Name: assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Работа в ломбардской лаборатории поддерживается NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 и ME200030) и Фондом медицинских исследований Гленна. Работа в лаборатории Li поддерживается NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Все эксперименты с позвоночными на животных были одобрены и выполнены в соответствии с правилами Комитета Мичиганского университета по использованию и уходу за животными.
1. За день до анализа (Общее время: ~10 мин)
<ol><li>Гидратация картриджа датчика (время шага: ~10 мин)<ol>
<li>...

<ol>
	<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis.">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+(HSPCs).">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li><li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging.">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells.">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux.">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li><li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells:+new+perspectives+and+opportunities.">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li><li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases.">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).</li><li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent:+mechanism+of+cell+death.">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li></ol>

В данной методической работе описан оптимизированный протокол оценки клеточной биоэнергетики (гликолиз и OxPHOS) в мышиных HSPCs с использованием анализатора внеклеточного потока Seahorse. Это устройство является мощным инструментом, который одновременно измеряет ECAR и OCR живых клеток, которые...

Кроветворение – это процесс, посредством которого из ГСК 1 образуются различные типы зрелых клеток крови с узкоспециализированнымифункциями. ГСК способны к самообновлению и дифференциации в различные мультипотентные и родословные популяции-прародители. Эти предшественники в конечном итоге продуцируют клетки лимфоидных, миелоидных, эритроидных и мегакариоцитарных линий. Чтобы сохранить свою способность к самообновлению, ГСК остаются в значительной степени спокойными и, как и другие тканевые стволовые клетки, полагаются на гликолиз, а не на митохондриальный OxPHOS для производства АТФ 2,3. Вступление в клеточный цикл приводит к усилению дыхания и OxPHOS, что приводит к повышенным уровням активных форм кислорода (АФК), которые наносят ущерб поддержанию HSC и функции3. Повторное деление клеток, таким образом, может привести к снижению самообновляющейся способности ГСК и, в конечном счете, к их истощению.
При взрослом кроветворении ГСК в первую очередь подвергаются асимметричному делению клеток, в ходе которого одна из дочерних клеток сохраняет потенциал ГСК и продолжает полагаться на гликолитический метаболизм. Другая дочерняя клетка становится примитивной клеткой-предшественником, которая теряет способность к самообновлению, но размножается и в конечном итоге приводит к дифференцированным функциональным кроветворным клеткам4. Когда ГСК дифференцируются для производства последующих предшественников, считается, что происходит переход от гликолиза к митохондриальному метаболизму для снабжения энергией и строительными блоками, необходимыми для поддержки этого быстрого перехода5, как показывают наблюдения, что ГСК обладают неактивной митохондриальной массой 6,7,8,9 . Напротив, митохондриальная активность (обозначенная связанными уровнями АФК) намного выше у прародителей, зафиксированных линией, чем у ГСК 9,10,11. Метаболические изменения, которые происходят на самом раннем этапе кроветворения, таким образом, предполагают прямую и решающую роль митохондрий в регулировании судьбы ГСК.
Дисфункциональные митохондрии, присутствующие в различных стрессовых условиях, таких как старение, рак, диабет и ожирение12, могут мешать способности к самообновлению HSC, вызывая дисбаланс в дифференциации HSC / прародителя путем производства чрезмерного количества АФК, нарушения производства АТФ и / или путем изменения других метаболических процессов 9,12,13 . Возмущения метаболического гомеостаза при дифференцировке ГСК/предшественника могут существенно влиять на кроветворение, потенциально способствуя развитию гематологических аномалий13. Учитывая критическое влияние гликолиза и митохондриального OxPHOS на стволовость и дифференцировку HSC, представляет интерес исследование как метаболических параметров в нормальных, так и в стрессовых условиях. Ценную информацию о гликолитической и митохондриальной функции ГСК и клеток-предшественников можно получить, оценив их ECAR и OCR, которые являются показателями клеточного гликолиза и митохондриального дыхания соответственно.
Внеклеточный анализатор потока Seahorse представляет собой мощный аппарат, оснащенный двумя зондами на скважину для одновременного измерения ECAR и OCR в живых клетках и, таким образом, может использоваться для оценки клеточной биоэнергетики в режиме реального времени в ответ на различные субстраты или ингибиторы. Пробирный картридж, используемый с анализатором, содержит инъекционные порты для удержания до четырех препаратов для автоматической инъекции во время анализа. Схема типичного гликолизного стресс-теста показана на фиг.1А. Анализ начинается с измерения ECAR клеток, инкубированных в среде гликолизного стресс-теста, содержащей глютамин, но не глюкозу или пируват. Это представляет собой подкисление, происходящее из-за негликолитической активности клеток, и сообщается как негликолитическое подкисление. За этим следует инъекция глюкозы в насыщенной концентрации. Посредством гликолиза глюкоза в клетке превращается в пируват, который далее метаболизируется в цитоплазме с образованием лактата или в митохондриях для производства CO2 и воды.
