Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
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Der Autor dankt Karoline Dittmer und Andrew Brittingham für ihre Einblicke und viele hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IÖR 03-17-05 und 03-20-04) unterstützt.

1. Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität
<ol><li>Bereiten Sie die Stammlösungen der erforderlichen Reagenzien gemäß Tabelle 1 (vor dem Versuchstag) vor.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestandteil</td>
			<td colspan="2">Wegbeschreibungen</td>
		</tr><tr><td>50 mM Tris pH 8,0</td>
			<td colspan="2">Lösen Sie 0,61 g Tris-Base in ~ 80 ml Wasser auf.  Auf 4 °C abkühlen.   Stel...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. 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Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. 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Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. 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R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

Im Allgemeinen sind die Hauptvorteile aller vorgestellten Methoden ihre niedrigen Kosten, Einfachheit, Geschwindigkeit und fehlende Abhängigkeit von Spezialgeräten. Der größte Nachteil, den sie alle teilen, ist die Empfindlichkeit im Vergleich zu anderen verfügbaren Methoden. Die Sensitivität der Verfahren, die die Produktion oder den Verbrauch von NADH / NADPH beinhalten, ist leicht abzuschätzen. Da der Extinktionskoeffizient von NADH/NADPH 6,22 M-1 cm-1 beträgt, zeigt einfache Arithmetik, dass ~10-20...

