Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Forfatteren vil gerne takke Karoline Dittmer og Andrew Brittingham for deres indsigt og mange nyttige diskussioner. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 og 03-20-04).

1. Bestemmelse af glykogensyntaseaktivitet
<ol><li>Der fremstilles stamopløsninger af krævede reagenser som angivet i tabel 1 (før forsøgsdagen).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Komponent</td>
			<td colspan="2">Rutevejledning</td>
		</tr><tr><td>50 mM Tris pH 8,0</td>
			<td colspan="2">Opløs 0,61 g Tris base i ~ 80 ml vand.  Chill til 4 °C.   Juster pH til 8,0 med HCI og gør v...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism.">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li><li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase,+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose.">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li><li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1,6-glucosidase.">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li><li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose.">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li><li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis.">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li><li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases.">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li><li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues.">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li><li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates.">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li><li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,+6-diphosphatase,+phosphofructokinase,+glycogen+synthetase,+phosphorylase,+and+protein+kinase+from+swine+kidney.">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li><li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis.">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).</li><li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li><li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification,+properties+and+physiological+role.">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li><li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain:+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain.">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li><li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Enzymes Vol. 5. , 191-234 (1971).</li><li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+of+amylose+and+iodine.">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li><li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1,4,-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltansferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li><li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases.">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li><li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis:+An+unusual+member+of+the+starch/glycogen+synthase+family.">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-1,4-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver.">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li><li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

Generelt er de vigtigste fordele ved alle de præsenterede metoder deres lave omkostninger, lethed, hastighed og manglende afhængighed af specialudstyr. Den største ulempe, som de alle deler, er følsomhed sammenlignet med andre tilgængelige metoder. Følsomheden af de procedurer, der involverer produktion eller forbrug af NADH/NADPH, er let at estimere. I betragtning af at udryddelseskoefficienten for NADH / NADPH er 6,22 M-1 cm-1, indikerer simpel aritmetik, at ~ 10-20 μM ændringer i koncentration let k...