Превращение глюкозы в лактат вызывает чистую выработку и последующее высвобождение протонов во внеклеточную среду, что приводит к быстрому увеличению ECAR 14,15,16. Это стимулируемое глюкозой изменение ECAR сообщается как гликолиз в базальных условиях. Вторая инъекция состоит из олигомицина (ингибитор АТФ-синтазы, также известного как комплекс V17), который ингибирует выработку митохондриальной АТФ. Во время олигомицин-опосредованного ингибирования OxPHOS клетки максимально усиливают гликолиз для удовлетворения своих энергетических потребностей. Это вызывает дальнейшее увеличение ECAR, выявляя максимальную гликолитическую емкость клеток. Разница между максимальной гликолитической емкостью и базальным гликолизом называется гликолитическим резервом. Наконец, вводится 2-DG, что вызывает значительное падение ECAR, обычно близкое к уровням негликолитического подкисления. 2-DG является аналогом глюкозы, который конкурентно связывается с гексокиназой, что приводит к ингибированию гликолиза18. Таким образом, 2-DG-индуцированное снижение ECAR еще раз подтверждает, что гликолиз действительно является источником ECAR, наблюдаемым после инъекций глюкозы и олигомицина.
На рисунке 1B показана схема типичного митохондриального стресс-теста. Анализ начинается с базового измерения OCR клеток, инкубированных в митохондриальной стресс-тестовой среде, содержащей глюкозу, глютамин и пируват. После базальных измерений OCR в этот анализ вводится олигомицин, который ингибирует комплекс V, тем самым уменьшая поток электронов через цепь переноса электронов (ETC)17. Следовательно, OCR снижается в ответ на инъекцию олигомицина, и это снижение OCR связано с митохондриальной продукцией АТФ. Вторая инъекция состоит из карбонильного цианида-4 (трифторметокси) фенилгидразона (FCCP), протонофора и разъединителя митохондриального OxPHOS17. FCCP разрушает митохондриальный протонный градиент, позволяя потоку протонов через внутреннюю мембрану митохондрий. Из-за впрыска FCCP поток электронов через внеземные цивилизации дерепрессируется, и комплекс IV потребляет кислород на максимальном уровне. Разница между максимальным OCR и базальным OCR называется запасной дыхательной способностью, которая является мерой способности клетки реагировать на повышенную потребность в энергии в условиях стресса. Наконец, вводится смесь двух ингибиторов ETC (ротенон, ингибитор комплекса I, и антимицин А, комплексный ингибитор III17), который полностью отключает поток электронов, и OCR снижается до низкого уровня. OCR, измеренный после инъекции ротенона и антимицина А, соответствует немитохондриальному OCR, вызванному другими процессами внутри клеток. Немитохондриальный OCR позволяет рассчитать базальное дыхание, утечку протонов и максимальное дыхание.
Базальное дыхание представляет собой разницу между базовым OCR и немитохондриальным OCR. Протонная утечка относится к разнице между OCR после инъекции олигомицина и немитохондриальной OCR. Максимальное дыхание представляет собой разницу между OCR после инъекции FCCP и немитохондриальным OCR. Эффективность соединения рассчитывается как процентное отношение скорости производства АТФ к скорости базального дыхания. В этом методе представлен подробный протокол измерения ECAR и OCR в отрицательных HSPC с использованием внеклеточного анализатора потока Seahorse XFe96. Этот протокол описывает подходы к выделению мышиных линионно-отрицательных HSPC, объясняет оптимизацию плотности посева клеток и концентраций различных препаратов, используемых во внеклеточных анализах потока, и описывает стратегии лечения лекарственными средствами.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430626</td>
			<td>Used to filter-sterilize the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>3rd drug injection during glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Enrichment buffer (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480017</td>
			<td>Used for washings during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A661-3</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>2nd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive. Used for coating cell microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O2793-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Used as cells strainer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26400044</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Used to wash cells after assay for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P235-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100103</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100243</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100603</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108403</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences now Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For ECAR and OCR measurments in real time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Prepared 1 N solution. Used for pH normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480015</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF prep station</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Used for non-CO2 37 &#176;C incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 extracellular FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100 or 102601-100</td>
			<td>Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading 
			drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer

