Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
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लेखक अपनी अंतर्दृष्टि और कई उपयोगी चर्चाओं के लिए कैरोलिन डिटमर और एंड्रयू ब्रिटिंघम को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को आयोवा ओस्टियोपैथिक एजुकेशन एंड रिसर्च फंड (आईओईआर 03-17-05 और 03-20-04) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

1. ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि का निर्धारण
<ol><li>तालिका 1 (प्रयोगात्मक दिन से पहले) में दर्शाए अनुसार आवश्यक अभिकर्मकों के स्टॉक समाधान तैयार करें।</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>घटक<...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism.">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li><li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase,+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose.">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li><li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1,6-glucosidase.">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li><li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose.">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li><li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis.">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li><li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases.">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li><li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues.">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li><li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates.">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li><li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,+6-diphosphatase,+phosphofructokinase,+glycogen+synthetase,+phosphorylase,+and+protein+kinase+from+swine+kidney.">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li><li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis.">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).</li><li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li><li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification,+properties+and+physiological+role.">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li><li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain:+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain.">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li><li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Enzymes Vol. 5. , 191-234 (1971).</li><li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+of+amylose+and+iodine.">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li><li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1,4,-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltansferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li><li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases.">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li><li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis:+An+unusual+member+of+the+starch/glycogen+synthase+family.">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-1,4-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver.">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li><li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

सामान्य तौर पर, प्रस्तुत सभी तरीकों के प्रमुख फायदे उनकी कम लागत, आसानी, गति और विशेष उपकरणों पर निर्भरता की कमी है। प्रमुख नुकसान जो वे सभी साझा करते हैं वह अन्य उपलब्ध तरीकों की तुलना में संवेदनशीलता ?...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

ग्लाइकोजन को जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला द्वारा ग्लूकोज के भंडारण रूप के रूप में संश्लेषित किया जाता है, जिसमें बैक्टीरिया से लेकर जानवरों तक शामिल हैं। अणु में 1,4-लिंक्ड ग्लूकोज अवशेषों की रैखिक श्रृंखलाएं शामिल हैं, जिनकी शाखाओं को 1,6-लिंकेज के अतिरिक्त के माध्यम से पेश किया गया है। यह समझना कि ग्लाइकोजन के संश्लेषण और क्षरण को कैसे विनियमित किया जाता है और ग्लाइकोजन अपनी विशिष्ट शाखित संरचना को कैसे प्राप्त करता है, ग्लाइकोजन भंडारण के एंजाइमों के अध्ययन की आवश्यकता होती है। हालांकि, इन एंजाइम गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली विधियां आमतौर पर अभिकर्मकों या तकनीकों को नियोजित करती हैं जो सभी जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं। यहां, हम प्रक्रियाओं की एक बैटरी पर चर्चा करते हैं जो तकनीकी रूप से सरल, लागत प्रभावी हैं, और फिर भी ग्लाइकोजन भंडारण के नियंत्रण में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करने में सक्षम हैं। तकनीकों को 330 से 800 एनएम की सीमा में संचालित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर तक पहुंच की आवश्यकता होती है, और यह मानते हुए वर्णित किया जाता है कि उपयोगकर्ता डिस्पोजेबल, प्लास्टिक क्यूवेट को नियोजित करेंगे। हालांकि, प्रक्रियाएं आसानी से स्केलेबल हैं और माइक्रोप्लेट रीडर में उपयोग के लिए संशोधित की जा सकती हैं, जिससे अत्यधिक समानांतर विश्लेषण की अनुमति मिलती है।

ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि का निर्धारण चित्रा 1 शुद्ध एंजाइमों का उपयोग करके ग्लाइकोजन सिंथेज़ परख से प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। पैनल ए में, थोड़े अंतराल के बाद, लगभग 12 मिनट की अवधि ?...

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Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

ग्लाइकोजन चयापचय के प्रमुख एंजाइमों की गतिविधि को मापने की तकनीक प्रस्तुत की जाती है, दृश्यमान सीमा में संचालित एक सरल स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके।

यूकेरियोटिक ग्लाइकोजन चयापचय के अध्ययन के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विधियां

