Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

המחבר רוצה להודות לקרוליין דיטמר ואנדרו בריטינגהם על תובנותיהם ודיונים מועילים רבים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מקרן החינוך והמחקר האוסטאופתית של איווה (IOER 03-17-05 ו- 03-20-04).

1. קביעת פעילות גליקוגן סינתאז
<ol><li>הכן פתרונות מלאי של ריאגנטים נדרשים כפי שמצוין בטבלה 1 (לפני יום הניסוי).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>רכיב</td>
			<td colspan="2">הנחיות נסיעה</td>
		</tr><tr><td>50 מ"מ טריס pH 8.0</td>
			<td colspan="2">ממיסים 0.61 גרם של בסיס...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism.">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li><li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase,+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose.">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li><li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1,6-glucosidase.">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li><li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose.">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li><li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis.">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li><li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases.">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li><li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues.">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li><li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates.">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li><li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,+6-diphosphatase,+phosphofructokinase,+glycogen+synthetase,+phosphorylase,+and+protein+kinase+from+swine+kidney.">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li><li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis.">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).</li><li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li><li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification,+properties+and+physiological+role.">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li><li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain:+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain.">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li><li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Enzymes Vol. 5. , 191-234 (1971).</li><li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+of+amylose+and+iodine.">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li><li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1,4,-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltansferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li><li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases.">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li><li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis:+An+unusual+member+of+the+starch/glycogen+synthase+family.">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-1,4-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver.">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li><li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

באופן כללי, היתרונות העיקריים של כל השיטות המוצגות הם העלות הנמוכה, הקלות, המהירות וחוסר ההסתמכות על ציוד מיוחד. החיסרון העיקרי המשותף לכולם הוא רגישות בהשוואה לשיטות זמינות אחרות. קל להעריך את הרגישות של ההליכים הכרוכים בייצור או צריכה של NADH/NADPH. בהתחשב בכך שמקדם ההכחדה של NADH/NADPH הוא 6.22 M-1 <s...

