Name: assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

롬바르드 실험실에서의 작업은 NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 및 ME200030) 및 Glenn Foundation for Medical Research의 지원을 받습니다. Li 실험실에서의 작업은 NIH (NHLBI 5R01HL150707)에 의해 지원됩니다.

모든 척추동물 실험은 미시간 대학교 동물 사용 및 관리 위원회의 규정에 따라 승인되고 수행되었습니다.
1. 분석 전날 (총 시간 : ~ 10 분)
<ol><li>센서 카트리지의 수화 (스텝 타임: ~10분)<ol>
<li>세포외 플럭스 분석 키트를 열고 센서 카트리지 및 유틸리티 플레이트 어셈블리를 분리합니다. 다음날 사용할 수 있도록 적재 가이드 플랫을 저장하십시오.</li>
		<li>센서 카트리지(뚜?...

<ol>
	<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis.">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+(HSPCs).">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li><li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging.">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells.">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux.">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li><li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells:+new+perspectives+and+opportunities.">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li><li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases.">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).</li><li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent:+mechanism+of+cell+death.">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li></ol>

이 방법 논문은 Seahorse 세포외 플럭스 분석기를 사용하는 마우스 HSPCs에서 세포 생물에너지학(당분해 및 OxPHOS)의 평가를 위한 최적화된 프로토콜을 기술한다. 이 장치는 각각 글리코 분해 및 미토콘드리아 호흡의 메트릭 인 살아있는 세포의 ECAR 및 OCR을 동시에 측정하는 강력한 도구입니다. 따라서, 세포 생물에너지를 실시간으로 평가하는데 사용될 수 있다. 또한, 96웰 마이크로플레이트 기반 플랫...

