Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
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L’auteur tient à remercier Karoline Dittmer et Andrew Brittingham pour leurs idées et leurs nombreuses discussions utiles. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l’Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 et 03-20-04).

1. Détermination de l’activité de la glycogène synthase
<ol><li>Préparer les solutions mères des réactifs requis comme indiqué dans le tableau 1 (avant le jour expérimental).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composant</td>
			<td colspan="2">Itinéraire</td>
		</tr><tr><td>50 mM Tris pH 8,0</td>
			<td colspan="2">Dissoudre 0,61 g de Tris base dans ~ 80 mL d’eau.  Refroidir ?...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism.">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li><li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase,+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose.">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li><li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1,6-glucosidase.">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li><li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose.">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li><li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis.">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li><li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases.">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li><li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues.">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li><li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates.">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li><li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,+6-diphosphatase,+phosphofructokinase,+glycogen+synthetase,+phosphorylase,+and+protein+kinase+from+swine+kidney.">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li><li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis.">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).</li><li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li><li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification,+properties+and+physiological+role.">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li><li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain:+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain.">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li><li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. 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Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li><li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases.">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li><li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis:+An+unusual+member+of+the+starch/glycogen+synthase+family.">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-1,4-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver.">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li><li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

En général, les principaux avantages de toutes les méthodes présentées sont leur faible coût, leur facilité, leur rapidité et leur manque de dépendance à l’égard d’équipements spécialisés. Le principal inconvénient qu’ils partagent tous est la sensibilité par rapport aux autres méthodes disponibles. La sensibilité des procédures impliquant la production ou la consommation de NADH/NADPH est facile à estimer. Étant donné que le coefficient d’extinction du NADH/NADPH est de 6,22 M-1 cm-1, une s...