Glykogen ist in der Natur weit verbreitet, wobei die Verbindung in Bakterien, vielen Protisten, Pilzen und Tieren gefunden wird. In Mikroorganismen ist Glykogen wichtig für das Überleben der Zellen, wenn Nährstoffe begrenzt sind, und in höheren Organismen wie Säugetieren dienen Synthese und Abbau von Glykogen dazu, den Blutzuckerspiegel zu puffern 1,2,3. Die Untersuchung des Glykogenstoffwechsels ist daher für so unterschiedliche Bereiche wie die Mikrobiologie und die Säugetierphysiologie von Bedeutung. Um den Glykogenstoffwechsel zu verstehen, müssen die Schlüsselenzyme der Glykogensynthese (Glykogensynthase und das verzweigte Enzym) und des Glykogenabbaus (Glykogenphosphorylase und Debranching-Enzym) untersucht werden. Die Goldstandard-Assays von Glykogensynthase, Phosphorylase, Verzweigung und Entzweigung von Enzymaktivitäten verwenden radioaktive Isotope. Zum Beispiel wird die Glykogensynthase im Allgemeinen in einem gestoppten radiochemischen Assay gemessen, indem Glukose aus UDP-[14 C]glucose (im Fall von tierischen und Pilzenzymen) oder ADP-[14C]glucose (im Fall von bakteriellen Enzymen) in Glykogen 4,5 eingebaut wird. In ähnlicher Weise wird die Glykogenphosphorylase in Richtung der Glykogensynthese gemessen, nachdem Glukose aus [14C]glucose-1-phosphat in Glykogen6 eingebaut wurde. Das verzweigte Enzym wird durch Messung der Fähigkeit dieses Enzyms untersucht, den Einbau von [14 C]glucose aus Glucose-1-phosphat in α1,4-verknüpfte Ketten durch Glykogenphosphorylase7 zu stimulieren, und die Entzweigungsenzymaktivität wird bestimmt, indem die Fähigkeit des Enzyms verfolgt wird, [14C]glucose in Glykogen einzubauen8 . Obwohl sie sehr empfindlich sind und ihre Verwendung in Rohzellextrakten mit geringer Enzymaktivität ermöglichen, sind die radioaktiven Substrate teuer und unterliegen den regulatorischen Anforderungen, die mit der Verwendung von Radioisotopen verbunden sind. Diese Barrieren machen die Verwendung bestimmter Assays für viele Arbeiter unerreichbar. Im Laufe vieler Jahre wurde jedoch eine beeindruckende Vielfalt spektrophotometrischer Ansätze zur Messung dieser Enzyme beschrieben. Im Allgemeinen beruhen diese Ansätze letztendlich auf der Messung der Produktion oder des Verbrauchs von NADH / NADPH oder der Erzeugung von Farbkomplexen zwischen Glykogen und Jod. Daher sind sie unkompliziert und können mit einfachen Spektralphotometern durchgeführt werden, die nur mit Wolfram- oder Xenon-Blitzlampen ausgestattet sind.
Spektrophotometrische Assays der Glykogensynthase beruhen auf der Messung des Nukleosiddiphosphats, das vom Zuckernukleotiddonor freigesetzt wird, wenn Glukose zur wachsenden Glykogenkette 9,10 hinzugefügt wird. Das in Abschnitt 1 des Protokolls beschriebene Verfahren zur Messung der Glykogensynthaseaktivität ist eine Modifikation des von Wayllace et al.11 beschriebenen Verfahrens, und das Kopplungsschema ist unten dargestellt:
(Glukose) n + UPD-Glukose → (Glukose)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + Phosphoenolpyruvat → Pyruvat + ATP
Pyruvat + NADH + H+ → Laktat + NAD+
Glykogensynthase fügt Glukose aus UDP-Glucose zu Glykogen hinzu. Das dabei erzeugte UDP wird durch Nukleosiddiphosphatkinase (NDP-Kinase) in eine Reaktion umgewandelt, die ADP erzeugt. Das ADP wiederum dient dann als Substrat für die Pyruvatkinase, die das ADP mit Phosphoenolpyruvat als Phosphatdonor phosphoryliert. Das entstehende Pyruvat wird durch das Enzym Laktatdehydrogenase in einer Reaktion, die NADH verbraucht, in Laktat umgewandelt. Der Assay kann daher kontinuierlich durchgeführt werden, wobei die Abnahme der Absorption bei 340 nm überwacht wird, wenn NADH verbraucht wird. Es ist leicht für die Verwendung mit Enzymen geeignet, die ADP-Glukose als Glukosespender benötigen. Hier sind die Kopplungsschritte einfacher, da das ADP, das durch die Wirkung der Glykogensynthase freigesetzt wird, direkt von der Pyruvatkinase beeinflusst wird.
Es gibt eine Vielzahl von spektrophotometrischen Assays zur Bestimmung der Glykogenphosphorylase-Aktivität. In der klassischen Version wird das Enzym rückwärts in Richtung der Glykogensynthese getrieben, wie unten gezeigt:
(Glukose) n + Glucose-1-phosphat → (Glucose)n+1 + Pi
In zeitlichen Abständen werden Aliquots des Reaktionsgemisches entfernt und die freigesetzte Phosphatmenge mit12,13 quantifiziert. In unseren Händen war dieser Assay aufgrund des Vorhandenseins von leicht messbarem freiem Phosphat in vielen kommerziellen Zubereitungen von Glucose-1-phosphat, kombiniert mit den hohen Konzentrationen von Glucose-1-phosphat, die für die Phosphorylase-Wirkung erforderlich sind, von begrenztem Nutzen. Vielmehr haben wir routinemäßig einen alternativen Assay verwendet, der das Glucose-1-phosphat misst, das freigesetzt wird, wenn Glykogen durch Phosphorylase13 abgebaut wird. Es wird ein gekoppeltes Reaktionsschema verwendet, das unten dargestellt ist.
(Glukose) n + Pi → (Glucose)n-1 + Glucose-1-phosphat
Glucose-1-phosphat → Glucose-6-phosphat
Glucose-6-phosphat + NADP+ → 6-Phosphogluconolacton + NADPH + H+