조혈은 고도로 전문화 된 기능을 가진 다양한 유형의 성숙한 혈액 세포가 HSC1에서 형성되는 과정입니다. HSC는 자기 갱신 및 다양한 다능성 및 혈통 특이적 선조 집단으로 분화 할 수 있습니다. 이 선조는 궁극적으로 림프구, 골수성, 에리스로이드 및 거핵구 혈통의 세포를 생산합니다. 자기 재생 능력을 유지하기 위해 HSC는 크게 정지 상태로 유지되며 다른 조직 줄기 세포와 마찬가지로 ATP 생산 2,3을 위해 미토콘드리아 OxPHOS보다는 당분해에 의존하는 것으로 여겨집니다. 세포 주기로의 진입은 향상된 호흡 및 OxPHOS로 이어지고, 그 결과 HSC 유지 및 기능3에 해로운 반응성 산소 종(ROS)의 수준이 상승한다. 따라서 반복되는 세포 분열은 HSC의 자기 재생 능력을 감소시키고 궁극적으로 고갈로 이어질 수 있습니다.
성인 조혈에서 HSC는 주로 비대칭 세포 분열을 겪으며, 그 동안 딸 세포 중 하나가 HSC 잠재력을 유지하고 글리콜 대사에 계속 의존합니다. 다른 딸 세포는 자기 재생 능력을 잃지만 증식하고 결국 분화 된 기능적 조혈 세포를 일으키는 원시적 인 전구 세포가됩니다4. HSC가 하류 선조를 생산하기 위해 분화 할 때, HSC 가 비활성 미토콘드리아 질량을 가지고 있다는 관찰에 의해 제안 된 바와 같이이 급속한 전이를 지원하는 데 필요한 에너지와 빌딩 블록을 공급하기 위해 글리코 분해에서 미토콘드리아 대사로의 전환이 발생하는 것으로 생각됩니다 5 . 대조적으로, 미토콘드리아 활성(연결된 ROS 수준으로 나타냄)은 HSC 9,10,11에서보다 혈통-헌신적 선조에서 훨씬 더 높다. 따라서 조혈의 초기 단계에서 발생하는 대사 변화는 HSC 운명을 조절하는 데 미토콘드리아의 직접적이고 중요한 역할을 제안합니다.
노화, 암, 당뇨병 및 비만과 같은 다양한 스트레스 조건 하에서 존재하는 기능 장애 미토콘드리아는 HSC 자기 재생 능력을 방해하여 과도한 양의 ROS를 생산하고 ATP 생산을 저해하거나 다른 대사 과정을 변경함으로써 HSC / 선조 분화의 불균형을 유발할 수 있습니다9,12,13 . HSC / 선조 분화에서 대사 항상성의 교란은 조혈에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 잠재적으로 혈액 학적 이상13의 발달에 기여할 수 있습니다. HSC 줄기 및 분화에 대한 글리코 분해 및 미토콘드리아 OxPHOS의 중요한 영향을 감안할 때, 정상 및 스트레스 조건 하에서 대사 매개 변수를 모두 조사하는 것이 중요합니다. HSCs 및 전구 세포의 글리콜 및 미토콘드리아 기능에 대한 귀중한 통찰력은 각각 세포 당분해 및 미토콘드리아 호흡의 지표 인 ECAR 및 OCR을 평가함으로써 얻을 수 있습니다.
Seahorse 세포외 플럭스 분석기는 살아있는 세포에서 ECAR 및 OCR을 동시에 측정하기 위해 웰 당 두 개의 프로브가 장착 된 강력한 장치이므로 다양한 기질 또는 억제제에 반응하여 실시간으로 세포 생물 에너지를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 분석기와 함께 사용되는 분석 카트리지에는 분석 중에 자동 주입을 위해 최대 네 개의 약물을 보유하는 주입 포트가 포함되어 있습니다. 전형적인 당분해 스트레스 시험의 반응식은 도 1A에 도시되어 있다. 상기 분석은 세포의 ECAR의 측정으로 시작하여, 글루타민을 함유하지만 글루코스 또는 피루베이트는 함유하지 않는 당분해 스트레스 시험 배지에서 배양한다. 이것은 세포의 비 글리콜 성 활성으로 인해 발생하는 산성화를 나타내며 비 글리콜 성 산성화로보고됩니다. 이것은 포화 농도에서 포도당의 주입으로 이어진다. 당분해를 통해 세포 내의 포도당은 피루베이트로 전환되며, 이는 세포질에서 추가로 대사되어 젖산을 생산하거나 미토콘드리아에서CO2 및 물을 생산합니다.
포도당을 젖산으로 전환시키는 것은 순 생산과 양성자의 세포외 배지로의 후속 방출을 유발하여 ECAR14,15,16의 급속한 증가를 초래합니다. ECAR의 이러한 글루코스-자극된 변화는 기저 조건하에서 글리코분해로서 보고된다. 두 번째 주사는 미토콘드리아 ATP 생산을 억제하는 올리고마이신 (ATP 합성 효소의 억제제, 일명 복합체 V17)으로 구성됩니다. 올리고마이신 매개 OxPHOS 억제 동안, 세포는 그들의 에너지 요구를 충족시키기 위해 당분해를 최대로 상향조절한다. 이것은 ECAR의 추가 증가를 일으켜 세포의 최대 글리콜 용량을 드러냅니다. 최대 글리콜 용량과 기저 글리코 분해 사이의 차이는 글리콜 보유량이라고합니다. 마지막으로, 2-DG가 주입되어 ECAR이 크게 떨어지며 일반적으로 비 글리콜 성 산성화 수준에 가깝습니다. 2-DG는 헥소키나제에 경쟁적으로 결합하는 글루코스 유사체로, 글리코분해억제(18)를 초래한다. 따라서, ECAR의 2-DG-유도된 감소는 글루코스 및 올리고마이신 주사 후에 관찰된 ECAR의 공급원이 실제로 당분해임을 추가로 확인시켜준다.