В установившемся состоянии гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) остаются в значительной степени покоящимися и, как полагают, преимущественно зависят от гликолиза для удовлетворения своих энергетических потребностей. Однако в стрессовых условиях, таких как инфекция или кровопотеря, ГСК становятся пролиферативными и быстро производят клетки-предшественники, которые, в свою очередь, дополнительно дифференцируются, в конечном итоге производя зрелые клетки крови. Во время этого процесса перехода и дифференцировки ГСК выходят из покоя и быстро подвергаются метаболическому переходу от гликолиза к окислительному фосфорилированию (OxPHOS). Различные стрессовые состояния, такие как старение, рак, диабет и ожирение, могут негативно влиять на функцию митохондрий и, таким образом, могут изменить метаболическое перепрограммирование и дифференцировку ГСК и предшественников во время кроветворения. Ценная информация о гликолитических и митохондриальных функциях ГСК и предшественников в нормальных и стрессовых условиях может быть получена путем оценки их скорости внеклеточного подкисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR), которые являются показателями клеточного гликолиза и митохондриального дыхания соответственно. 
Здесь представлен подробный протокол для измерения ECAR и OCR в популяциях клеток, полученных из костного мозга мыши, которые включают как гемопоэтические стволовые, так и примитивные клетки-предшественники (HSPC), с использованием анализатора внеклеточного потока. Этот протокол описывает подходы к выделению линейно-отрицательных клеток из костного мозга мыши, объясняет оптимизацию плотности посева клеток и концентраций 2-дезокси-D-глюкозы (2-DG, аналог глюкозы, который ингибирует гликолиз) и различных OxPHOS-таргетных препаратов (олигомицин, FCCP, ротенон и антимицин А), используемых в этих анализах, и описывает стратегии лечения лекарственными средствами. Ключевые параметры гликолитического потока, такие как гликолиз, гликолитическая емкость и гликолитический резерв, а также параметры OxPHOS, такие как базальное дыхание, максимальное дыхание, утечка протонов, производство АТФ, резервная дыхательная способность и эффективность связи, могут быть измерены в этих анализах. Этот протокол позволяет проводить измерения ECAR и OCR на неадгезивных HSPC и может быть обобщен для оптимизации условий анализа для любого типа суспензионных клеток.

Используя этот протокол, количество клеток и концентрации различных препаратов, нацеленных на OxPHOS (используемых во внеклеточных анализах потока), были оптимизированы для измерения ECAR и OCR HSPC, выделенных у 24-недельных самок мышей C57BL/6. Во-первых, был проведен гликолизный стресс-тест для о...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Метод, представленный здесь, обобщает оптимизированные протоколы оценки клеточной биоэнергетики в неадгезивных гемопоэтических стволовых и примитивных клетках-предшественниках (HSPCs) с использованием внеклеточного анализатора потоков для измерения скорости внеклеточного подкисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR) HSPC в режиме реального времени.

Оценка клеточной биоэнергетики в гемопоэтических стволовых клетках мыши и примитивных клетках-предшественниках с помощью анализатора внеклеточного потока