Glykogen er bredt fordelt i naturen, hvor forbindelsen findes i bakterier, mange protister, svampe og dyr. I mikroorganismer er glykogen vigtig for celleoverlevelse, når næringsstoffer er begrænsende, og i højere organismer som pattedyr tjener syntese og nedbrydning af glykogen til at buffer blodglukoseniveauer 1,2,3. Undersøgelsen af glykogenmetabolisme er derfor af betydning for så forskellige områder som mikrobiologi og pattedyrfysiologi. Forståelse af glykogenmetabolisme kræver undersøgelse af nøgleenzymerne i glykogensyntese (glykogensyntase og forgreningsenzymet) og glykogennedbrydning (glykogenphosphorylase og forgrenet enzym). Guldstandardanalyserne af glykogensyntase, phosphorylase, forgrening og afgrening af enzymaktiviteter anvender radioaktive isotoper. For eksempel måles glykogensyntase generelt i et stoppet radiokemisk assay ved at følge inkorporeringen af glucose fra UDP-[14 C] glucose (i tilfælde af dyre- og svampeenzymer) eller ADP-[14C] glucose (i tilfælde af bakterielle enzymer) i glykogen 4,5. Tilsvarende måles glykogenphosphorylase i retning af glykogensyntese efter inkorporering af glucose fra [14C] glucose-1-phosphat i glykogen6. Forgreningsenzymet analyseres ved at måle dette enzyms evne til at stimulere inkorporeringen af [14 C] glucose fra glucose-1-phosphat i α1,4-bundne kæder ved glykogenphosphorylase7, og afgrenende enzymaktivitet bestemmes ved at følge enzymets evne til at inkorporere [14C] glucose i glykogen8 . Selvom de er meget følsomme, tillader de deres anvendelse i rå celleekstrakter med lave niveauer af enzymaktivitet, er de radioaktive substrater dyre og underlagt de lovgivningsmæssige krav, der følger med radioisotopbrug. Disse barrierer placerer brugen af visse analyser uden for mange arbejdstageres rækkevidde. I løbet af mange år er der imidlertid beskrevet en imponerende række spektrofotometriske tilgange til måling af disse enzymer. Generelt er disse tilgange i sidste ende afhængige af at måle produktionen eller forbruget af NADH / NADPH eller genereringen af farvede komplekser mellem glykogen og jod. Således er de ligetil og kan udføres ved hjælp af enkle spektrofotometre udstyret med kun wolfram- eller xenon-blitzlamper.
Spektrofotometriske assays af glykogensyntase er afhængige af måling af nukleosiddiphosphat frigivet fra sukkernukleotiddonoren, da glucose tilsættes til den voksende glykogenkæde 9,10. Fremgangsmåden til måling af glykogensyntaseaktivitet, der er beskrevet i afsnit 1 i protokollen nedenfor, er en ændring af den, der er skitseret af Wayllace et al.11, og koblingsskemaet er vist nedenfor:
(Glukose) n + UPD-glucose → (glucose)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + phosphoenolpyruvat → pyruvat + ATP
Pyruvat + NADH + H + → laktat + NAD +
Glykogensyntase tilføjer glukose fra UDP-glucose til glykogen. UDP genereret i denne proces omdannes til UTP af nukleosiddiphosphatkinase (NDP-kinase) i en reaktion, der genererer ADP. ADP tjener igen som et substrat for pyruvatkinase, som phosphorylerer ADP ved anvendelse af phosphoenolpyruvat som fosfatdonor. Det resulterende pyruvat omdannes til lactat af enzymet lactat dehydrogenase i en reaktion, der forbruger NADH. Analysen kan derfor udføres kontinuerligt og overvåge faldet i absorbans ved 340 nm, når NADH forbruges. Det er let tilpasset til brug med enzymer, der kræver ADP-glucose som glukosedonor. Her er koblingstrinnene enklere, da ADP frigivet ved virkningen af glykogensyntase påvirkes direkte af pyruvatkinase.
Der er en række spektrofotometriske assays til rådighed til bestemmelse af glykogenphosphorylaseaktivitet. I den klassiske version drives enzymet baglæns i retning af glykogensyntese som vist nedenfor:
(Glukose) n + Glucose-1-phosphat → (glucose)n+1 + Pi
Med tidsbestemte intervaller fjernes alikvoter af reaktionsblandingen, og mængden af frigjort fosfat kvantificeres12,13. I vores hænder har dette assay været af begrænset anvendelse på grund af tilstedeværelsen af let målbart frit fosfat i mange kommercielle præparater af glucose-1-phosphat kombineret med de høje koncentrationer af glucose-1-phosphat, der kræves til phosphorylasevirkning. I stedet har vi rutinemæssigt anvendt et alternativt assay, der måler glukose-1-fosfat, der frigives som glykogen, nedbrydes af phosphorylase13. Der anvendes et koblet reaktionsskema, der er illustreret nedenfor.
(Glukose) n + Pi → (glucose)n-1 + glucose-1-phosphat
Glucose-1-phosphat → glucose-6-phosphat
Glucose-6-phosphat + NADP + → 6-phosphogluconolacton + NADPH + H +