도 1B는 전형적인 미토콘드리아 스트레스 테스트에 대한 개략도를 표시한다. 상기 분석은 세포의 기준선 OCR 측정으로 시작하여, 글루코스, 글루타민 및 피루베이트를 함유하는 미토콘드리아 스트레스 시험 배지에서 인큐베이션한다. 기초 OCR 측정 후, 올리고마이신이 이 분석법에 주입되어 복합체 V를 억제하여 전자 수송 사슬(ETC)17을 통한 전자 흐름을 감소시킨다. 결과적으로, OCR은 올리고마이신 주사에 반응하여 감소되고, OCR의 이러한 감소는 미토콘드리아 ATP 생산과 관련이 있다. 두 번째 주사는 카르보닐 시아나이드-4 (트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP), 프로토노포어 및 미토콘드리아 OxPHOS17의 언커플러로 구성된다. FCCP는 미토콘드리아 내막을 가로지르는 양성자의 흐름을 허용함으로써 미토콘드리아 양성자 구배를 붕괴시킨다. FCCP 주입으로 인해 ETC를 통한 전자 흐름이 억제되고 복합 IV는 최대 수준에서 산소를 소비합니다. 최대 OCR과 기저 OCR의 차이는 예비 호흡 용량이라고하며, 이는 스트레스 조건 하에서 증가 된 에너지 수요에 대응하는 세포의 능력을 측정합니다. 마지막으로, 두 개의 ETC 억제제 (로테논, 콤플렉스 I 억제제 및 안티마이신 A, 콤플렉스 III 억제제17)의 혼합물이 주입되어 전자 흐름을 완전히 차단하고 OCR은 낮은 수준으로 감소합니다. 로테논 및 안티마이신 A 주사 후 측정된 OCR은 세포 내부의 다른 과정에 의해 구동되는 비미토콘드리아 OCR에 상응한다. 비 미토콘드리아 OCR은 기저 호흡, 양성자 누출 및 최대 호흡의 계산을 가능하게합니다.
기저 호흡은 기준선 OCR과 비미토콘드리아 OCR 사이의 차이를 나타낸다. 양성자 누출은 올리고마이신 주사 후 OCR과 비미토콘드리아 OCR의 차이를 의미한다. 최대 호흡은 FCCP 주사 후 OCR과 비미토콘드리아 OCR 사이의 차이를 나타낸다. 커플링 효율은 기초 호흡률에 대한 ATP 생산 속도의 백분율로서 계산된다. 이 방법 논문은 Seahorse XFe96 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 계보 음성 HSPC에서 ECAR 및 OCR을 측정하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 마우스 혈통 음성 HSPC를 분리하는 접근법을 설명하고, 세포외 플럭스 분석에 사용되는 다양한 약물의 세포 시딩 밀도 및 농도의 최적화를 설명하고, 약물 치료 전략을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430626</td>
			<td>Used to filter-sterilize the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>3rd drug injection during glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Enrichment buffer (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480017</td>
			<td>Used for washings during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A661-3</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>2nd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive. Used for coating cell microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O2793-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Used as cells strainer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26400044</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Used to wash cells after assay for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P235-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100103</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100243</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100603</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108403</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences now Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For ECAR and OCR measurments in real time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Prepared 1 N solution. Used for pH normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480015</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF prep station</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Used for non-CO2 37 &#176;C incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 extracellular FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100 or 102601-100</td>
			<td>Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading 
			drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer

