Name: assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Arbetet i Lombard-laboratoriet stöds av NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 och ME200030) och Glenn Foundation for Medical Research. Arbetet i Li-laboratoriet stöds av NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Alla försök med ryggradsdjur godkändes av och utfördes i enlighet med föreskrifterna från University of Michigan Committee on Use and Care of Animals.
1. Dag före analysen (Total tid: ~ 10 min)
<ol><li>Hydrering av sensorpatronen (Stegtid: ~ 10 min)<ol>
<li>Öppna den extracellulära flödesanalyssatsen och ta bort sensorpatronen och verktygsplattan. Spara lastguidens lägenheter för användning nästa dag.</li>
		<li>Separera sensorpatronen manuellt (den övre gröna delen med lock)...

<ol>
	<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis.">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+(HSPCs).">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li><li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging.">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells.">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux.">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li><li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells:+new+perspectives+and+opportunities.">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li><li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases.">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).</li><li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent:+mechanism+of+cell+death.">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li></ol>

Detta metoddokument beskriver ett optimerat protokoll för bedömning av cellulär bioenergetik (glykolys och OxPHOS) i mus-HSPC med hjälp av Seahorse extracellulära flödesanalysator. Denna enhet är ett kraftfullt verktyg som samtidigt mäter ECAR och OCR hos levande celler, vilka är mätvärden för glykolys respektive mitokondriell andning. Således kan den användas för att bedöma cellulär bioenergetik i realtid. Vidare erbjuder den 96-brunns mikroplattbaserade plattformen kvantifiering med hög genomströmnin...