Glucose-1-phosphatet omdannes til glucose-6-phosphat ved phosphoglucomutase, og glucose-6-phosphatet oxideres derefter til 6-phosphogluconolacton med samtidig reduktion af NADP + til NADPH. Proceduren, der er beskrevet i afsnit 2 i protokollen nedenfor, er afledt af metoder beskrevet af Mendicino et al.14 og Schreiber & Bowling 15. Analysen kan let udføres kontinuerligt med stigningen i absorbans ved 340 nm over tid, hvilket muliggør bestemmelse af reaktionshastigheden.
Spektrofotometrisk bestemmelse af forgrenet enzymaktivitet er afhængig af måling af glukosen frigivet ved enzymets virkning på phosphorylase limit dextrin16. Denne forbindelse fremstilles ved at behandle glykogen udtømmende med glykogenphosphorylase. Da glykogenphosphorylasevirkning stopper 4 glucoserester væk fra et α1,6-grenpunkt, indeholder grænsedextrin glykogen, hvis ydre kæder er blevet forkortet til ~ 4 glukoserester. Fremstilling af phosphorylase limit dextrin er beskrevet her ved hjælp af en procedure afledt af dem, der er udviklet af Taylor et al.17 og Makino & Omichi18.
Afgrening er en to-trins proces. 4-α-glucanotransferaseaktiviteten af det bifunktionelle afgreningsenzym overfører først tre glucoserester fra grenpunktet til den ikke-reducerende ende af en nærliggende α1,4-bundet glukosekæde. Den enkelte α1,6-bundne glucoserest, der er tilbage ved grenpunktet, hydrolyseres derefter af α1,6-glucosidaseaktiviteten19. Analysen udføres typisk på en stoppet måde, idet glukosen, der frigives efter en given tid (eller række gange), måles i et koblet enzymassay som vist nedenfor:
(Glukose) n → (glukose)n-1 + glukose 
Glucose + ATP → glucose-6-phosphat + ADP
Glucose-6-phosphat + NADP + → 6-phosphogluconolacton + NADPH + H +
Bestemmelsen af produceret NADPH giver et mål for glukoseproduktion. Den procedure, der er beskrevet i afsnit 3 i protokollen nedenfor, er baseret på en beskrevet af Nelson et al.16. Ligesom de andre metoder, der er afhængige af forbruget eller genereringen af NADH / NADPH, er analysen ret følsom. Tilstedeværelsen af amylaser eller andre glucosidaser, som også kan frigøre fri glucose fra phosphorylasegrænsedextrin, vil imidlertid forårsage betydelig interferens (se Diskussion).
Den kolorimetriske bestemmelse af forgrenet enzymaktivitet er afhængig af det faktum, at α1,4-bundne glukosekæder vedtager spiralformede strukturer, der binder til jod og danner farvede komplekser20. Farven på det dannede kompleks afhænger af længden af α1,4-bundne kæder. Således danner amylose, som består af lange, stort set uforgrenede kæder af α1,4-bundet glucose, et dybblåt kompleks med jod. I modsætning hertil danner glykogener, hvis ydre kæder generelt er i størrelsesordenen kun 6 til 8 glucoserester lange, orange-røde komplekser. Hvis en opløsning af amylose inkuberes med forgreningsenzym, resulterer indførelsen af grene i amylose i dannelsen af kortere α1,4-bundne glucosekæder. Således skifter absorptionsmaksimum for amylose / jodkomplekserne mod kortere bølgelængder. Den procedure, der diskuteres her, er afledt af den, der er beskrevet af Boyer & Preiss21 , og forgreningsenzymaktivitet kvantificeres som en reduktion i absorptionen af amylose / jodkomplekset ved 660 nm over tid.
Som det burde være let at se af diskussionen ovenfor, betyder det faktum, at farverne på de komplekser, der dannes mellem jod- og α1,4-glukosekæder, varierer med kædelængden, at absorbansspektrene for glykogen/jodkomplekser bør variere med graden af glykogenforgrening. Dette er faktisk tilfældet, og mindre forgrenede glykogener / glykogener med længere ydre kæder absorberer lys ved en længere bølgelængde end glykogener, der er mere forgrenede / har kortere ydre kæder. Jodfarvningsreaktionen kan derfor bruges til at opnå hurtige, kvalitative data om graden af glykogenforgrening22. Den orangebrune farve dannes, når glykogenkomplekser med jod ikke er særlig intens. Farveudviklingen kan dog forbedres ved inkludering af mættet calciumchloridopløsning22. Dette øger metodens følsomhed ca. 10 gange og muliggør klar analyse af mikrogrammængder af glykogen. Analysen til bestemmelse af forgrening, der er beskrevet i afsnit 4 i protokollen nedenfor, er tilpasset fra en procedure udviklet af Krisman22. Det udføres simpelthen ved at kombinere glykogenprøven med jodopløsning og calciumchlorid i en kuvette og opsamle absorptionsspektret fra 330 nm til 800 nm. Absorbansmaksimumet skifter mod længere bølgelængder, når forgreningsgraden falder.
Samlet set giver de metoder, der er beskrevet her, enkle, pålidelige midler til at vurdere aktiviteterne i de vigtigste enzymer i glykogenmetabolisme og til opnåelse af kvalitative data om omfanget af glykogenforgrening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