정상 상태에서 조혈 줄기 세포 (HSCs)는 크게 정지 상태로 유지되며 에너지 요구를 충족시키기 위해 주로 당분해에 의존하는 것으로 여겨집니다. 그러나 감염이나 혈액 손실과 같은 스트레스 조건 하에서, HSC는 증식 성이되어 하류 전구 세포를 빠르게 생산하여 차례로 분화되어 궁극적으로 성숙한 혈액 세포를 생산합니다. 이 전이 및 분화 과정 동안 HSC는 정지에서 빠져 나와 글리코 분해에서 산화 인산화 (OxPHOS)로 대사 전환을 빠르게 겪습니다. 노화, 암, 당뇨병 및 비만과 같은 다양한 스트레스 상태는 미토콘드리아 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 조혈 중 HSC 및 선조의 대사 재 프로그래밍 및 분화를 변화시킬 수 있습니다. 정상 및 스트레스 조건 하에서 HSC와 선조의 글리콜 및 미토콘드리아 기능에 대한 귀중한 통찰력은 각각 세포 당 분해 및 미토콘드리아 호흡의 지표 인 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비율 (OCR)의 평가를 통해 얻을 수 있습니다. 
여기서, 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 조혈 줄기 및 원시전구 세포(HSPCs)를 모두 포함하는 마우스 골수 유래 혈통-음성 세포 집단에서 ECAR 및 OCR을 측정하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 마우스 골수로부터 혈통 음성 세포를 분리하는 접근법을 설명하고, 세포 시딩 밀도 및 2-데옥시-D-글루코오스(2-DG, 당분해를 억제하는 글루코스 유사체) 및 이러한 분석에 사용되는 다양한 OxPHOS 표적 약물(올리고마이신, FCCP, 로테논 및 안티마이신 A)의 농도 최적화를 설명하고, 약물 치료 전략을 설명합니다. 당분해, 글리콜 용량 및 글리콜 보유량과 같은 글리콜 플럭스의 주요 파라미터, 및 OxPHOS 파라미터, 예컨대 기저 호흡, 최대 호흡, 양성자 누출, ATP 생산, 예비 호흡 용량 및 커플링 효율은 이들 분석에서 측정될 수 있다. 이 프로토콜은 비부착성 HSPC에 대한 ECAR 및 OCR 측정을 허용하며 모든 유형의 현탁액 셀에 대한 분석 조건을 최적화하도록 일반화할 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용하여, 다양한 OxPHOS 표적 약물의 세포 수 및 농도(세포외 플럭스 분석에 사용됨)를 최적화하여 24주령의 암컷 C57BL/6 마우스로부터 분리된 HSPC의 ECAR 및 OCR을 측정하였다. 먼저, 세포 수 및 올리고마이신 농도를 최적화하기 위해 당분해 스트레스 시험을 수행하였다. 웰당 5 내지 104 내지 2.5 × 10,5 범위의 다양한 수의 HSPCs가 이 검정× 사용되었다. 도 2A...

