイシン注射に応答してOCRが減少し、このOCRの減少がミトコンドリアATP産生と関連している。2回目の注射は、カルボニルシアン化物-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)、プロトノフォアおよびミトコンドリアOxPHOS17のアンカプラーからなる。FCCPは、ミトコンドリア内膜を横切るプロトンの流れを可能にすることによってミトコンドリアプロトン勾配を崩壊させる。FCCP注入のために、ETCを通る電子流は抑制されず、錯体IVは最大レベルで酸素を消費する。最大OCRと基礎OCRの差は予備呼吸能力と呼ばれ、ストレス条件下でのエネルギー需要の増加に応答する細胞の能力の尺度である。最後に、2つのETC阻害剤(ロテノン、複合体I阻害剤、およびアンチマイシンA、複合体III阻害剤17)の混合物が注入され、電子の流れが完全に遮断され、OCRは低レベルに低下する。ロテノンおよびアンチマイシンA注射後に測定されたOCRは、細胞内の他のプロセスによって駆動される非ミトコンドリアOCRに対応する。非ミトコンドリアOCRは、基礎呼吸、陽子漏れ、および最大呼吸の計算を可能にします。
基礎呼吸は、ベースラインOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を表す。プロトンリークは、オリゴマイシン注射後のOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を指す。最大呼吸は、FCCP注射後のOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を表す。結合効率は、基礎呼吸数に対するATP生産率の割合として計算される。この方法論文は、タツノオトシゴXFe96細胞外フラックス分析装置を使用して系統陰性HSPC中のECARおよびOCRを測定するための詳細なプロトコルを提供する。このプロトコールは、マウス系統陰性HSPCを単離するためのアプローチを説明し、細胞播種密度および細胞外フラックスアッセイで使用される様々な薬物の濃度の最適化を説明し、薬物治療戦略を説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430626</td>
			<td>Used to filter-sterilize the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>3rd drug injection during glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Enrichment buffer (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480017</td>
			<td>Used for washings during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A661-3</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>2nd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive. Used for coating cell microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O2793-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Used as cells strainer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26400044</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Used to wash cells after assay for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P235-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100103</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100243</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100603</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108403</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences now Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For ECAR and OCR measurments in real time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Prepared 1 N solution. Used for pH normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480015</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF prep station</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Used for non-CO2 37 &#176;C incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 extracellular FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100 or 102601-100</td>
			<td>Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading 
			drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer

定常状態では、造血幹細胞(HSC)は大部分が静止したままであり、そのエネルギー的ニーズを満たすために主に解糖系に依存していると考えられている。しかし、感染や失血などのストレス条件下では、HSCは増殖性になり、下流の前駆細胞を急速に産生し、それがさらに分化し、最終的に成熟した血液細胞を産生する。この移行および分化プロセスの間、HSCは静止から終了し、解糖系から酸化的リン酸化(OxPHOS)への代謝スイッチを急速に受ける。加齢、癌、糖尿病、肥満などの様々なストレス状態は、ミトコンドリア機能に悪影響を及ぼす可能性があり、したがって、造血中のHSCおよび前駆細胞の代謝リプログラミングおよび分化を変化させる可能性がある。HSCおよび前駆細胞の正常およびストレス条件下での解糖系およびミトコンドリア機能に関する貴重な洞察は、それぞれ細胞解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標である細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)の評価を通じて得ることができる。 
ここでは、細胞外フラックス分析装置を使用して、造血幹細胞および原始前駆細胞(HSPC)の両方を含むマウス骨髄由来系統陰性細胞集団におけるECARおよびOCRを測定するための詳細なプロトコールが提供される。このプロトコールは、マウス骨髄から系統陰性細胞を単離するためのアプローチを説明し、細胞播種密度および2-デオキシ-D-グルコース(2-DG、解糖系を阻害するグルコース類似体)およびこれらのアッセイで使用される様々なOxPHOS標的薬物(オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、およびアンチマイシンA)の濃度を説明し、薬物治療戦略を説明する。解糖系、解糖系容量、解糖系予備量などの解糖系フラックスの主要なパラメータと、基礎呼吸、最大呼吸、プロトン漏れ、ATP産生、予備呼吸能力、カップリング効率などのOxPHOSパラメータは、これらのアッセイで測定できます。このプロトコルは、非付着性HSPCのECARおよびOCR測定を可能にし、あらゆるタイプの浮遊細胞の分析条件を最適化するために一般化することができます。