גליקוגן מופץ באופן נרחב בטבע, כאשר התרכובת נמצאת בחיידקים, פרוטיסטים רבים, פטריות ובעלי חיים. במיקרואורגניזמים, גליקוגן חשוב להישרדות התאים כאשר חומרי המזון מגבילים, ובאורגניזמים גבוהים יותר כמו יונקים, סינתזה ופירוק של גליקוגן משמשים למאגר רמות הגלוקוז בדם 1,2,3. חקר חילוף החומרים של גליקוגן הוא, אם כן, בעל חשיבות לתחומים מגוונים כגון מיקרוביולוגיה ופיזיולוגיה של יונקים. הבנת חילוף החומרים של גליקוגן דורשת לחקור את האנזימים העיקריים של סינתזת גליקוגן (גליקוגן סינתאז ואנזים המסתעף) ופירוק גליקוגן (גליקוגן פוספורילאז ואנזים מסתעף). מבחני תקן הזהב של גליקוגן סינתאז, פוספורילאז, הסתעפות ופירוק פעילויות אנזימים משתמשים באיזוטופים רדיואקטיביים. לדוגמה, גליקוגן סינתאז נמדד בדרך כלל בבדיקה רדיוכימית עצורה על ידי שילוב של גלוקוז מ-UDP-[14 C]גלוקוז (במקרה של אנזימים מן החי והפטריות) או ADP-[14C]גלוקוז (במקרה של אנזימים חיידקיים) לתוך גליקוגן 4,5. באופן דומה, גליקוגן פוספורילאז נמדד בכיוון של סינתזת גליקוגן, בעקבות שילוב גלוקוז מ[14C]גלוקוז-1-פוספט לתוך גליקוגן6. אנזים ההסתעפות נבדק על ידי מדידת יכולתו של אנזים זה לעורר שילוב של [14 C]גלוקוז מגלוקוז-1-פוספט לשרשראות α1,4 מקושרות על ידי גליקוגן פוספורילאז7, ופעילות האנזים המתפרק נקבעת על ידי מעקב אחר יכולתו של האנזים לשלב [14C]גלוקוז בגליקוגן8 . למרות שהם רגישים מאוד, ומאפשרים את השימוש בהם בתמציות תאים גולמיים עם רמות נמוכות של פעילות אנזימים, הסובסטרטים הרדיואקטיביים יקרים וכפופים לדרישות הרגולטוריות הנלוות לשימוש ברדיואיזוטופים. חסמים אלה מציבים את השימוש במבחנים מסוימים מחוץ להישג ידם של עובדים רבים. עם זאת, במשך שנים רבות תואר מגוון מרשים של גישות ספקטרופוטומטריות למדידת אנזימים אלה. באופן כללי, גישות אלה מסתמכות בסופו של דבר על מדידת הייצור או הצריכה של NADH/NADPH, או על יצירת קומפלקסים צבעוניים בין גליקוגן ליוד. לפיכך, הם פשוטים וניתן לבצע אותם באמצעות ספקטרופוטומטרים פשוטים המצוידים רק במנורות הבזק טונגסטן או קסנון.
בדיקות ספקטרופוטומטריות של גליקוגן סינתאז מסתמכות על מדידת הנוקלאוזיד דיפוספט המשתחרר מתורם נוקלאוטיד הסוכר, כאשר גלוקוז מתווסף לשרשרת הגליקוגןההולכת וגדלה 9,10. הנוהל למדידת פעילות גליקוגן סינתאז המתואר בסעיף 1 לפרוטוקול, להלן, הוא שינוי של זה שתואר על ידי Wayllace et al.11, וסכמת הצימוד מוצגת להלן:
(גלוקוז) n + UPD-גלוקוז → (גלוקוז)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + פוספונולפירובט → פירובט + ATP
פירובט + NADH + H+ → לקטט + NAD+