Le glycogène est largement distribué dans la nature, le composé se trouvant dans les bactéries, de nombreux protistes, champignons et animaux. Dans les micro-organismes, le glycogène est important pour la survie des cellules lorsque les nutriments sont limitatifs et, chez les organismes supérieurs tels que les mammifères, la synthèse et la dégradation du glycogène servent à tamponner les niveaux de glucose sanguin 1,2,3. L’étude du métabolisme du glycogène est donc importante pour des domaines aussi divers que la microbiologie et la physiologie des mammifères. Comprendre le métabolisme du glycogène nécessite d’étudier les enzymes clés de la synthèse du glycogène (glycogène synthase et enzyme ramifiée) et de la dégradation du glycogène (glycogène phosphorylase et enzyme débranchante). Les dosages de référence des activités enzymatiques de glycogène synthase, de phosphorylase, de ramification et de débranchement utilisent des isotopes radioactifs. Par exemple, la glycogène synthase est généralement mesurée dans un essai radiochimique arrêté en suivant l’incorporation du glucose de l’UDP-[14 C]glucose (dans le cas des enzymes animales et fongiques) ou de l’ADP-[14C]glucose (dans le cas des enzymes bactériennes) dans le glycogène 4,5. De même, la glycogène phosphorylase est mesurée dans le sens de la synthèse du glycogène, suite à l’incorporation du glucose de [14C]glucose-1-phosphate dans le glycogène6. L’enzyme ramifiée est dosée en mesurant la capacité de cette enzyme à stimuler l’incorporation du [14 C]glucose du glucose-1-phosphate dans les chaînes liées α1,4 par la glycogène phosphorylase7, et l’activité enzymatique débranchante est déterminée en suivant la capacité de l’enzyme à incorporer [14C]glucose dans le glycogène8 . Bien que très sensibles, permettant leur utilisation dans des extraits cellulaires bruts à faible activité enzymatique, les substrats radioactifs sont coûteux et soumis aux exigences réglementaires liées à l’utilisation de radio-isotopes. Ces obstacles placent l’utilisation de certains tests hors de portée de nombreux travailleurs. Cependant, au cours de nombreuses années, une variété impressionnante d’approches spectrophotométriques pour la mesure de ces enzymes ont été décrites. En général, ces approches reposent en fin de compte sur la mesure de la production ou de la consommation de NADH / NADPH, ou la génération de complexes colorés entre le glycogène et l’iode. Ainsi, ils sont simples et peuvent être réalisés à l’aide de spectrophotomètres simples équipés uniquement de lampes flash au tungstène ou au xénon.
Les dosages spectrophotométriques de la glycogène synthase reposent sur la mesure du diphosphate nucléosidique libéré par le donneur de nucléotides de sucre lorsque le glucose est ajouté à la chaîne de glycogène 9,10 en croissance. La procédure de mesure de l’activité de la glycogène synthase décrite à la section 1 du protocole, ci-dessous, est une modification de celle décrite par Wayllace et coll.11, et le schéma de couplage est illustré ci-dessous :
(Glucose) n + UPD-glucose → (Glucose)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + phosphoénolpyruvate → pyruvate + ATP
Pyruvate + NADH + H+ → Lactate + NAD+
La glycogène synthase ajoute du glucose de l’UDP-glucose au glycogène. L’UDP généré dans ce processus est converti en UTP par nucléoside diphosphate kinase (NDP kinase), dans une réaction qui génère de l’ADP. L’ADP, à son tour, sert ensuite de substrat pour la pyruvate kinase, qui phosphoryle l’ADP en utilisant le phosphoénolpyruvate comme donneur de phosphate. Le pyruvate résultant est converti en lactate par l’enzyme lactate déshydrogénase dans une réaction qui consomme du NADH. Le test peut donc être effectué de manière continue, en surveillant la diminution de l’absorbance à 340 nm lorsque le NADH est consommé. Il est facilement adapté pour une utilisation avec des enzymes qui nécessitent du glucose ADP comme donneur de glucose. Ici, les étapes de couplage sont plus simples puisque l’ADP libéré par l’action de la glycogène synthase est directement agité par la pyruvate kinase.
Il existe une variété de tests spectrophotométriques disponibles pour la détermination de l’activité de la glycogène phosphorylase. Dans la version classique, l’enzyme est poussée vers l’arrière, dans le sens de la synthèse du glycogène, comme indiqué ci-dessous:
(Glucose) n + Glucose-1-phosphate → (Glucose)n+1 + Pi
A intervalles temporels, les aliquotes du mélange réactionnel sont éliminées et la quantité de phosphate libérée est quantifiée12,13. Dans nos mains, ce test a été d’une utilité limitée en raison de la présence de phosphate libre facilement mesurable dans de nombreuses préparations commerciales de glucose-1-phosphate, combinée aux concentrations élevées de glucose-1-phosphate nécessaires à l’action de la phosphorylase. Au lieu de cela, nous avons régulièrement utilisé un test alternatif qui mesure le glucose-1-phosphate libéré lorsque le glycogène est dégradé par la phosphorylase13. Un schéma de réaction couplée, illustré ci-dessous, est utilisé.
(Glucose) n + Pi → (Glucose)n-1 + Glucose-1-phosphate
Glucose-1-phosphate → Glucose-6-phosphate
Glucose-6-phosphate + NADP+ → 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