Das Glucose-1-phosphat wird durch Phosphoglucomutase in Glucose-6-phosphat umgewandelt, und das Glucose-6-phosphat wird dann zu 6-Phosphogluconolacton oxidiert, mit der gleichzeitigen Reduktion von NADP+ zu NADPH. Das in Abschnitt 2 des Protokolls beschriebene Verfahren leitet sich von den von Mendicino et al.14 und Schreiber & Bowling 15 beschriebenen Methoden ab. Der Assay kann problemlos kontinuierlich durchgeführt werden, wobei die Absorption bei 340 nm im Laufe der Zeit zunimmt, was die Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit ermöglicht.
Die spektrophotometrische Bestimmung der Debranching-Enzymaktivität beruht auf der Messung der Glukose, die durch die Wirkung des Enzyms auf Phosphorylase-Grenzdextrin16 freigesetzt wird. Diese Verbindung wird durch erschöpfende Behandlung von Glykogen mit Glykogenphosphorylase hergestellt. Da die Glykogenphosphorylase-Wirkung 4 Glucosereste von einem α1,6-Zweigpunkt entfernt stoppt, enthält das Grenzdextrin Glykogen, dessen äußere Ketten auf ~4 Glucosereste verkürzt wurden. Die Herstellung von Phosphorylase-Grenzdextrin wird hier unter Verwendung eines Verfahrens beschrieben, das von den von Taylor et al.17 und Makino & Omichi 18 entwickelten Verfahren abgeleitet ist.
Die Entzweigung ist ein zweistufiger Prozess. Die 4-α-Glucanotransferase-Aktivität des bifunktionellen Entzweigungsenzyms überträgt zunächst drei Glucosereste vom Zweigpunkt zum nicht-reduzierenden Ende einer nahe gelegenen α1,4-verknüpften Glucosekette. Der einzelne, α1,6-verknüpfte Glucoserest, der am Zweigpunkt verbleibt, wird dann durch die α1,6-Glucosidase-Aktivität19 hydrolysiert. Der Assay wird typischerweise in einer gestoppten Weise durchgeführt, wobei die nach einer bestimmten Zeit (oder einer Reihe von Malen) freigesetzte Glukose in einem gekoppelten Enzymassay gemessen wird, wie unten gezeigt:
(Glukose) n → (Glukose)n-1 + Glukose 
Glucose + ATP → Glucose-6-phosphat + ADP
Glucose-6-phosphat + NADP+ → 6-Phosphogluconolacton + NADPH + H+
Die Bestimmung der produzierten NADPH gibt ein Maß für die Glukoseproduktion. Das in Abschnitt 3 des Protokolls beschriebene Verfahren basiert auf einem von Nelson et al.16 beschriebenen Verfahren. Wie die anderen Methoden, die auf dem Verbrauch oder der Erzeugung von NADH / NADPH beruhen, ist der Assay sehr empfindlich. Das Vorhandensein von Amylasen oder anderen Glucosidasen, die auch freie Glukose aus Phosphorylase-Grenzdextrin freisetzen können, führt jedoch zu erheblichen Störungen (siehe Diskussion).
Die kolorimetrische Bestimmung der verzweigten Enzymaktivität beruht auf der Tatsache, dass α1,4-verknüpfte Glukoseketten helikale Strukturen annehmen, die an Jod binden und farbige Komplexe bilden20. Die Farbe des gebildeten Komplexes hängt von der Länge der α1,4-verknüpften Ketten ab. So bildet Amylose, die aus langen, weitgehend unverzweigten Ketten von α1,4-verknüpfter Glucose besteht, mit Jod einen tiefblauen Komplex. Im Gegensatz dazu bilden Glykogene, deren äußere Ketten in der Regel nur 6 bis 8 Glukosereste lang sind, orangerote Komplexe. Wenn eine Lösung von Amylose mit verzweigtem Enzym inkubiert wird, führt die Einführung von Zweigen in die Amylose zur Bildung kürzerer α1,4-verknüpfter Glucoseketten. Somit verschiebt sich das Absorptionsmaximum der Amylose/Jod-Komplexe in Richtung kürzerer Wellenlängen. Das hier diskutierte Verfahren leitet sich von dem von Boyer & Preiss21 beschriebenen ab, und die Verzweigungsenzymaktivität wird als Verringerung der Absorption des Amylose/Iod-Komplexes bei 660 nm im Laufe der Zeit quantifiziert.
Wie aus der obigen Diskussion leicht ersichtlich sein sollte, bedeutet die Tatsache, dass die Farben der zwischen Jod und α1,4-Glucoseketten gebildeten Komplexe mit der Kettenlänge variieren, dass die Absorptionsspektren von Glykogen/Jod-Komplexen mit dem Grad der Glykogenverzweigung variieren sollten. Dies ist in der Tat der Fall, und weniger verzweigte Glykogene / Glykogene mit längeren äußeren Ketten absorbieren Licht bei einer längeren Wellenlänge als Glykogene, die stärker verzweigt sind / kürzere äußere Ketten haben. Die Jodfärbungsreaktion kann daher genutzt werden, um schnelle, qualitative Daten über den Grad der Glykogenverzweigung zu gewinnen22. Die orange-braune Farbe bildet sich, wenn Glykogenkomplexe mit Jod nicht besonders intensiv sind. Die Farbentwicklung kann jedoch durch die Aufnahme von gesättigter Calciumchloridlösung22 verbessert werden. Dies erhöht die Empfindlichkeit der Methode um das 10-fache und ermöglicht eine fertige Analyse von Mikrogrammmengen an Glykogen. Der in Abschnitt 4 des Protokolls beschriebene Assay zur Bestimmung der Verzweigung basiert auf einem von Krisman22 entwickelten Verfahren. Es wird einfach durchgeführt, indem die Glykogenprobe mit Jodlösung und Calciumchlorid in einer Küvette kombiniert und das Absorptionsspektrum von 330 nm bis 800 nm gesammelt wird. Das Absorptionsmaximum verschiebt sich in Richtung längerer Wellenlängen, wenn der Verzweigungsgrad abnimmt.
Insgesamt bieten die hier beschriebenen Methoden einfache, zuverlässige Mittel, um die Aktivitäten der Schlüsselenzyme des Glykogenstoffwechsels zu bewerten und qualitative Daten über das Ausmaß der Glykogenverzweigung zu erhalten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