גליקוגן סינתאז מוסיף גלוקוז מ-UDP-גלוקוז על גליקוגן. ה-UDP שנוצר בתהליך זה מומר ל-UTP על ידי נוקלאוזיד דיפוספט קינאז (NDP kinase), בתגובה שיוצרת ADP. ה- ADP, בתורו, משמש כמצע לפירובט קינאז, אשר פוספורילטים את ה- ADP באמצעות פוספונולפירובט כתורם פוספט. הפירובט המתקבל מומר ללקטט על ידי האנזים לקטט דהידרוגנאז בתגובה הצורכת NADH. הבדיקה יכולה, אם כן, להתבצע באופן רציף, תוך מעקב אחר הירידה בספיגה ב 340 ננומטר כמו NADH נצרך. הוא מותאם בקלות לשימוש עם אנזימים הדורשים ADP-גלוקוז כתורם גלוקוז. כאן, שלבי הצימוד פשוטים יותר מכיוון שה-ADP המשתחרר על ידי פעולת הגליקוגן סינתאז מופעל ישירות על ידי פירובט קינאז.
קיימים מגוון מבחנים ספקטרופוטומטריים לקביעת פעילות גליקוגן פוספורילאז. בגרסה הקלאסית, האנזים מונע לאחור, בכיוון של סינתזת גליקוגן, כפי שמוצג להלן:
(גלוקוז) n + גלוקוז-1-פוספט → (גלוקוז)n+1 + Pi
במרווחי זמן מתוזמנים מוסרים אליקוטים של תערובת התגובה, וכמות הפוספט המשוחררת מכמתת12,13. בידינו, בדיקה זו הייתה בשימוש מוגבל בשל נוכחותו של פוספט חופשי הניתן למדידה בקלות בתכשירים מסחריים רבים של גלוקוז-1-פוספט, בשילוב עם הריכוזים הגבוהים של גלוקוז-1-פוספט הדרושים לפעולת פוספורילאז. במקום זאת, השתמשנו באופן שגרתי בבדיקה חלופית המודדת את הגלוקוז-1-פוספט המשתחרר כאשר הגליקוגן מתפרק על-ידי זרחן13. נעשה שימוש בסכמת תגובה מצומדת, המומחשת להלן.
(גלוקוז) n + Pi → (גלוקוז)n-1 + גלוקוז-1-פוספט
גלוקוז-1-פוספט → גלוקוז-6-פוספט
גלוקוז-6-פוספט + NADP + → 6-פוספוגלוקונולקטון + NADPH + H+
הגלוקוז-1-פוספט מומר לגלוקוז-6-פוספט על-ידי פוספוגלוקוטאז, והגלוקוז-6-פוספט מתחמצן ל-6-פוספוקונולקטון, עם הפחתה מקבילה של NADP+ ל-NADPH. הנוהל המפורט בסעיף 2 לפרוטוקול, להלן, נגזר משיטות שתוארו על ידי Mendicino et al.14 ו- Schreiber & Bowling 15. הבדיקה יכולה להתבצע בקלות באופן רציף, עם עלייה בספיגה ב 340 ננומטר לאורך זמן, המאפשר את קביעת קצב התגובה.
קביעה ספקטרופוטומטרית של פעילות אנזים מתפרקת מסתמכת על מדידת הגלוקוז המשתחרר על ידי פעולת האנזים על גבול הזרחן דקסטרין16. תרכובת זו מיוצרת על ידי טיפול ממצה בגליקוגן פוספורילאז. מאחר שפעולת הגליקוגן פוספורילאז עוצרת 4 שאריות גלוקוז מנקודת ענף α1,6, דקסטרין הגבול מכיל גליקוגן, שהשרשראות החיצוניות שלו קוצרו ל~4 שאריות גלוקוז. הכנת דקסטרין גבול הפוספורילאז מתוארת כאן, באמצעות הליך הנגזר מאלו שפותחו על ידי Taylor et al.17 ו- Makino & Omichi 18.
פירוק הוא תהליך בן שני שלבים. פעילות 4-α-glucanotransferase של אנזים הפירוק הדו-כיווני מעבירה תחילה שלוש שאריות גלוקוז מנקודת הענף לקצה הלא-מצמצם של שרשרת גלוקוז סמוכה α1,4 המקושרת. שאריות הגלוקוז הבודדות המקושרות α1,6 שנותרו בנקודת הענף עוברות הידרוליזה על-ידי פעילות α1,6-גלוקוזידאז19. הבדיקה מבוצעת בדרך כלל בצורה עצורה, כאשר הגלוקוז משתחרר לאחר זמן נתון (או סדרה של פעמים) נמדד במבחן אנזים מצומד כפי שמוצג להלן:
(גלוקוז) n → (גלוקוז)n-1 + גלוקוז 
גלוקוז + ATP → גלוקוז-6-פוספט + ADP