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Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

조혈 동안, 조혈 줄기 세포는 글리코 분해에서 산화 인산화로 대사 전환을 겪습니다. 이 프로토콜은 마우스 조혈 줄기 및 전구 세포의 글리콜 및 미토콘드리아 기능을 평가하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 실시간으로 세포 생물 에너지를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.96웰 마이크로플레이트 기반 플랫폼은 고감도로 높은 처리량 정량화를 제공하므로 단일 플레이트를 사용하여 여러 샘플을 동시에 분석할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 조건에서 HSC 대사에 대한 화학 물질 또는 유전자 조작의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. HSC 다능성을 유지하는 대사 경로를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.현재의 연구는 주로 마우스 조혈 줄기 및 전구 세포에 초점을 맞추고 있지만, 프로토콜 및이 접근법은 모든 유형의 현탁액 세포에 대한 분석 조건을 최적화하기 위해 쉽게 적응 될 수 있습니다. 분석 하루 전, 세포외 플럭스 분석 키트를 열어 센서 카트리지 및 유틸리티 플레이트 어셈블리를 제거합니다. 다음날 사용할 수 있도록 로딩 가이드 플랫을 저장하십시오.이제 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에서 수동으로 분리하고 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 플럭스 분석 키트에 포함된 200마이크로리터의 교정제로 유틸리티 플레이트의 각 웰을 채운 다음 센서 카트리지를 다시 유틸리티 플레이트에 올려 놓고 캘리브란트의 센서를 완전히 잠급니다. 그런 다음 교정제로 유틸리티 플레이트를 인큐베이션하고 원고에 언급 된 가습 조건에 따라 밤새 섭씨 37도의 비 이산화탄소 인큐베이터에서 센서 카트리지를 조립하십시오.분석의 날에 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트 당 2.5 밀리리터의 세포 접착 용액을 준비한다. 플럭스 분석 키트에 포함된 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트를 열고 준비된 세포 접착 용액 25 마이크로리터를 각 웰의 바닥에 분주한다. 마이크로플레이트를 뚜껑으로 덮고 후드 내부의 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.배양 후, 다채널 피펫 또는 흡인기기를 사용하여 과량의 세포 접착 용액을 제거하고 버리고 200 마이크로리터의 멸균 초순수로 각 웰을 두 번 세척한다. 후드 내부의 뚜껑없이 플레이트를 30 ~ 45 분 동안 공기로 건조시킵니다. 제조된 마우스 계보 음성 HSPCs를 실온에서 5분 동안 200배 G에서 원심분리한다.상청액을 폐기한 후, 세포 펠릿을 적절한 분석 배지에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 다시 원심분리한다. 이 과정을 한 번 더 반복하고, 세포를 적절한 가온된 분석 배지에서 50 마이크로리터 당 250, 000 세포 또는 밀리리터 당 오백만 세포의 농도로 재현탁시킨다. 다채널 피펫을 사용하여 세포 접착제가 코팅된 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트의 각 웰의 측면을 따라 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 첨가한 다음, 50 마이크로리터의 분석 배지를 코너 배경 측정 웰에 첨가한다.코팅되지 않은 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트의 웰 당 50 마이크로리터의 물을 첨가하여 원심분리 밸런스 플레이트를 생성한다. 세포를 실온에서 1분 동안 200배 G에서 원심분리한다. 플레이트를 세포 부착을 위해 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 25 내지 30분 동안 인큐베이션한다.30분 후, 현미경으로 세포가 마이크로플레이트 표면에 안정적으로 부착되어 있는지 육안으로 확인한다. 텍스트 원고에 언급된 바와 같이 미리 가온된 당분해 스트레스 시험 분석 배지에서 필요한 모든 용액을 준비함으로써 시작하고 수화된 센서 카트리지를 인큐베이터로부터 제거한다. 