Le glucose-1-phosphate est converti en glucose-6-phosphate par la phosphoglucomutase, et le glucose-6-phosphate est ensuite oxydé en 6-phosphogluconolactone, avec la réduction concomitante du NADP+ en NADPH. La procédure détaillée à la section 2 du protocole, ci-dessous, est dérivée des méthodes décrites par Mendicino et al.14 et Schreiber & Bowling15. Le test peut être facilement effectué de manière continue, avec l’augmentation de l’absorbance à 340 nm au fil du temps, permettant la détermination de la vitesse de réaction.
La détermination spectrophotométrique de l’activité enzymatique débranchante repose sur la mesure du glucose libéré par l’action de l’enzyme sur la phosphorylase limite la dextrine16. Ce composé est fabriqué en traitant le glycogène de manière exhaustive avec de la glycogène phosphorylase. Étant donné que l’action de la glycogène phosphorylase arrête 4 résidus de glucose d’un point de branche α1,6, la dextrine limite contient du glycogène, dont les chaînes externes ont été raccourcies à ~4 résidus de glucose. La préparation de la dextrine limite de phosphorylase est décrite ici, en utilisant une procédure dérivée de celles développées par Taylor et al.17 et Makino & Omichi 18.
Le débranchement est un processus en deux étapes. L’activité de la 4-α-glucanotransférase de l’enzyme débranchante bifonctionnelle transfère d’abord trois résidus de glucose du point de branche à l’extrémité non réductrice d’une chaîne de glucose proche liée α1,4. Le seul résidu de glucose lié à l’α1,6 restant au point de branche est ensuite hydrolysé par l’activité α1,6-glucosidase19. Le test est généralement effectué de manière arrêtée, le glucose libéré après un temps donné (ou une série de fois) étant mesuré dans un dosage enzymatique couplé comme indiqué ci-dessous:
(Glucose) n → (glucose)n-1 + glucose 
Glucose + ATP → Glucose-6-phosphate + ADP
Glucose-6-phosphate + NADP+ → 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
La détermination du NADPH produit donne une mesure de la production de glucose. La procédure décrite à la section 3 du protocole, ci-dessous, est basée sur celle décrite par Nelson et al.16. Comme les autres méthodes qui reposent sur la consommation ou la génération de NADH / NADPH, le test est assez sensible. Cependant, la présence d’amylases ou d’autres glucosidases, qui peuvent également libérer le glucose libre de la phosphorylase limite la dextrine, provoquera des interférences importantes (voir Discussion).
La détermination colorimétrique de l’activité enzymatique ramifiée repose sur le fait que les chaînes de glucose liées à l’α1,4 adoptent des structures hélicoïdales qui se lient à l’iode, formant des complexes colorés20. La couleur du complexe formé dépend de la longueur des chaînes liées α1,4. Ainsi, l’amylose, qui consiste en de longues chaînes largement non ramifiées de glucose lié à α1,4, forme un complexe bleu profond avec de l’iode. En revanche, les glycogènes, dont les chaînes externes sont généralement de l’ordre de 6 à 8 résidus de glucose de long, forment des complexes rouge-orangé. Si une solution d’amylose est incubée avec une enzyme ramifiée, l’introduction de branches dans l’amylose entraîne la génération de chaînes de glucose plus courtes liées à α1,4. Ainsi, le maximum d’absorption des complexes amylose/iode se déplace vers des longueurs d’onde plus courtes. La procédure discutée ici est dérivée de celle détaillée par Boyer & Preiss21 et l’activité enzymatique ramifiée est quantifiée comme une réduction de l’absorption du complexe amylose / iode à 660 nm au fil du temps.
Comme il ressort clairement de la discussion ci-dessus, le fait que les couleurs des complexes formés entre les chaînes iodée et α1,4-glucose varient avec la longueur de la chaîne signifie que les spectres d’absorbance des complexes glycogène/iode devraient varier avec le degré de ramification du glycogène. C’est en effet le cas, et les glycogènes moins ramifiés / glycogènes avec des chaînes externes plus longues absorbent la lumière à une longueur d’onde plus longue que les glycogènes qui sont plus ramifiés / ont des chaînes externes plus courtes. La réaction de coloration à l’iode peut donc être utilisée pour obtenir des données qualitatives rapides sur le degré de ramification du glycogène22. La couleur brun orangé se forme lorsque les complexes de glycogène avec de l’iode ne sont pas particulièrement intenses. Cependant, le développement de la couleur peut être amélioré par l’inclusion d’une solution saturée de chlorure de calcium22. Cela multiplie par 10 la sensibilité de la méthode et permet une analyse facile des quantités de microgrammes de glycogène. Le dosage pour la détermination de la ramification décrit à la section 4 du protocole, ci-dessous, est adapté d’une procédure développée par Krisman22. Elle est réalisée simplement en combinant l’échantillon de glycogène avec une solution d’iode et de chlorure de calcium dans une cuvette et en collectant le spectre d’absorption de 330 nm à 800 nm. L’absorbance maximale se déplace vers des longueurs d’onde plus longues à mesure que le degré de ramification diminue.
Collectivement, les méthodes décrites ici fournissent des moyens simples et fiables d’évaluer les activités des enzymes clés du métabolisme du glycogène et d’obtenir des données qualitatives sur l’étendue de la ramification du glycogène.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