גלוקוז-6-פוספט + NADP + → 6-פוספוגלוקונולקטון + NADPH + H+
קביעת NADPH המיוצר נותן מדד לייצור גלוקוז. הנוהל המתואר בסעיף 3 לפרוטוקול, להלן, מבוסס על הליך שתואר על ידי Nelson et al.16. כמו השיטות האחרות המסתמכות על צריכה או ייצור של NADH/NADPH, הבדיקה רגישה למדי. עם זאת, נוכחות של עמילאזות או גלוקוזידאזות אחרות, שיכולות גם לשחרר גלוקוז חופשי מפוספורילאז המגבילות את הדקסטרין, תגרום להפרעות משמעותיות (ראו דיון).
הקביעה הצבעונית של פעילות אנזימי הסתעפות מסתמכת על העובדה ששרשראות α1,4 של גלוקוז מאמצות מבנים סליליים הנקשרים ליוד, ויוצרים קומפלקסים צבעוניים20. צבע הקומפלקס שנוצר תלוי באורך השרשראות המקושרות α1,4. לפיכך, עמילוז, המורכב משרשראות ארוכות, ברובן לא מסותתות, של גלוקוז α1,4 המקושר, יוצר קומפלקס כחול עמוק עם יוד. לעומת זאת, גליקוגנים, שהשרשראות החיצוניות שלהם הן בדרך כלל בסדר גודל של 6 עד 8 שאריות גלוקוז בלבד, יוצרים קומפלקסים כתומים-אדומים. אם תמיסה של עמילוז מודגרת באנזים מסתעף, הכנסת הענפים לתוך העמילוז גורמת ליצירת שרשראות סוכר קצרות יותר α1,4 המקושרות זו לזו. לפיכך, מקסימום הספיגה של קומפלקסי העמילוז/יוד נע לעבר אורכי גל קצרים יותר. ההליך הנדון כאן נגזר מזה שפורט על ידי Boyer & Preiss21 ופעילות האנזים המסתעף מכמתת כהפחתה בספיגת קומפלקס העמילוז/יוד ב-660 ננומטר לאורך זמן.
כפי שניתן לראות בקלות מהדיון לעיל, העובדה שצבעי הקומפלקסים הנוצרים בין שרשראות יוד ו-α1,4-גלוקוז משתנים עם אורך השרשרת פירושה שספקטרום הספיגה של קומפלקסים של גליקוגן/יוד צריך להשתנות עם מידת הסתעפות הגליקוגן. זה אכן המקרה, וגליקוגנים/גליקוגנים פחות מסועפים עם שרשראות חיצוניות ארוכות יותר בולעים אור באורך גל ארוך יותר מאשר גליקוגנים מסועפים יותר / בעלי שרשראות חיצוניות קצרות יותר. לפיכך, ניתן להשתמש בתגובת צביעת היוד כדי לקבל נתונים מהירים ואיכותיים על מידת הסתעפות הגליקוגן22. הצבע הכתום-חום נוצר כאשר קומפלקסים גליקוגן עם יוד אינו אינטנסיבי במיוחד. עם זאת, ניתן לשפר את התפתחות הצבע על ידי הכללת תמיסת קלציום כלוריד רוויה22. זה מגביר את הרגישות של השיטה פי 10 ומאפשר ניתוח מוכן של כמויות מיקרוגרם של גליקוגן. הבדיקה לקביעת ההסתעפות המתוארת בסעיף 4 לפרוטוקול, להלן, מותאמת מתוך נוהל שפותח על ידי קריסמן22. הוא מתבצע פשוט על ידי שילוב דגימת הגליקוגן עם תמיסת יוד וסידן כלורי בקובט ואיסוף ספקטרום הספיגה מ 330 ננומטר ל 800 ננומטר. מקסימום הספיגה משתנה לכיוון אורכי גל ארוכים יותר ככל שמידת ההסתעפות יורדת.
באופן קולקטיבי, השיטות המתוארות כאן מספקות אמצעים פשוטים ואמינים להערכת פעילותם של האנזימים המרכזיים של חילוף החומרים של גליקוגן, ולהשגת נתונים איכותיים על היקף הסתעפות הגליקוגן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