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Во время кроветворения гемопоэтические стволовые клетки подвергаются метаболическому переходу от гликолиза к окислительному фосфорилированию. Этот протокол может быть использован для оценки гликолитических и митохондриальных функций гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток мыши. Этот метод может быть использован для оценки клеточной биоэнергетики в режиме реального времени.Платформа на основе 96-луночных микропластин обеспечивает высокую пропускную оценку с высокой чувствительностью, что позволяет одновременно анализировать несколько образцов с использованием одной пластины. Этот метод может быть использован для исследования влияния химических веществ или генетических манипуляций на метаболизм HSC в различных условиях. Это может помочь прояснить метаболические пути, которые поддерживают плюрипотентность HSC.Хотя текущее исследование в основном сосредоточено на гемопоэтических стволовых клетках мышей и клетках-предшественниках, протокол и этот подход могут быть легко адаптированы для оптимизации условий анализа для любого типа суспензионных клеток. За день до анализа откройте комплект для анализа внеклеточного флюса, чтобы удалить картридж датчика и сборку полезной пластины. Сохраните погрузочно-разгрузочные квартиры для использования на следующий день.Теперь вручную отделите картридж датчика от полезной пластины и поместите его вверх ногами рядом с полезной пластиной. Используя многоканальную пипетку, заполните каждую скважину полезной пластины 200 микролитрами калибранта, включенными в комплект для анализа потока, затем поместите картридж датчика обратно на полезную пластину, убедившись, что датчики полностью погружены в калибрант. Затем инкубируют полезную пластину с калибрантом и собранным картриджем датчика в инкубаторе без углекислого газа при 37 градусах Цельсия в течение ночи после увлажнения, упомянутых в рукописи.В день анализа готовят 2,5 миллилитра клеточного адгезивного раствора на 96-луночную микропластинку клеточной культуры, как описано в текстовой рукописи. Откройте микропластинку клеточной культуры из 96 лунок, входящую в комплект для анализа флюса, и дозируйте 25 микролитров подготовленного клеточного клеевого раствора на дне каждой лунки. Накройте микропластинкой крышкой и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре внутри вытяжки.После инкубации удалите и выбросьте избыток клеточного клеевого раствора с помощью многоканальной пипетки или аспиратора и дважды промыть каждую лунку 200 микролитрами стерильной сверхчистой воды. Высушите пластину на воздухе без крышки внутри вытяжки в течение 30-45 минут. Центрифугируйте подготовленные мышей линии отрицательных HSPCs в 200 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре.После выброса супернатанта повторно суспендируют клеточную гранулу в соответствующей пробирной среде и снова центрифугируют клеточную суспензию. Повторите эту процедуру еще раз и повторно суспендируйте клетки в соответствующей подогретой пробирной среде до концентрации 250 000 клеток на 50 микролитров или пяти миллионов клеток на миллилитры. Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 50 микролитров клеточной суспензии вдоль стороны каждой лунки клеточного клея, покрытого 96-луночной микропластиной клеточной культуры, затем добавить 50 микролитров пробирной среды в угловые фоновые измерительные колодцы.Создайте пластину балансировки центрифуги, добавив 50 микролитров воды на лунку микропластины 96-луночной культуры клеток без покрытия. Центрифугируйте ячейки в 200 раз G в течение одной минуты при комнатной температуре. Инкубируйте пластину в инкубаторе без углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия в течение 25-30 минут для прикрепления клеток.Через 30 минут визуально подтвердите под микроскопом, что клетки стабильно прилипли к поверхности микропластины. Начните с приготовления всех необходимых растворов в предварительно нагретой среде для анализа гликолизного стресс-теста, как указано в текстовой рукописи, и извлеките гидратированный картридж датчика из инкубатора. Выньте патрон датчика из калибранта и замените его на той же вспомогательной пластине с калибрантом, чтобы удалить пузырьки воздуха.Поместите направляющую 80 заряда в верхнюю часть картриджа датчика, ориентируя его так, чтобы буква А располагалась в верхнем левом углу. Используя многоканальную пипетку, дозируйте 20 микролитров 100-миллимолярного раствора глюкозы в порту A.Замените направляющую загрузки 80 плоской на плоскую направляющую загрузки BC, ориентируя букву B в верхнем левом углу. Дозируйте 22 микролитра 20 микромолярного раствора олигомицина в порту B.Переориентируйте направляющую загрузки BC плоско, чтобы найти букву C в верхнем левом углу для загрузки порта C и дозируйте 25 микролитров 500 миллимолярного 2-дезокси-d-глюкозного раствора в порту C. Затем удалите и выбросьте загрузочный направляющий плоский.