このプロトコールを使用して、細胞数および様々なOxPHOS標的薬(細胞外フラックスアッセイに使用)の濃度を最適化し、24週齢の雌C57BL/6マウスから単離されたHSPCのECARおよびOCRを測定した。まず、細胞数およびオリゴマイシン濃度を最適化するために解糖系ストレス試験を行った。このアッセイでは、5 ~104 ~ 2.5 × 105 の範囲のウェルあたりのさまざまな数のHSPC×使用しました。図...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

ここで提示された方法は、HSPCの細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)をリアルタイムで測定するために、細胞外フラックス分析装置を使用して、非付着性マウス造血幹および原始前駆細胞(HSPC)における細胞生体エネルギーを評価するための最適化されたプロトコルを要約する。

細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

造血中、造血幹細胞は解糖系から酸化的リン酸化への代謝スイッチを受ける。このプロトコルは、マウス造血幹および前駆細胞の解糖系およびミトコンドリア機能を評価するために使用することができる。この方法は、細胞の生体エネルギーをリアルタイムで評価するために使用することができる。96ウェルマイクロプレートベースのプラットフォームは、高感度で高スループット定量を提供し、単一のプレートを使用して複数のサンプルを同時に分析することができます。この技術は、様々な条件下でのHSC代謝に対する化学物質または遺伝子操作の影響を調査するために使用することができる。HSCの多能性を維持する代謝経路の解明に役立つ可能性があります。現在の研究は主にマウス造血幹細胞と前駆細胞に焦点を当てていますが、プロトコルとこのアプローチは、あらゆる種類の浮遊細胞の分析条件を最適化するために容易に適応させることができます。アッセイの1日前に、細胞外フラックスアッセイキットを開き、センサーカートリッジおよびユーティリティプレートアセンブリを取り外します。翌日に使用するためにローディングガイドフラットを保存します。次に、センサーカートリッジをユーティリティプレートから手動で分離し、ユーティリティプレートの横に逆さまに置きます。マルチチャンネルピペットを使用して、フラックスアッセイキットに付属の200マイクロリットルのキャリブラントでユーティリティプレートの各ウェルを満たし、センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻して、センサーをキャリブラントに完全に沈めてください。次に、ユーティリティプレートをキャリブラントでインキュベートし、センサーカートリッジを非二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートし、原稿に記載されている加湿条件に従います。アッセイ当日に、本文原稿に記載されているように96穴細胞培養マイクロプレートあたり2.5ミリリットルの細胞接着溶液を調製する。フラックスアッセイキットに付属の96ウェル細胞培養マイクロプレートを開き、調製した細胞接着溶液25マイクロリットルを各ウェルの底に分注する。マイクロプレートを蓋で覆い、フード内で室温で30分間インキュベートする。インキュベーション後、マルチチャンネルピペットまたはアスピレーターを使用して余分な細胞接着溶液を取り出して廃棄し、各ウェルを200マイクロリットルの滅菌超純水で2回洗浄する。フード内部の蓋なしでプレートを30〜45分間空気乾燥させます。調製したマウス系統陰性HSPCsを室温で5分間Gで200倍で遠心分離する。上清を捨てた後、細胞ペレットを適当なアッセイ培地に再懸濁し、細胞懸濁液を再度遠心分離する。この手順をもう一度繰り返し、細胞を適切な加温アッセイ培地に再懸濁して、50マイクロリットルあたり250,000細胞または1ミリリットルあたり500万細胞の濃度にします。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞接着コーティングされた96ウェル細胞培養マイクロプレートの各ウェルの側面に沿って50マイクロリットルの細胞懸濁液を添加し、次いで50マイクロリットルのアッセイ培地をコーナーバックグラウンド測定ウェルに加える。コーティングされていない96ウェル細胞培養マイクロプレートのウェルあたり50マイクロリットルの水を加えて遠心分離機バランスプレートを作成する。細胞を室温で1分間、Gの200倍で遠心分離する。プレートを摂氏37度の非二酸化炭素インキュベーターで25〜30分間インキュベートし、細胞付着させる。30分後、細胞がマイクロプレート表面に安定に接着していることを顕微鏡下で目視で確認した。まず、本文原稿に記載されているように、予め加温した解糖系ストレス試験アッセイ培地に必要なすべての溶液を調製し、水和センサーカートリッジをインキュベーターから取り出します。センサーカートリッジを持ち上げてキャリブラントから取り出し、キャリブラントと同じユーティリティプレートに取り付けて気泡を取り除きます。