גליקוגן מסונתז כצורת אחסון של גלוקוז על ידי מגוון רחב של אורגניזמים, החל מחיידקים וכלה בבעלי חיים. המולקולה מורכבת משרשראות ליניאריות של שאריות גלוקוז מקושרות α1,4 עם ענפים המוחדרים באמצעות תוספת של α1,6-linkages. הבנת האופן שבו סינתזה ופירוק של גליקוגן מוסדרים וכיצד גליקוגן משיג את המבנה המסועף האופייני שלו דורשת מחקר של האנזימים של אחסון גליקוגן. עם זאת, השיטות הנפוצות ביותר לחקר פעילויות אנזימים אלה משתמשות בדרך כלל בריאגנטים או בטכניקות שאינן זמינות לכל החוקרים. במאמר זה נדון בסוללה של הליכים שהם פשוטים מבחינה טכנית, חסכוניים ועדיין מסוגלים לספק תובנות חשובות לגבי השליטה באחסון גליקוגן. הטכניקות דורשות גישה לספקטרופוטומטר, הפועל בטווח של 330 עד 800 ננומטר, ומתוארות בהנחה שהמשתמשים ישתמשו בחלוקי פלסטיק חד פעמיים. עם זאת, ההליכים ניתנים להרחבה בקלות וניתן לשנות אותם לשימוש בקורא microplate, מה שמאפשר ניתוח מקביל מאוד.