Теперь создайте или загрузите шаблон для нагрузочного теста гликолиза на контроллере. Введите сведения о стратегиях инъекций, условиях лечения и типах клеток, а затем нажмите Создать группы. Перейдите к карте плит и назначьте скважины каждой группе для анализа.В протоколе убедитесь, что калибровка и уравновешивание проверены на этапе инициализации. Для базового измерения и измерений после каждой инъекции установите число циклов измерения равным трем и перемешайте, подождите, измерьте время до трех минут, ноль минут, три минуты. Нажмите кнопку Запустить запуск программного обеспечения.Снимите крышку с нагруженного и гидратированного картриджа датчика соединений и поместите его на рабочий лоток внеклеточного анализатора потока. Начните выполнение калибровки. Извлеките микропластину, содержащую засеянные клетки, из инкубатора.Не нарушая клетки, медленно добавляют 130 микролитров предварительно подогретой среды для анализа гликолизного стресс-теста на лунку, чтобы восполнить объем среды в каждой лунке до 180 микролитров и вернуть пластину в инкубатор еще на 15-20 минут. Нажмите кнопку Открыть лоток на программном обеспечении, чтобы открыть тепловой лоток Seahorse. После завершения калибровки замените полезную пластину этой микропластинкой, содержащей ячейки, и нажмите на пластину тензодатчика, чтобы начать измерения.После того, как измерения завершены, извлеките пробирную среду с пластины, не нарушая клетки, и осторожно промыте их 250 микролитрами фосфатного буферного физиологического раствора, не смещая клетки. Теперь добавьте в каждую лунку 10 микролитров буфера лизиса радиоиммунопреципитации, дополненного коктейлем ингибитора протеазы 1X, и перемешайте пластину на шейкере в течение 10 минут. Заморозьте всю тарелку при минус 80 градусах Цельсия.Разморозьте пластину и выполните анализ измерения белка для нормализации данных в соответствии с инструкциями производителя. Извлеките и проанализируйте данные, открыв файл данных с помощью настольного программного обеспечения Wave. Нажмите «Нормализовать», вставьте значения нормализации для каждой скважины, а затем нажмите «Применить», чтобы нормализовать данные.Нажмите «Экспорт» и выберите генератор отчетов о нагрузочных тестах на гликолиз, чтобы экспортировать проанализированные данные в генератор отчетов. Скорость негликолиотического подкисления увеличивается с увеличением числа клеток с 50 000 до 250 000, но увеличивается только минимально между 200 000 и 250 000. Инъекция 10 миллимоляров глюкозы стимулирует гликолиз во всех количествах клеток с максимальным увеличением ЭКАР, наблюдаемым при 250 000 клеток на лунку.Однако инъекция двух микромоляров олигомицина еще больше не увеличивает ECAR. Данные OCR, полученные в том же наборе стресс-тестов гликолиза, показывают значительное падение после инъекции олигомицина из-за ингибирования комплекса 5. Были рассчитаны параметры нагрузочного теста гликолиза и отобрано 250 000 клеток на лунку в двух микромоляриях олигомицина для дальнейших исследований.Митохондриальный стресс-тест показал, что две микромолярные инъекции олигомицина вызывают значительное снижение OCR за счет ингибирования комплекса 5. FCCP стимулирует OCR в HSPC дозозависимым образом с максимальным увеличением, наблюдаемым на двух микромолярах. Смесь 0,5 микромолярного ротенона и 0,5 микромолярного антимицина А в инъекции снижает OCR до минимального уровня, соответствующего немитохондриальному потреблению кислорода.Были рассчитаны параметры митохондриального стресс-теста и выбраны два микромоляра FCCP для дальнейших исследований. Учитывая высокую пропускную способность этого метода, протокол, описанный здесь, может быть легко адаптирован для скрининга большого количества биоэнергетических модуляторов в гемопоэтических стволовых клетках, кроветворных предшественниках и злокачественных кроветворных клетках. Анализ морского конька широко используется в литературе для измерения метаболизма в самых разных контекстах в присутствии различных субстратов и ингибиторов.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Выделение и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Выделение и анализ гемопоэтических стволовых клеток из плаценты

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Генерация Мыши, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

В естественных условиях клоновых Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников оцениваться пятью флуоресцентных белков с помощью конфокальной и многофотонной микроскопии

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Изоляция, характеристики и высокую пропускную способность внеклеточного Flux анализ мышь первичной почечной трубчатых эпителиальных клеток

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Измерение энергии метаболизма в описаны ткани сетчатки, с помощью анализа внеклеточного Flux

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...