Glykogen wird als Speicherform von Glukose von einer Vielzahl von Organismen synthetisiert, die von Bakterien bis hin zu Tieren reichen. Das Molekül besteht aus linearen Ketten von α1,4-verknüpften Glucoseresten, deren Verzweigungen durch Zugabe von α1,6-Bindungen eingebracht werden. Um zu verstehen, wie die Synthese und der Abbau von Glykogen reguliert werden und wie Glykogen seine charakteristische verzweigte Struktur erreicht, müssen die Enzyme der Glykogenspeicherung untersucht werden. Die am häufigsten verwendeten Methoden zur Untersuchung dieser Enzymaktivitäten verwenden jedoch typischerweise Reagenzien oder Techniken, die nicht allen Forschern zur Verfügung stehen. Hier diskutieren wir eine Reihe von Verfahren, die technisch einfach, kostengünstig und dennoch in der Lage sind, wertvolle Einblicke in die Steuerung der Glykogenspeicherung zu liefern. Die Techniken erfordern den Zugang zu einem Spektralphotometer, das im Bereich von 330 bis 800 nm arbeitet, und werden unter der Annahme beschrieben, dass die Benutzer Einweg-Kunststoffküvetten verwenden. Die Verfahren sind jedoch leicht skalierbar und können für den Einsatz in einem Mikrotiterplatten-Reader modifiziert werden, was eine hochgradig parallele Analyse ermöglicht.

Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse von Glykogensynthase-Assays unter Verwendung gereinigter Enzyme. In Panel A kam es nach einer leichten Verzögerung zu einer linearen Abnahme der Absorption bei 340 nm über einen Zeitraum von etwa 12 min. Die Änderungsrate der Absorption in Abbildung 1A betrug ~0,12 Absorptionseinheiten/min. Eine Änderungsrate der Absorption zwischen ~0,010 und ~0,20 Ab...

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Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Techniken zur Messung der Aktivität von Schlüsselenzymen des Glykogenstoffwechsels werden vorgestellt, wobei ein einfaches Spektralphotometer verwendet wird, das im sichtbaren Bereich arbeitet.

Spektrophotometrische Methoden zur Untersuchung des eukaryotischen Glykogenstoffwechsels

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

Die Protokolle sind von Bedeutung, weil sie die Verwendung radioaktiver Isotope vermeiden und eine Barriere beseitigen, die viele Arbeiter daran hindern kann, Enzyme des Glykogenstoffwechsels zu untersuchen. Die beschriebenen Verfahren sind kostengünstig und erfordern nur den Zugang zu einem einfachen Spektralphotometer. Um mit der Bestimmung der Glykogensynthaseaktivität zu beginnen, tauen Sie die zuvor hergestellten Stammlösungen von UDP-Glucose, ATP, Phosphoenolpyruvat und NDP-Kinase auf Eis auf.Ein Wasserbad auf 30 Grad Celsius vorheizen. Wenn die Stammlösungen fertig sind, ist eine ausreichende Assaymischung entsprechend der Anzahl der Glykogensynthase-Assays herzustellen, indem die Reagenzien in ein 15-Milliliter-Röhrchen gegeben werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie eine Blindreaktion vor, indem Sie das NADH aus der Reaktionsmischung durch das Wasser ersetzen, und übertragen Sie die Reaktion auf eine Einweg-Methacrylatküvette.Verwenden Sie die Blindreaktion, um das Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 340 Nanometern auf Null zu setzen. Nehmen Sie ein Aliquot von 770 Mikrolitern des Reaktionsgemisches in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie nacheinander jeweils zwei Mikroliter NDP-Kinase und Pyruvatkinase-Laktatdehydrogenase-Mischung in das Röhrchen hinzu. Nach dem Mischen das Röhrchen bei 30 Grad Celsius im Wasserbad drei Minuten vorsichtig inkubieren, um das Reaktionsgemisch vorzuwärmen.Dann werden 30 Mikroliter der Glykogensynthase-haltigen Probe in 20 Millimolar Tris-Puffer bei pH 7,8 gegeben und vorsichtig gemischt, bevor das Reaktionsgemisch in eine Entsorgungsmethacrylatküvette überführt wird. Legen Sie die Küvette in das Spektralphotometer und zeichnen Sie die Absorption bei 340 Nanometern in zeitlichen Intervallen für 10 bis 20 Minuten auf. Zeichnen Sie dann die erhaltenen Absorptionswerte gegen die Zeit auf.Um die freigesetzte Glukose zu messen, übertragen Sie 40 Mikroliter des Überstands aus den erhitzten Glykogenproben in die Einweg-Methacrylatküvetten. Und fügen Sie die gemessenen Volumina von Triethanolamin, Hydrochlorid-Magnesiumsulfat-Puffer, NADP-ATP-Mischung und Wasser hinzu, wie im Manuskript beschrieben. Mischen Sie die Mischung, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen zu erzeugen.Fügen Sie 0,5 Mikroliter Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zu jeder Küvette hinzu. Nach dem Mischen durch Pipettieren die Mischung bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren und dann die Absorption bei 340 Nanometern aufzeichnen. Als nächstes mischen Sie 0,5 Mikroliter Hexokinase in jede Küvette, wie zuvor beschrieben, und inkubieren Sie für 15 Minuten, bevor Sie das absorbierende Set 340 Nanometer aufnehmen.Dann setzen Sie die Inkubation bei Raumtemperatur für fünf Minuten fort, gefolgt von der Aufzeichnung der Extinktion. Wenn die Absorption gegenüber der nach 15 Minuten aufgezeichneten Absorption zugenommen hat, setzen Sie die Inkubation für fünf Minuten fort, bevor Sie die endgültige Absorption bei 340 Nanometern aufzeichnen. Um die