קביעת פעילות גליקוגן סינתאז איור 1 מראה תוצאות מייצגות של מבחני גליקוגן סינתאז באמצעות אנזימים מטוהרים. בלוח A, לאחר השהיה קלה, חלה ירידה ליניארית בספיגה של 340 ננומטר לאורך זמן לתקופה של כ-12 דקות. קצב השינוי בספיגה באיור 1A היה ~0.12 יחידות ספיגה לדקה. ...

Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

טכניקות למדידת הפעילות של אנזימי מפתח של מטבוליזם גליקוגן מוצגות, באמצעות ספקטרופוטומטר פשוט הפועל בטווח הנראה לעין.

שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

הפרוטוקולים משמעותיים, משום שהם נמנעים משימוש באיזוטופים רדיואקטיביים ומסירים מחסום שעלול למנוע מעובדים רבים לחקור אנזימים של מטבוליזם של גליקוגן. ההליכים המתוארים אינם יקרים, ודורשים גישה בלבד לספקטרופוטומטר פשוט. כדי להתחיל עם קביעת פעילות גליקוגן סינתאז, להפשיר את פתרונות המלאי שהוכנו בעבר של גלוקוז UDP, ATP, phosphoenolpyruvate ו- NDP קינאז על קרח.מחממים מראש אמבט מים ל-30 מעלות צלזיוס. כאשר פתרונות המלאי מוכנים, הכינו תערובת בדיקה מספקת בהתאם למספר מבחני הגליקוגן סינתאז על ידי הוספת הריאגנטים לצינור של 15 מיליליטר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכינו תגובה ריקה על ידי החלפת ה-NADH מתערובת התגובה במים, והעבירו את התגובה לקובט מתקרילט חד פעמי.השתמש בתגובה הריקה כדי להגדיר אפס על הספקטרופוטומטר באורך גל של 340 ננומטר. קח אחד 770 microliters aliquot של תערובת התגובה בצינור 1.5 מיליליטר, ולהוסיף ברצף שני microliters כל אחד של NDP קינאז ו pyruvate קינאז לקטט דהידרוגנאז תערובת לצינור. לאחר הערבוב, דגירה עדינה של הצינור ב 30 מעלות צלזיוס באמבט המים במשך שלוש דקות כדי לחמם את תערובת התגובה.לאחר מכן הוסיפו 30 מיקרוליטרים של הדגימה המכילה גליקוגן סינתאז בחיץ Tris של 20 מילימולר ב-pH 7.8, וערבבו בעדינות לפני העברת תערובת התגובה ל-methacrylate cuvette לסילוק. הכניסו את הקובט לספקטרופוטומטר, ותעדו את הספיגה ב-340 ננומטר במרווחים מתוזמנים למשך 10 עד 20 דקות. לאחר מכן, התווה את הספיגה שהושגה כנגד הזמן.כדי למדוד את הגלוקוז המשתחרר, העבירו 40 מיקרוליטרים של הסופר-נטנט מדגימות הגליקוגן המחוממות לקוביות המתקרילט החד-פעמיות. והוסף את הכמויות הנמדדות של טריאתנולמין, מאגר מגנזיום סולפט הידרוכלוריד, תערובת NADP ATP ומים כמתואר בכתב היד. מערבבים את התערובת על ידי ניפוח מעלה ומטה בעדינות מבלי ליצור בועות אוויר.הוסיפו 0.5 מיקרוליטרים של גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז לכל קובט. לאחר ערבוב על ידי pipetting, לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולאחר מכן להקליט את הספיגה ב 340 ננומטר. לאחר מכן, ערבבו 0.5 מיקרוליטרים של הקסוקינאז לכל קובט כפי שתואר קודם לכן, ודגרו במשך 15 דקות לפני רישום ערכת הספיגה של 340 ננומטר.לאחר מכן המשיכו את הדגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, ולאחר מכן רשמו את הספיגה. אם הספיגה עלתה מזו שתועדה ב-15 דקות, המשיכו את הדגירה במשך חמש דקות לפני רישום הספיגה הסופית ב-340 ננומטר. כדי לקבוע את הסתעפות הגליקוגן, שלבו 650 מיקרוליטרים של מלאי מגיבי צבע סידן כלוריד עם 100 מיקרוליטר מים בצינור של 1.5 מיליליטר, וערבבו היטב את התמיסה לפני המעבר לקובט מתקרילט חד פעמי.מקם את הקובט בספקטרופוטומטר כדי לבצע ריצה במצב סריקת אורך גל לאיסוף ספקטרום הרקע מ-330 עד 800 ננומטר. בצינור נפרד של 1.5 מיליליטר לשלב 650 מיקרוליטר של ריאגנט צבע סידן כלורי יוד עובד עם 50 מיקרוגרם של גליקוגן צדפות, ולהרכיב את הנפח הסופי ל 750 מיקרוליטר עם מים. לאחר ערבוב יסודי של התערובת, העבירו את התמיסה לקובט מתקרילט חד פעמי כדי לאסוף ספקטרום ספיגה של 330 עד 800 ננומטר.באופן דומה, קבל ספקטרום ספיגה עם 50 מיקרוגרם של עמילופקטין ו -30 מיקרוגרם של עמילוז כפי שתואר קודם. כדי לקבל אינדיקציה למבנה המסועף של דגימת גליקוגן לא מאופיינת, שלב 25 עד 50 מיקרוגרם של הגליקוגן עם 650 מיקרוליטר של מגיב צבע היוד העובד קלציום כלוריד, והמשך כפי שהוסבר קודם לכן כדי לרכוש את ספקטרום הספיגה. במבחני גליקוגן סינתאז נצפתה ירידה ליניארית בספיגה של 340 ננומטר לאורך זמן.הוספת כמות גדולה מדי של גליקוגן סינתאז לבדיקה גרמה לתגובה להגיע להשלמה תוך שתי הדקות הראשונות. תגובת הבקרה, שלא הכילה גליקוגן סינתאז, לא הראתה ירידה ניתנת למדידה בספיגה. הנתונים מבדיקת גליקוגן פוספורילאז באמצעות אנזים מטוהר היו בעלי פאזה ליניארית שנמשכה שלוש דקות.קצב עלייה בספיגה של כ-0.01 עד 0.04 יחידות לדקה הוא אופטימלי. בבדיקת האנזים גליקוגן דה-הסתעפות, התגובה הראתה פאזה ליניארית שנמשכה לפחות 10 דקות. הנתונים המייצגים ממבחני אנזים הסתעפות הגליקוגן הראו את ההבדל בספיגה בין דגימות הביקורת שלא היו אנזים מסתעף, לבין התגובות שהכילו אנזים מסתעף.הטווח הדינמי הצר של הבדיקה מומחש. השינוי המרבי בספיגה שניתן לייצר הוא 0.4 יחידות ספיגה, והלינאריות אובדת כאשר השינוי בספיגה הוא כ-0.2 יחידות ספיגה. המסות של גליקוגן, עמילופקטין ועמילוז ששימשו בהערכת הסתעפות הגליקוגן הציגו קריאת ספיגה מרבית של כ-0.7 עד 0.8, כל אחד במקסימום ספיגה שונה.דגימת הגליקוגן הניבה שתי פסגות של כ-400 ננומטר ו-460 ננומטר. מגיב צבע הסידן כלורי של היוד צפוף מאוד. חשוב לוודא שדגימות הגליקוגן מעורבבות באופן מלא עם המגיב לפני איסוף ספקטרום הספיגה.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Anatomy and Physiology

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

שיטה למדידת מטבוליזם ב ממוינות תת-אוכלוסיות של קהילות Cell מורכבות באמצעות איתור איזוטופ יציב

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

קביעת spectrophotometric תוכן Phycobiliprotein Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

מחייב סומו ישויות (SUBEs) ככלים עבור העשרה, בידוד, זיהוי, ואפיון של פרוטאום סומו בסרטן הכבד

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...