Hematopoiesis är den process genom vilken olika typer av mogna blodkroppar med högspecialiserade funktioner bildas från HSC1. HSC kan självförnyelse och differentiering i olika multipotenta och härstamningsspecifika stampopulationer. Dessa förfäder producerar slutligen celler av lymfoida, myeloida, erytroida och megakaryocytlinjeer. För att upprätthålla sin självförnyelsekapacitet förblir HSC: er i stort sett vilande och, liksom andra vävnadsstamceller, tros vara beroende av glykolys snarare än mitokondriell OxPHOS för ATP-produktion 2,3. Inträde i cellcykeln leder till förbättrad andning och OxPHOS, vilket resulterar i förhöjda nivåer av reaktiva syrearter (ROS), som är skadliga för HSC-underhåll och funktion3. Upprepad celldelning kan således leda till minskad självförnyelseförmåga hos HSC och i slutändan till deras utmattning.
Vid vuxen hematopoies genomgår HSC främst asymmetrisk celldelning, under vilken en av dottercellerna behåller HSC-potentialen och fortsätter att förlita sig på glykolytisk metabolism. Den andra dottercellen blir en primitiv stamcell som förlorar självförnyelsekapacitet men förökar sig och så småningom ger upphov till differentierade funktionella hematopoetiska celler4. När HSC differentierar för att producera nedströms förfäder, antas en övergång från glykolys till mitokondriell metabolism ske för att leverera den energi och byggstenar som behövs för att stödja denna snabba övergång5, vilket föreslås av observationerna att HSC har inaktiv mitokondriell massa 6,7,8,9 . Däremot är mitokondriell aktivitet (indikerad av länkade ROS-nivåer) mycket högre i släktlinjeengagerade förfäder än i HSC 9,10,11. Metaboliska förändringar som uppstår under det tidigaste steget av hematopoies föreslår således en direkt och avgörande roll av mitokondrier för att reglera HSC-ödet.
Dysfunktionella mitokondrier som förekommer under olika stressförhållanden, såsom åldrande, cancer, diabetes och fetma12, kan störa HSC:s självförnyelsekapacitet, vilket skapar en obalans i HSC/stamfaderdifferentiering genom att producera alltför stora mängder ROS, försämra ATP-produktionen och/eller genom att förändra andra metaboliska processer 9,12,13 . Störningar i metabolisk homeostas vid HSC/stamfaderdifferentiering kan avsevärt påverka hematopoies, vilket kan bidra till utvecklingen av hematologiska avvikelser13. Med tanke på de kritiska influenserna av glykolys och mitokondriell oxfos på HSC-stamhet och differentiering är det av intresse att undersöka både metaboliska parametrar under normala och stressförhållanden. Värdefulla insikter i den glykolytiska och mitokondriella funktionen hos HSC och stamceller kan erhållas genom att bedöma deras ECAR och OCR, som är indikatorer på cellulär glykolys respektive mitokondriell andning.
Seahorse extracellulära flödesanalysator är en kraftfull apparat utrustad med två sonder per brunn för att samtidigt mäta ECAR och OCR i levande celler och kan därmed användas för att bedöma cellulär bioenergetik i realtid, som svar på olika substrat eller hämmare. Analyspatronen som används med analysatorn innehåller injektionsportar för att hålla upp till fyra läkemedel för automatiserad injektion under analysen. Ett schema för ett typiskt glykolysstresstest visas i figur 1A. Analysen börjar med mätning av ECAR av celler, inkuberade i glykolysstresstestmedium innehållande glutamin men inte glukos eller pyruvat. Detta representerar försurning som sker på grund av icke-glykolytiska aktiviteter hos cellerna och rapporteras som icke-glykolytisk försurning. Detta följs av injektion av glukos vid en mättande koncentration. Via glykolys omvandlas glukos i cellen till pyruvat, som metaboliseras ytterligare i cytoplasman för att producera laktat, eller i mitokondrier för att producera CO2 och vatten.
Omvandling av glukos till laktat orsakar nettoproduktion och efterföljande frisättning av protoner i det extracellulära mediet, vilket resulterar i en snabb ökning av ECAR 14,15,16. Denna glukosstimulerade förändring i ECAR rapporteras som glykolys under basala förhållanden. Den andra injektionen består av oligomycin (en hämmare av ATP-syntas, aka komplex V17), som hämmar mitokondriell ATP-produktion. Under oligomycinmedierad OxPHOS-hämning uppreglerar cellerna maximalt glykolys för att möta deras energiska krav. Detta orsakar en ytterligare ökning av ECAR, vilket avslöjar cellernas maximala glykolytiska kapacitet. Skillnaden mellan den maximala glykolytiska kapaciteten och basal glykolys kallas glykolytisk reserv. Slutligen injiceras 2-DG, vilket orsakar en signifikant minskning av ECAR, vanligtvis nära icke-glykolytiska försurningsnivåer. 2-DG är en glukosanalog som konkurrenskraftigt binder till hexokinas, vilket resulterar i hämning av glykolys18. Således bekräftar den 2-DG-inducerade minskningen av ECAR ytterligare att glykolys verkligen är källan till ECAR observerad efter glukos- och oligomycininjektioner.
Figur 1B visar schemat för ett typiskt mitokondriellt stresstest. Analysen börjar med baslinje OCR-mätning av cellerna, inkuberad i mitokondriellt stresstestmedium innehållande glukos, glutamin och pyruvat. Efter basala OCR-mätningar injiceras oligomycin i denna analys, vilket hämmar komplex V och därigenom minskar elektronflödet genom elektrontransportkedjan (ETC)17. Följaktligen reduceras OCR som svar på oligomycininjektion, och denna minskning av OCR är kopplad till mitokondriell ATP-produktion. Den andra injektionen består av karbonylcyanid-4 (trifluorometoxi) fenylhydrazon (FCCP), en protonofor och en frikoppling av mitokondriell OxPHOS17. FCCP kollapsar den mitokondriella protongradienten genom att tillåta flödet av protoner över det mitokondriella inre membranet. På grund av FCCP-injektionen avtrycks elektronflödet genom ETC och komplex IV förbrukar syre på maximal nivå. Skillnaden mellan maximal OCR och basal OCR kallas den extra andningskapaciteten, vilket är ett mått på cellens förmåga att reagera på ökat energibehov under stressförhållanden. Slutligen injiceras en blandning av två ETC-hämmare (rotenon, en komplex I-hämmare och antimycin A, en komplex III-hämmare17), som helt stänger av elektronflödet och OCR minskar till en låg nivå. OCR mätt efter rotenon och antimycin En injektion motsvarar icke-mitokondriell OCR som drivs av andra processer inuti cellerna. Icke-mitokondriell OCR möjliggör beräkning av basal andning, protonläckage och maximal andning.
Basal andning representerar skillnaden mellan baseline OCR och icke-mitokondriell OCR. Protonläckage avser skillnaden mellan OCR efter oligomycininjektion och icke-mitokondriell OCR. Maximal andning representerar skillnaden mellan OCR efter FCCP-injektion och icke-mitokondriell OCR. Kopplingseffektiviteten beräknas som procentandelen av ATP-produktionshastigheten till basal andningshastighet. Detta metoddokument ger ett detaljerat protokoll för att mäta ECAR och OCR i härstamningsnegativa HSPC med hjälp av Seahorse XFe96 extracellulär flödesanalysator. Detta protokoll beskriver metoder för att isolera muslinjenegativa HSPC, förklarar optimeringen av cellsåddensitet och koncentrationer av olika läkemedel som används i extracellulära flödesanalyser och beskriver läkemedelsbehandlingsstrategier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430626</td>
			<td>Used to filter-sterilize the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>3rd drug injection during glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Enrichment buffer (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480017</td>
			<td>Used for washings during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A661-3</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>2nd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive. Used for coating cell microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O2793-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Used as cells strainer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26400044</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Used to wash cells after assay for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P235-500</td>
			<td>Component of ACK lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100103</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100243</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100603</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108403</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116203</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>3rd drug injection during mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences now Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For ECAR and OCR measurments in real time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Prepared 1 N solution. Used for pH normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads (MojoSort)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480015</td>
			<td>Used for lineage depletion during HSPCs harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153</td>
			<td>Component of RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF prep station</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Used for non-CO2 37 &#176;C incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 extracellular FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100 or 102601-100</td>
			<td>Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading 
			drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular bioenergetics in mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells using the extracellular flux analyzer