Glykogen syntetiseres som en opbevaringsform af glukose af en bred vifte af organismer, lige fra bakterier til dyr. Molekylet består af lineære kæder af α1,4-bundne glucoserester med grene introduceret ved tilsætning af α1,6-bindinger. At forstå, hvordan syntesen og nedbrydningen af glykogen reguleres, og hvordan glykogen opnår sin karakteristiske forgrenede struktur, kræver undersøgelse af enzymerne til glykogenlagring. Imidlertid anvender de metoder, der oftest anvendes til at studere disse enzymaktiviteter, typisk reagenser eller teknikker, der ikke er tilgængelige for alle efterforskere. Her diskuterer vi et batteri af procedurer, der er teknisk enkle, omkostningseffektive og alligevel i stand til at give værdifuld indsigt i kontrollen med glykogenlagring. Teknikkerne kræver adgang til et spektrofotometer, der opererer i området 330 til 800 nm, og er beskrevet under forudsætning af, at brugerne vil anvende engangskuvetter af plast. Procedurerne er dog let skalerbare og kan ændres til brug i en mikropladelæser, hvilket muliggør meget parallel analyse.

Bestemmelse af glykogensyntaseaktivitet Figur 1 viser repræsentative resultater fra glykogensyntaseassays ved anvendelse af oprensede enzymer. I panel A var der efter en lille forsinkelse et lineært fald i absorptionen ved 340 nm over tid i en periode på ca. 12 min. Ændringshastigheden i absorptionen i figur 1A var ~0,12 absorbansenheder/min. En ændringshastighed i absorbans mellem ~0,010 og ~0,20 absorbansenheder/min er optimal, og mæn...

Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Teknikker til måling af aktiviteten af nøgleenzymer af glykogenmetabolisme præsenteres ved hjælp af et simpelt spektrofotometer, der opererer i det synlige område.