Le glycogène est synthétisé comme une forme de stockage du glucose par un large éventail d’organismes, allant des bactéries aux animaux. La molécule comprend des chaînes linéaires de résidus de glucose liés α1,4 avec des branches introduites par l’ajout de liaisons α1,6. Comprendre comment la synthèse et la dégradation du glycogène sont régulées et comment le glycogène atteint sa structure ramifiée caractéristique nécessite l’étude des enzymes de stockage du glycogène. Cependant, les méthodes les plus couramment utilisées pour étudier ces activités enzymatiques utilisent généralement des réactifs ou des techniques qui ne sont pas disponibles pour tous les chercheurs. Ici, nous discutons d’une batterie de procédures techniquement simples, rentables et pourtant capables de fournir des informations précieuses sur le contrôle du stockage du glycogène. Les techniques nécessitent l’accès à un spectrophotomètre, fonctionnant dans la plage de 330 à 800 nm, et sont décrites en supposant que les utilisateurs utiliseront des cuvettes en plastique jetables. Cependant, les procédures sont facilement évolutives et peuvent être modifiées pour une utilisation dans un lecteur de microplaques, permettant une analyse hautement parallèle.

Détermination de l’activité de la glycogène synthase La figure 1 montre des résultats représentatifs d’essais de glycogène synthase utilisant des enzymes purifiées. Dans le panneau A, après un léger décalage, on a observé une diminution linéaire de l’absorption à 340 nm au fil du temps pendant une période d’environ 12 min. Le taux de variation de l’absorption sur la figure 1A était de ~0,12 unité d’absorbance/min. ...

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Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Des techniques pour mesurer l’activité des enzymes clés du métabolisme du glycogène sont présentées, à l’aide d’un spectrophotomètre simple fonctionnant dans la plage visible.

Méthodes spectrophotométriques pour l’étude du métabolisme du glycogène eucaryote