Under steady state förblir hematopoetiska stamceller (HSC) i stor utsträckning vilande och tros vara övervägande beroende av glykolys för att möta deras energiska behov. Men under stressförhållanden som infektion eller blodförlust blir HSC proliferativa och producerar snabbt nedströms stamceller, som i sin tur ytterligare differentierar och i slutändan producerar mogna blodkroppar. Under denna övergångs- och differentieringsprocess lämnar HSC från lugn och genomgår snabbt en metabolisk övergång från glykolys till oxidativ fosforylering (OxPHOS). Olika stressförhållanden, såsom åldrande, cancer, diabetes och fetma, kan negativt påverka mitokondriell funktion och kan därmed förändra den metaboliska omprogrammeringen och differentieringen av HSC och förfäder under hematopoies. Värdefulla insikter i glykolytiska och mitokondriella funktioner hos HSC och förfäder under normala och stressförhållanden kan erhållas genom bedömning av deras extracellulära försurningshastighet (ECAR) och syreförbrukningshastighet (OCR), som är indikatorer på cellulär glykolys respektive mitokondriell andning. 
Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll för att mäta ECAR och OCR i musbenmärgs-härledda härstamningsnegativa cellpopulationer, som inkluderar både hematopoetiska stam- och primitiva stamceller (HSPC), med användning av den extracellulära flödesanalysatorn. Detta protokoll beskriver metoder för att isolera härstamningsnegativa celler från musbenmärgen, förklarar optimering av cellsåddensitet och koncentrationer av 2-deoxi-D-glukos (2-DG, en glukosanalog som hämmar glykolys) och olika OxPHOS-riktade läkemedel (oligomycin, FCCP, rotenon och antimycin A) som används i dessa analyser och beskriver läkemedelsbehandlingsstrategier. Viktiga parametrar för glykolytiskt flöde, såsom glykolys, glykolytisk kapacitet och glykolytisk reserv, och OxPHOS-parametrar, såsom basal andning, maximal andning, protonläckage, ATP-produktion, ledig andningskapacitet och kopplingseffektivitet, kan mätas i dessa analyser. Detta protokoll tillåter ECAR- och OCR-mätningar på icke-vidhäftande HSPC och kan generaliseras för att optimera analysförhållandena för alla typer av suspensionsceller.

Med hjälp av detta protokoll optimerades cellantalet och koncentrationerna av olika OxPHOS-riktade läkemedel (som används i de extracellulära flödesanalyserna) för att mäta ECAR och OCR av HSPC isolerade från 24 veckor gamla kvinnliga C57BL/6-möss. Först utfördes glykolysstresstestet för att optimera cellantal och oligomycinkoncentration. Ett varierande antal HSPC per brunn från 5 × 104 till 2,5 × 105 användes i denna analys. Som visas i figur 2A och <st...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Metoden som presenteras här sammanfattar optimerade protokoll för bedömning av cellulär bioenergetik i icke-vidhäftande mushematopietiska stam- och primitiva stamceller (HSPC) med hjälp av den extracellulära flödesanalysatorn för att mäta extracellulär försurningshastighet (ECAR) och syreförbrukningshastighet (OCR) för HSPC i realtid.