센서 카트리지를 교정기에서 들어올려 동일한 유틸리티 플레이트에 있는 교정기로 교체하여 기포를 제거합니다.80개의 로딩 가이드를 센서 카트리지 상단에 평평하게 놓고 문자 A가 왼쪽 위 모서리에 위치하도록 방향을 지정합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 포트 A에 20 마이크로 리터의 100 밀리몰 포도당 용액을 분배하십시오.80 로딩 가이드 플랫을 BC 로딩 가이드 플랫으로 교체하고 문자 B를 왼쪽 상단 모서리에 맞 춥니 다. 22 마이크로리터의 20 마이크로몰 올리고마이신 용액을 포트 B.Reorient BC 로딩 가이드 플랫에 재배치하여 로딩 포트 C의 왼쪽 상단 모서리에 글자 C를 찾고 포트 C에 500 밀리몰 2-데옥시-d-글루코스 용액 25 마이크로리터를 분배한 다음 로딩 가이드 플랫을 제거하고 버립니다.이제 컨트롤러에서 글리코 분해 스트레스 테스트를위한 템플릿을 만들거나 로드하십시오. 주사 전략, 치료 조건 및 세포 유형에 대한 세부 정보를 입력하고 그룹 생성을 누릅니다. 플레이트 맵으로 이동하여 분석할 각 그룹에 웰을 할당합니다.프로토콜에서 초기화 단계에서 교정 및 평형화가 검사되었는지 확인하십시오. 각 주입 후 기준선 측정 및 측정의 경우 측정 주기 수를 세 개로 설정하고 혼합, 대기, 측정 시간을 세 분, 0분, 세 분으로 설정합니다. 소프트웨어에서 실행 시작을 클릭합니다.적재되고 수화된 센서 카트리지에서 뚜껑을 꺼내 세포외 플럭스 분석기의 작업 트레이에 놓습니다. 교정 실행을 시작합니다. 시딩된 세포를 포함하는 마이크로플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내십시오.세포를 교란시키지 않고, 웰 당 130 마이크로리터의 미리 가온된 글리코분해 스트레스 시험 분석 배지를 천천히 첨가하여 각 웰의 배지 부피를 180 마이크로리터로 구성하고, 플레이트를 추가로 15 내지 20분 동안 인큐베이터로 복귀시킨다. 소프트웨어에서 트레이 열기를 클릭하여 Seahorse의 열 트레이를 엽니 다. 교정이 끝난 후 유틸리티 플레이트를 세포가 포함된 이 분석 마이크로플레이트로 교체하고 로드 셀 플레이트를 눌러 측정을 시작합니다.측정이 끝난 후, 세포를 방해하지 않고 플레이트로부터 분석 배지를 제거하고, 세포를 분해하지 않고 250 마이크로리터의 인산염 완충 식염수로 부드럽게 세척한다. 이제 1X 프로테아제 억제제 칵테일로 보충 된 10 마이크로 리터의 방사성 면역 침전 용해 완충액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 진탕기에서 10 분 동안 교반하십시오. 전체 접시를 영하 80도에서 얼립니다.플레이트를 해동하고 제조업체의 지시에 따라 데이터 정규화를 위한 단백질 측정 분석을 수행합니다. Wave 데스크탑 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일을 열어 데이터를 검색하고 분석합니다. 정규화를 클릭하고 각 웰의 정규화 값을 붙여 넣은 다음 적용을 클릭하여 데이터를 정규화하십시오.내보내기를 클릭하고 당분해 스트레스 테스트 보고서 생성기를 선택하여 분석된 데이터를 보고서 생성기로 내보냅니다. 비글리콜성 산성화율은 세포 수가 50, 000에서 250, 000으로 증가하면서 상승하지만, 200, 000에서 250, 000 사이에서만 최소한으로 증가한다. 10 밀리몰 글루코스의 주입은 웰 당 250, 000 세포에서 관찰되는 ECAR의 최대 증가와 함께 모든 세포 수에서 당분해를 자극합니다.그러나, 올리고마이신의 두 마이크로몰의 주입은 ECAR을 더 증가시키지 않는다. 동일한 글리코분해 스트레스 테스트 세트에서 얻어진 OCR 데이터는 복합 5 억제로 인한 올리고마이신 주사 후 유의한 감소를 보여준다. 글리코분해 스트레스 테스트 파라미터를 계산하고, 추가 연구를 위해 올리고마이신의 두 마이크로몰에서 웰당 250, 000개의 세포를 선택하였다.미토콘드리아 스트레스 테스트는 두 마이크로몰 올리고마이신 주사가 콤플렉스 5의 억제를 통해 OCR의 현저한 감소를 야기한다는 것을 보여주었다. FCCP는 두 마이크로몰에서 관찰되는 최대 증가로 용량 의존적 방식으로 HSPCs의 OCR을 자극한다. 0.5 마이크로몰 로테논과 0.5 마이크로몰 안티마이신 A 주사의 혼합물은 OCR을 비미토콘드리아 산소 소비에 상응하는 최소 수준으로 감소시킨다.미토콘드리아 스트레스 테스트 파라미터를 계산하고 추가 연구를 위해 FCCP의 두 마이크로몰을 선택하였다. 이 기술의 높은 처리량 특성을 감안할 때, 여기에 기술된 프로토콜은 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 인자 및 악성 조혈 세포에서 많은 수의 생물에너지 조절제를 스크리닝하도록 쉽게 적응될 수 있다. 해마 분석은 다양한 기질 및 억제제의 존재하에 다양한 맥락에서 신진 대사를 측정하기 위해 문헌에서 널리 사용됩니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs)

연구

생물학

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...