Glykogenverzweigung zu bestimmen, kombinieren Sie 650 Mikroliter Jod-Calciumchlorid-Farbreagenzien mit 100 Mikrolitern Wasser in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie die Lösung gründlich, bevor Sie sie in eine Einweg-Methacrylatküvette überführen.Platzieren Sie die Küvette im Spektralphotometer, um einen Lauf in einem Wellenlängen-Scanning-Modus durchzuführen, um das Hintergrundspektrum von 330 bis 800 Nanometern zu erfassen. In einem separaten 1,5-Milliliter-Röhrchen 650 Mikroliter des Arbeitsjod-Calciumchlorid-Farbreagenzes mit 50 Mikrogramm des Austernglykogens verbinden und das Endvolumen mit Wasser auf 750 Mikroliter bilden. Nach gründlichem Mischen der Mischung wird die Lösung in eine Einweg-Methacrylatküvette überführt, um ein Absorptionsspektrum von 330 bis 800 Nanometern zu sammeln.In ähnlicher Weise erhält man ein Absorptionsspektrum mit 50 Mikrogramm Amylopektin und 30 Mikrogramm Amylose, wie zuvor beschrieben. Um einen Hinweis auf die verzweigte Struktur einer nicht charakterisierten Glykogenprobe zu erhalten, kombinieren Sie 25 bis 50 Mikrogramm des Glykogens mit 650 Mikrolitern des arbeitenden Jod-Calciumchlorid-Farbreagenzes und gehen Sie wie zuvor beschrieben vor, um das Absorptionsspektrum zu erfassen. In den Glykogensynthase-Assays wurde eine lineare Abnahme der Absorption bei 340 Nanometern im Laufe der Zeit beobachtet.Die Zugabe von zu viel Glykogensynthase zum Assay führte dazu, dass die Reaktion innerhalb der ersten zwei Minuten abgeschlossen war. Die Kontrollreaktion, die keine Glykogensynthase enthielt, zeigte keine messbare Abnahme der Resorption. Die Daten eines Glykogenphosphorylase-Assays mit einem gereinigten Enzym hatten eine lineare Phase, die drei Minuten dauerte.Eine Absorptionsrate von etwa 0,01 bis 0,04 Einheiten pro Minute ist optimal. Im Glykogen-Debranching-Enzym-Assay zeigte die Reaktion eine lineare Phase, die mindestens 10 Minuten anhielt. Die repräsentativen Daten aus den Glykogenverzweigungsenzym-Assays zeigten den Unterschied in der Absorption zwischen den Kontrollproben, denen das verzweigte Enzym fehlte, und den Reaktionen, die verzweigtes Enzym enthielten.Der enge dynamische Bereich des Assays wird veranschaulicht. Die maximale Änderung der Extinktion, die erzeugt werden kann, beträgt 0,4 Absorptionseinheiten, und die Linearität geht verloren, wenn die Änderung der Absorption etwa 0,2 Absorptionseinheiten beträgt. Die Massen von Glykogen, Amylopektin und Amylose, die bei der Bewertung der Glykogenverzweigung verwendet wurden, zeigten einen maximalen Extinktionswert von etwa 0,7 bis 0,8, jeweils bei unterschiedlichen Absorptionsmaxima.Die Glykogenprobe produzierte zwei Peaks bei etwa 400 Nanometern und 460 Nanometern. Das Jod-Calciumchlorid-Farbreagenz ist sehr dicht. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Glykogenproben vollständig mit dem Reagenz vermischt sind, bevor ein Absorptionsspektrum gesammelt wird.

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A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Ein Verfahren zur Messung des Metabolismus in sortierter Subpopulationen von komplexen Zell Gemeinschaften Verwendung stabiler Isotopen-Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Forschung

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Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie über den Stoffwechsel von sechs systemischen Insektiziden in einer neu etablierten Zellsuspensionskultur abgeleitet aus Tee (Camellia Sinensis L.) Blätter

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities (SUBEs) als Werkzeuge zur Anreicherung, Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung des SUMO-Proteoms bei Leberkrebs

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Eine integrierte Raman-Spektroskopie- und Massenspektrometrie-Plattform zur Untersuchung der Aufnahme von Einzelzellen-Medikamenten, des Stoffwechsels und der Effekte

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...