Bedömning av cellulär bioenergetik i mus hematopoetisk stam och primitiva stamceller med hjälp av extracellulär flödesanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Under hematopoies genomgår hematopoetiska stamceller en metabolisk övergång från glykolys till oxidativ fosforylering. Detta protokoll kan användas för att bedöma glykolytiska och mitokondriella funktioner hos mus hematopoetiska stam- och stamceller. Denna metod kan användas för att bedöma cellulär bioenergetik i realtid.Den 96-brunns mikroplattbaserade plattformen erbjuder kvantifiering med hög genomströmning med hög känslighet, vilket möjliggör samtidig analys av flera prover med en enda platta. Denna teknik kan användas för att undersöka effekterna av kemikalier eller genetiska manipulationer på HSC-metabolism under olika förhållanden. Det kan hjälpa till att belysa metaboliska vägar som upprätthåller HSC-pluripotens.Även om den aktuella studien huvudsakligen är inriktad på mushematopietiska stjälkar och stamceller, kan protokollet och detta tillvägagångssätt enkelt anpassas för att optimera analysförhållandena för alla typer av suspensionsceller. En dag före analysen öppnar du den extracellulära flödesanalyssatsen för att ta bort sensorpatronen och verktygsplattan. Spara lastguidens lägenheter för användning nästa dag.Separera nu sensorpatronen manuellt från verktygsplattan och placera den upp och ner bredvid verktygsplattan. Fyll varje brunn på verktygsplattan med 200 mikroliter calibrant som ingår i flödesanalyssatsen med hjälp av en flerkanalig pipett och placera sedan sensorpatronen tillbaka på verktygsplattan och se till att helt sänka sensorerna i bromsoken. Inkubera sedan verktygsplattan med kaliber och monterad sensorpatron i en icke-koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius över natten efter de befuktningsförhållanden som nämns i manuskriptet.På analysdagen bereda 2,5 ml av celllimlösningen per 96-brunns cellodlingsmikroplatta som beskrivs i textmanuskriptet. Öppna mikroplattan med 96 brunnar som medföljer flödesanalyssatsen och avge 25 mikroliter av den beredda celllimlösningen i botten av varje brunn. Täck mikroplattan med locket och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur inuti huven.Efter inkubation, ta bort och kassera överflödig celllimlösning med en flerkanalig pipett eller aspirator och tvätta varje brunn två gånger med 200 mikroliter sterilt ultrarent vatten. Lufttorka plattan utan locket inuti huven i 30 till 45 minuter. Centrifugera de beredda muslinjen negativa HSPC vid 200 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur.Efter kassering av supernatanten, återsuspendera cellpelleten i lämpligt analysmedium och centrifugera återigen cellsuspensionen. Upprepa denna procedur en gång till och resuspendera cellerna i lämpligt uppvärmt analysmedium till koncentrationen av 250 000 celler per 50 mikroliter eller fem miljoner celler per milliliter. Använd en flerkanalig pipett för att tillsätta 50 mikroliter av cellsuspensionen längs sidan av varje brunn i celllimbelagd 96-brunns cellodlingsmikroplatta och tillsätt sedan 50 mikroliter av analysmediet i hörnbakgrundsmätningsbrunnarna.Skapa en centrifugbalansplatta genom att tillsätta 50 mikroliter vatten per brunn av en icke-belagd 96-brunns cellodlingsmikroplatta. Centrifugera cellerna vid 200 gånger G i en minut vid rumstemperatur. Inkubera plattan i en icke-koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius i 25 till 30 minuter för cellfästning.Efter 30 minuter, bekräfta visuellt under ett mikroskop att cellerna är stabilt vidhäftade på mikroplattans yta. Börja med att förbereda alla nödvändiga lösningar i det förvärmda glykolysstresstestmediet som nämns i textmanuskriptet och ta bort den hydratiserade sensorpatronen från inkubatorn. Lyft sensorpatronen ur bromsoket och byt ut den på samma verktygsplatta med bromsoket för att ta bort luftbubblorna.Placera 80-laddningsstyrningen platt på toppen av sensorpatronen och orientera den så att bokstaven A är placerad i det övre vänstra hörnet. Använd en flerkanalig pipett och avge 20 mikroliter 100 millimolär glukoslösning i port A.Byt ut 80-laststyrningen platt med BC-laststyrningen platt och orientera bokstaven B i det övre vänstra hörnet. Dispensera 22 mikroliter 20 mikromolär oligomycinlösning i port B.Omorientera BC-lastguiden platt för att lokalisera bokstaven C i det övre vänstra hörnet för lastningsport C och dispensera 25 mikroliter 500 millimolär 2-deoxi-d-glukoslösning i port C.Ta sedan bort och kassera laststyrningslägenheterna.Skapa eller ladda nu mallen för glykolysstresstestet på regulatorn. Ange information om injektionsstrategier, behandlingsförhållanden