Spektrofotometriske metoder til undersøgelse af eukaryot glykogenmetabolisme

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

Protokollerne er signifikante, fordi de undgår brugen af radioaktive isotoper og fjerner en barriere, der kan forhindre mange arbejdere i at studere enzymer af glykogenmetabolisme. De beskrevne procedurer er billige og kræver kun adgang til et simpelt spektrofotometer. For at starte med bestemmelsen af glykogensyntaseaktivitet optøes de tidligere fremstillede stamopløsninger af UDP-glucose, ATP, phosphoenolpyruvat og NDP-kinase på is.Forvarm et vandbad til 30 grader celsius. Når stamopløsningerne er klar, fremstilles tilstrækkelig analyseblanding i henhold til antallet af glykogensyntaseassays ved at tilsætte reagenserne til et 15 milliliter rør som beskrevet i tekstprotokollen. Forbered en blank reaktion ved at erstatte NADH fra reaktionsblandingen med vandet, og overfør reaktionen til en engangsmethacrylatkuvette.Brug den tomme reaktion til at indstille nul på spektrofotometeret ved bølgelængden på 340 nanometer. Tag en 770 mikroliter aliquot af reaktionsblandingen i et 1,5 ml rør, og tilsæt sekventielt to mikroliter hver NDP-kinase og pyruvatkinase lactatdehydrogenaseblanding til røret. Efter blanding inkuberes røret forsigtigt ved 30 grader celsius i vandbadet i tre minutter for at forvarme reaktionsblandingen.Derefter tilsættes 30 mikroliter af prøven indeholdende glykogensyntase i 20 millimolar Tris-buffer ved pH 7,8, og bland forsigtigt, inden reaktionsblandingen overføres til en bortskaffelse methacrylatkuvette. Placer kuvetten i spektrofotometeret, og registrer absorbansen ved 340 nanometer med tidsintervaller i 10 til 20 minutter. Derefter plottes de opnåede absorbanser mod tiden.For at måle den frigivne glukose overføres 40 mikroliter supernatant fra de opvarmede glykogenprøver til engangsmethacrylatkuvetterne. Og tilsæt de målte mængder triethanolamin, hydrochloridmagnesiumsulfatbuffer, NADP ATP-blanding og vand som beskrevet i manuskriptet. Bland blandingen ved at pipettere forsigtigt op og ned uden at skabe luftbobler.Tilsæt 0,5 mikroliter glucose-6-phosphat dehydrogenase til hver kuvette. Efter blanding ved pipettering inkuberes blandingen ved stuetemperatur i 10 minutter, og absorbansen registreres derefter ved 340 nanometer. Bland derefter 0,5 mikroliter hexokinase til hver kuvette som beskrevet tidligere, og inkuberes i 15 minutter, før det absorberende sæt optages 340 nanometer.Fortsæt derefter inkubationen ved stuetemperatur i fem minutter efterfulgt af optagelse af absorbansen. Hvis absorptionen er steget fra den, der er registreret efter 15 minutter, fortsættes inkubationen i fem minutter, før den endelige absorption registreres ved 340 nanometer. For at bestemme glykogenforgreningen kombineres 650 mikroliter jodcalciumchloridfarvereagenslager med 100 mikroliter vand i et 1,5 milliliter rør og blandes opløsningen grundigt, inden den overføres til en engangsmethacrylatkuvette.Placer kuvetten i spektrofotometeret for at udføre et løb i en bølgelængdescanningstilstand til opsamling af baggrundsspektret fra 330 til 800 nanometer. I et separat 1,5 ml rør kombineres 650 mikroliter af det arbejdende jodcalciumchloridfarvereagens med 50 mikrogram østersglykogen, og det endelige volumen fyldes til 750 mikroliter med vand. Efter blanding af blandingen grundigt overføres opløsningen til en engangsmethacrylatkuvette for at opsamle et absorptionsspektrum fra 330 til 800 nanometer.På samme måde opnås et absorptionsspektrum med 50 mikrogram amylopectin og 30 mikrogram amylose som beskrevet før. For at opnå en indikation af den forgrenede struktur af en ukarakteriseret glykogenprøve kombineres 25 til 50 mikrogram glykogen med 650 mikroliter af det arbejdende jodcalciumchloridfarvereagens og fortsætter som forklaret tidligere for at erhverve absorptionsspektret. I glykogensyntaseanalyserne blev der observeret et lineært fald i absorptionen ved 340 nanometer over tid.Tilsætning af for meget glykogensyntase til analysen fik reaktionen til at nå færdiggørelse inden for de første to minutter. Kontrolreaktionen, som ikke indeholdt glykogensyntase, viser intet målbart fald i absorbans. Dataene fra et glykogenphosphorylaseassay ved hjælp af et oprenset enzym havde en lineær fase, der varede i tre minutter.En absorbansforøgelse på omkring 0,01 til 0,04 enheder i minuttet er optimal. I glykogenforgreningsenzymassayet viste reaktionen en lineær fase, der vedvarede i mindst 10 minutter. De repræsentative data fra glykogenforgreningsenzymassays viste forskellen i absorbansen mellem kontrolprøverne, der manglede forgreningsenzym, og de reaktioner, der indeholdt forgreningsenzym.Det smalle dynamiske område af analysen er illustreret. Den maksimale ændring i absorbansen, der kan produceres, er 0, 4 absorbansenheder, og linearitet går tabt, når ændringen i absorptionen er ca. 0, 2 absorbansenheder. Masserne af glykogen, amylopectin og amylose, der blev anvendt i glykogenforgreningsvurderingen, viste en maksimal absorbansaflæsning på ca. 0,7 til 0,8, hver ved forskellige absorbansmaksima.Glykogenprøven producerede to toppe på ca. 400 nanometer og 460 nanometer. Jodcalciumchloridfarvereagenset er meget tæt. Det er vigtigt at sikre, at glykogenprøverne blandes fuldstændigt med reagenset, inden der opsamles et absorptionsspektrum.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Anatomy and Physiology

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

En metode til måling Metabolisme i Sorteret subpopulationer af Komplekse Cell Fællesskaber Brug stabile isotoper Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse af glycogenindholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestemmelse af Phycobiliprotein indhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposom målinger for studiet af Proton-pumpe membran enzymer ved hjælp af elektrokemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Udtryk, oploesning og rensning af eukaryote Borat transportører

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheder (SUBEs) som værktøjer til berigelse, isolation, identifikation og karakterisering af SUMO Proteome i leverkræft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

En integreret Raman spektroskopi og massespektrometri platform til at studere enkelt-celle stof optagelse, metabolisme, og effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...