80 ローディング・ガイドをセンサー・カートリッジの上部に平らに置き、文字 A が左上隅に位置するように向きを変えます。マルチチャンネルピペットを使用して、ポートAに20マイクロリットルの100ミリモルグルコース溶液を分配します.80ローディングガイドフラットをBCローディングガイドフラットに交換し、左上隅の文字Bを方向付けます。ポートBに20マイクロモルのオリゴマイシン溶液22マイクロリットルを分注する.BCローディングガイドフラットの向きを変えて、ポートCの左上隅にある文字Cを見つけ、ポートCに25マイクロリットルの500ミリモル2-デオキシ-d-グルコース溶液を分配します。次に、解糖系ストレステストのテンプレートを作成またはコントローラーに読み込みます。注射戦略、治療条件、および細胞タイプに関する詳細を入力し、「グループの生成」を押します。プレートマップに移動し、分析する各グループにウェルを割り当てます。プロトコルで、初期化ステップでキャリブレーションと平衡化がチェックされていることを確認します。ベースライン測定および各注射後の測定については、測定サイクル数を3に設定し、混合、待機、測定時間を3分、0分、3分に混合する。ソフトウェアで[実行の開始]をクリックします。コンパウンドを装填し、水和させたセンサーカートリッジから蓋を取り外し、細胞外フラックス分析装置の作業トレイに置きます。キャリブレーションの実行を開始します。播種した細胞を入れたマイクロプレートをインキュベーターから取り出します。細胞を乱すことなく、ウェルあたり130マイクロリットルの加温前解糖ストレス試験アッセイ培地をゆっくりと加えて、各ウェルの培地容量を180マイクロリットルにし、プレートをさらに15〜20分間インキュベーターに戻します。ソフトウェアの [トレイを開く] をクリックして、タツノオトシゴのサーマルトレイを開きます。校正が終了したら、ユーティリティプレートをセルを含むこのアッセイマイクロプレートと交換し、ロードセルプレートを押して測定を開始します。測定が終わったら、細胞を乱すことなくアッセイ培地をプレートから取り出し、細胞を脱落させることなく250マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で穏やかに洗浄する。次に、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した10マイクロリットルの放射免疫沈降溶解バッファーを各ウェルに追加し、シェーカー上でプレートを10分間攪拌する。プレート全体をマイナス80°Cで凍結します。プレートを解凍し、メーカーの指示に従ってデータ正規化のためのタンパク質測定アッセイを実行します。Waveデスクトップソフトウェアを使用してデータファイルを開いて、データを取得して分析します。[正規化]をクリックし、各ウェルの正規化値を貼り付け、[適用]をクリックしてデータを正規化します。[エクスポート]をクリックし、[解糖系ストレステストレポートジェネレータ]を選択して、分析データをレポートジェネレータにエクスポートします。非解糖系酸性化率は、細胞数が50, 000から250, 000に増加するにつれて上昇するが、200, 000から250, 000の間では最小限にしか増加しない。10ミリモルグルコースの注射は、すべての細胞数で解糖系を刺激し、1ウェルあたり250,000細胞で観察されるECARの最大増加を伴う。しかしながら、オリゴマイシンの2マイクロモルの注射は、ECARをさらに増加させない。解糖系ストレス試験の同じセットで得られたOCRデータは、複合体5阻害によるオリゴマイシン注射後の有意な低下を示す。解糖系ストレス試験パラメータを計算し、2マイクロモルのオリゴマイシン中のウェル当たり250,000個の細胞をさらなる研究のために選択した。ミトコンドリアストレス試験では、2マイクロモルオリゴマイシン注射が複合体5の阻害を介してOCRの有意な減少を引き起こすことを示した。FCCPは、HSPC中のOCRを用量依存的に刺激し、2マイクロモルで観察される最大の増加を伴う。0.5マイクロモルのロテノンと0.5マイクロモルのアンチマイシンA注射の混合物は、OCRを非ミトコンドリア酸素消費に対応する最小レベルまで減少させる。ミトコンドリアストレス試験パラメータを計算し、さらなる研究のためにFCCPの2マイクロモルを選択した。この技術のハイスループットの性質を考えると、ここで説明するプロトコルは、造血幹細胞、造血前駆細胞、および悪性造血細胞における多数の生体エネルギーモジュレーターをスクリーニングするために容易に適合させることができる。タツノオトシゴ分析は、様々な基質および阻害剤の存在下で多種多様な文脈における代謝を測定するために文献において広く使用されている。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

造血幹細胞の分離と移植（造血幹細胞）

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

マウスの主な腎尿細管上皮細胞の分離と性質、高スループットの細胞フラックスの解析

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...