och celltyper och tryck på Generera grupper. Gå till plattkartan och tilldela brunnar till varje grupp som ska analyseras.I protokollet kontrollerar du att kalibrering och jämvikt kontrolleras i initieringssteget. För baslinjemätningen och mätningarna efter varje injektion ställer du in antalet mätcykler till tre och blandar, väntar, mäter tider till tre minuter, noll minuter, tre minuter. Klicka på Starta körning på programvaran.Ta bort locket från de föreningar som laddas och hydratiseras sensorpatronen och placera den på arbetsbrickan i den extracellulära flödesanalysatorn. Påbörja kalibreringskörningen. Ta ut mikroplattan som innehåller de sådda cellerna från inkubatorn.Utan att störa cellerna, tillsätt långsamt 130 mikroliter av det förvärmda glykolysstresstestmediet per brunn för att kompensera medelvolymen i varje brunn till 180 mikroliter och återför plattan till inkubatorn i ytterligare 15 till 20 minuter. Klicka på Öppna facket på programvaran för att öppna Seahorses termiska bricka. När kalibreringen är över, byt ut verktygsplattan med denna analysmikroplatta som innehåller cellerna och tryck på load cell plate för att starta mätningarna.När mätningarna är över, ta bort analysmediet från plattan utan att störa cellerna och tvätta dem försiktigt med 250 mikroliter fosfatbuffrad saltlösning utan att lossa cellerna. Tillsätt nu 10 mikroliter radioimmunoprecipitationslysbuffert kompletterad med 1X proteashämmarcocktail till varje brunn och agitera plattan på en shaker i 10 minuter. Frys hela plattan vid minus 80 grader Celsius.Tina plattan och utför en proteinmätningsanalys för datanormalisering enligt tillverkarens instruktioner. Hämta och analysera data genom att öppna datafilen med hjälp av Wave-skrivbordsprogramvaran. Klicka på Normalisera, klistra in normaliseringsvärdena för varje brunn och klicka sedan på Apply för att normalisera data.Klicka på Exportera och välj glykolys stresstestrapportgenerator för att exportera analyserade data till en rapportgenerator. Den icke-glykolytiska försurningshastigheten stiger med ökat cellantal från 50 000 till 250 000, men ökar endast minimalt mellan 200 000 och 250 000. Injektion av 10 millimolär glukos stimulerar glykolys vid alla cellantal med en maximal ökning av ECAR observerad vid 250 000 celler per brunn.Injektion av två mikromolära oligomycin ökar emellertid inte ECAR ytterligare. OCR-data som erhållits i samma uppsättning glykolysstresstester visar en signifikant minskning efter oligomycininjektion på grund av komplex 5-hämning. Glykolysstresstestparametrar beräknades och 250 000 celler per brunn i två mikromolar oligomycin valdes ut för ytterligare studier.Det mitokondriella stresstestet visade att två mikromolära oligomycininjektioner orsakar en signifikant minskning av OCR via hämning av komplex 5. FCCP stimulerar OCR i HSPC på ett dosberoende sätt med en maximal ökning observerad vid två mikromolära. En blandning av 0,5 mikromolär rotenon och 0,5 mikromolär antimycin A-injektion minskar OCR till sin minimala nivå som motsvarar icke-mitokondriell syreförbrukning.Mitokondriella stresstestparametrar beräknades och två mikromolära FCCP valdes ut för vidare studier. Med tanke på den höga genomströmningen av denna teknik kan protokollet som beskrivs här enkelt anpassas för att screena ett stort antal bioenergetiska modulatorer i hematopoetiska stamceller, hematopoetiska förfäder och maligna hematopoetiska celler. Sjöhästanalys används ofta i litteraturen för att mäta metabolism i en mängd olika sammanhang i närvaro av olika substrat och hämmare.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolering och transplantation av hematopoetiska stamceller (HSCs)

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolering och analys av hematopoetiska stamceller från moderkakan

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-medierad Knockdown Under Ex vivo Erytropoes av mänskliga hematopoetiska stamceller

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypisk analys och isoleringen av murina hematopoietiska stamceller och Linjen-bundna stamfäder

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klon Spårning av hematopoetiska stam och progenitorceller märkta med fem fluorescerande proteiner med hjälp Konfokal och multifoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolering, karakterisering och hög genomströmning extracellulära Flux analys av mus primära renala tubulära epitelceller

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Mätning av energimetabolism i explanterad retinala vävnaden med hjälp av extracellulära Flux analys

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...