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

Les protocoles sont importants, car ils évitent l’utilisation d’isotopes radioactifs et éliminent une barrière qui peut empêcher de nombreux travailleurs d’étudier les enzymes du métabolisme du glycogène. Les procédures décrites sont peu coûteuses et ne nécessitent que l’accès à un simple spectrophotomètre. Pour commencer par la détermination de l’activité de la glycogène synthase, décongelez les solutions mères préalablement préparées de glucose UDP, d’ATP, de phosphoénolpyruvate et de kinase NDP sur de la glace.Préchauffez un bain-marie à 30 degrés Celsius. Lorsque les solutions mères sont prêtes, préparer suffisamment de mélange de dosage en fonction du nombre de dosages de glycogène synthase en ajoutant les réactifs dans un tube de 15 millilitres, comme décrit dans le protocole texte. Préparer une réaction à blanc en remplaçant le NADH du mélange réactionnel par de l’eau, et transférer la réaction dans une cuvette de méthacrylate jetable.Utilisez la réaction à blanc pour mettre zéro sur le spectrophotomètre à la longueur d’onde de 340 nanomètres. Prenez une aliquote de 770 microlitres du mélange réactionnel dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez séquentiellement deux microlitres chacun de la kinase NDP et du mélange de lactate déshydrogénase pyruvate kinase dans le tube. Après mélange, incuber doucement le tube à 30 degrés Celsius au bain-marie pendant trois minutes pour préchauffer le mélange réactionnel.Ajouter ensuite 30 microlitres de l’échantillon contenant la glycogène synthase dans un tampon Tris 20 millimolaires à pH 7,8, et mélanger doucement avant de transférer le mélange réactionnel dans une cuvette de méthacrylate d’élimination. Placez la cuvette dans le spectrophotomètre et enregistrez l’absorbance à 340 nanomètres à intervalles chronométrés pendant 10 à 20 minutes. Ensuite, tracez les absorbances obtenues en fonction du temps.Pour mesurer le glucose libéré, transférer 40 microlitres du surnageant des échantillons de glycogène chauffés vers les cuvettes de méthacrylate jetables. Et ajoutez les volumes mesurés de triéthanolamine, de tampon de sulfate de chlorhydrate de magnésium, de mélange ATP NADP et d’eau comme décrit dans le manuscrit. Mélanger le mélange en pipetant doucement de haut en bas sans créer de bulles d’air.Ajouter 0,5 microlitre de glucose-6-phosphate déshydrogénase à chaque cuvette. Après mélange par pipetage, incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes, puis enregistrer l’absorbance à 340 nanomètres. Ensuite, mélangez 0,5 microlitre d’hexokinase à chaque cuvette comme décrit précédemment, et incuber pendant 15 minutes avant d’enregistrer l’ensemble absorbant de 340 nanomètres.Continuez ensuite l’incubation à température ambiante pendant cinq minutes, puis enregistrez l’absorbance. Si l’absorption a augmenté par rapport à celle enregistrée à 15 minutes, poursuivre l’incubation pendant cinq minutes avant d’enregistrer l’absorption finale à 340 nanomètres. Pour déterminer la ramification du glycogène, combinez 650 microlitres de stock de réactif de couleur chlorure de calcium iodé avec 100 microlitres d’eau dans un tube de 1,5 millilitre et mélangez soigneusement la solution avant de la transférer dans une cuvette de méthacrylate jetable.Placez la cuvette dans le spectrophotomètre pour effectuer un passage en mode de balayage de longueur d’onde pour collecter le spectre de fond de 330 à 800 nanomètres. Dans un tube séparé de 1,5 millilitre, mélanger 650 microlitres du réactif de couleur au chlorure de calcium iodé avec 50 microgrammes de glycogène de l’huître et compléter le volume final à 750 microlitres avec de l’eau. Après avoir bien mélangé le mélange, transférer la solution dans une cuvette de méthacrylate jetable pour recueillir un spectre d’absorption de 330 à 800 nanomètres.De même, obtenir un spectre d’absorption avec 50 microgrammes d’amylopectine et 30 microgrammes d’amylose comme décrit précédemment. Pour obtenir une indication de la structure ramifiée d’un échantillon de glycogène non caractérisé, combiner 25 à 50 microgrammes du glycogène avec 650 microlitres du réactif de couleur chlorure de calcium iodé fonctionnel, et procéder comme expliqué précédemment pour acquérir le spectre d’absorption. Dans les essais de glycogène synthase, une diminution linéaire de l’absorption à 340 nanomètres au fil du temps a été observée.L’ajout d’une trop grande quantité de glycogène synthase au test a permis à la réaction d’atteindre son achèvement dans les deux premières minutes. La réaction de contrôle, qui ne contenait pas de glycogène synthase, ne montre aucune diminution mesurable de l’absorbance. Les données d’un test de glycogène phosphorylase utilisant une enzyme purifiée avaient une phase linéaire d’une durée de trois minutes.Un taux d’augmentation de l’absorbance d’environ 0,01 à 0,04 unité par minute est optimal. Dans le test de l’enzyme de déramification du glycogène, la réaction a montré une phase linéaire persistant pendant au moins 10 minutes. Les données représentatives des essais d’enzymes ramifiées du glycogène ont montré la différence d’absorbance entre les échantillons témoins dépourvus d’enzymes ramifiées et les réactions contenant une enzyme ramifiée.La plage dynamique étroite du test est illustrée. La variation maximale de l’absorbance qui peut être produite est de 0,4 unité d’absorbance, et la linéarité est perdue lorsque la variation de l’absorption est d’environ 0,2 unité d’absorbance. Les masses de glycogène, d’amylopectine et d’amylose utilisées dans l’évaluation de la ramification du glycogène ont affiché une lecture d’absorbance maximale d’environ 0,7 à 0,8, chacune à des maxima d’absorbance différents.L’échantillon de glycogène a produit deux pics à environ 400 nanomètres et 460 nanomètres. Le réactif de couleur chlorure de calcium iodé est très dense. Il est important de s’assurer que les échantillons de glycogène sont complètement mélangés avec le réactif avant de prélever un spectre d’absorption.

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