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वे रेडियोधर्मी आइसोटोप के उपयोग से बचते हैं और एक बाधा को हटाते हैं जो कई श्रमिकों को ग्लाइकोजन चयापचय के एंजाइमों का अध्ययन करने से रोक सकता है। वर्णित प्रक्रियाएं सस्ती हैं, केवल एक साधारण स्पेक्ट्रोफोटोमीटर तक पहुंच की आवश्यकता होती है। ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि के निर्धारण के साथ शुरू करने के लिए, बर्फ पर यूडीपी ग्लूकोज, एटीपी, फॉस्फोनोलपाइरूवेट और एनडीपी किनेज के पहले से तैयार स्टॉक समाधानों को पिघलाएं।पानी के स्नान को 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। जब स्टॉक समाधान तैयार हो जाते हैं, तो टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित अभिकर्मकों को 15 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़कर ग्लाइकोजन सिंथेज़ परख की संख्या के अनुसार पर्याप्त परख मिश्रण तैयार करें। पानी के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण से एनएडीएच को बदलकर एक रिक्त प्रतिक्रिया तैयार करें, और प्रतिक्रिया को डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करें।340 नैनोमीटर की तरंग दैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर शून्य सेट करने के लिए रिक्त प्रतिक्रिया का उपयोग करें। 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण के एक 770 माइक्रोलीटर एलिकोट लें, और क्रमिक रूप से एनडीपी काइनेज और पाइरूवेट काइनेज लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज मिश्रण के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। मिश्रण करने के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण को पूर्ववत करने के लिए तीन मिनट के लिए पानी के स्नान में 30 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को धीरे से इनक्यूबेट करें।फिर पीएच 7.8 पर 20 मिलीमोलर ट्रिस बफर में ग्लाइकोजन सिंथेज़ युक्त नमूने के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें, और प्रतिक्रिया मिश्रण को निपटान मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करने से पहले धीरे से मिलाएं। क्यूवेट को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रखें, और 10 से 20 मिनट के लिए समयबद्ध अंतराल पर 340 नैनोमीटर पर अवशोषण रिकॉर्ड करें। फिर, समय के खिलाफ प्राप्त अवशोषण को प्लॉट करें।जारी ग्लूकोज को मापने के लिए, गर्म ग्लाइकोजन नमूनों से सुपरनैटेंट के 40 माइक्रोलीटर को डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करें। और पांडुलिपि में वर्णित ट्राइएथेनॉलमाइन, हाइड्रोक्लोराइड मैग्नीशियम सल्फेट बफर, एनएडीपी एटीपी मिश्रण और पानी की मापी गई मात्रा जोड़ें। हवा के बुलबुले बनाए बिना मिश्रण को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे करके मिलाएं।प्रत्येक क्यूवेट में ग्लूकोज -6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज के 0.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। पाइपिंग द्वारा मिश्रण करने के बाद, मिश्रण को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, और फिर 340 नैनोमीटर पर अवशोषण रिकॉर्ड करें। इसके बाद, पहले वर्णित प्रत्येक क्यूवेट में हेक्सोकाइनेज के 0.5 माइक्रोलीटर मिलाएं, और शोषक सेट 340 नैनोमीटर रिकॉर्ड करने से पहले 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।फिर पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन जारी रखें, इसके बाद अवशोषण रिकॉर्ड करें। यदि अवशोषण 15 मिनट में दर्ज किया गया है, तो 340 नैनोमीटर पर अंतिम अवशोषण दर्ज करने से पहले पांच मिनट तक इनक्यूबेशन जारी रखें। ग्लाइकोजन शाखाओं को निर्धारित करने के लिए, आयोडीन कैल्शियम क्लोराइड रंग अभिकर्मक स्टॉक के 650 माइक्रोलीटर को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 100 माइक्रोलीटर पानी के साथ मिलाएं, और डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करने से पहले घोल को अच्छी तरह से मिलाएं।330 से 800 नैनोमीटर तक पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम एकत्र करने के लिए तरंग दैर्ध्य स्कैनिंग मोड में रन करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में क्यूवेट रखें। एक अलग 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सीप ग्लाइकोजन के 50 माइक्रोग्राम के साथ काम करने वाले आयोडीन कैल्शियम क्लोराइड रंग अभिकर्मक के 650 माइक्रोलीटर को जोड़ते हैं, और पानी के साथ 750 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा बनाते हैं। मिश्रण को अच्छी तरह से मिश्रण करने के बाद, 330 से 800 नैनोमीटर तक अवशोषण स्पेक्ट्रम एकत्र करने के लिए घोल को डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करें।इसी तरह, पहले वर्णित एमाइलोपेक्टिन के 50 माइक्रोग्राम और एमाइलोज के 30 माइक्रोग्राम के साथ एक अवशोषण स्पेक्ट्रम प्राप्त करें। एक अज्ञात ग्लाइकोजन नमूने की शाखित संरचना का संकेत प्राप्त करने के लिए, ग्लाइकोजन के 25 से 50 माइक्रोग्राम को काम करने वाले आयोडीन कैल्शियम क्लोराइड रंग अभिकर्मक के 650 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं, और अवशोषण स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए पहले बताए अनुसार आगे बढ़ें। ग्लाइकोजन सिंथेस परख में, समय के साथ 340 नैनोमीटर पर अवशोषण में एक रैखिक कमी देखी गई थी।परख में बहुत अधिक ग्लाइकोजन सिंथेज़ जोड़ने से प्रतिक्रिया पहले दो मिनट के भीतर पूरी हो गई। नियंत्रण प्रतिक्रिया, जिसमें कोई ग्लाइकोजन सिंथेज़ नहीं था, अवशोषण में कोई औसत दर्जे की कमी नहीं दिखाता है। एक शुद्ध एंजाइम का उपयोग करके ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज परख से डेटा में तीन मिनट तक चलने वाला एक रैखिक चरण था।लगभग 0.01 से 0.04 यूनिट प्रति मिनट की अवशोषण वृद्धि की दर इष्टतम है। ग्लाइकोजन डी-ब्रांचिंग एंजाइम परख में, प्रतिक्रिया ने कम से कम 10 मिनट तक बने रहने वाले रैखिक चरण को दिखाया। ग्लाइकोजन ब्रांचिंग एंजाइम परख के प्रतिनिधि डेटा ने नियंत्रण नमूनों के बीच अवशोषण में अंतर दिखाया जिसमें ब्रांचिंग एंजाइम की कमी थी, और प्रतिक्रियाएं जिनमें ब्रांचिंग एंजाइम शामिल थे।परख की संकीर्ण गतिशील सीमा सचित्र है। उत्पादित अवशोषण में अधिकतम परिवर्तन 0.4 अवशोषण इकाइयां हैं, और अवशोषण में परिवर्तन लगभग 0.2 अवशोषण इकाइयों के होने पर रैखिकता खो जाती है। ग्लाइकोजन ब्रांचिंग मूल्यांकन में उपयोग किए जाने वाले ग्लाइकोजन, एमाइलोपेक्टिन और एमाइलोज के द्रव्यमान ने लगभग 0.7 से 0.8 की अधिकतम अवशोषण रीडिंग प्रदर्शित की, प्रत्येक अलग-अलग अवशोषण मैक्सिमा पर।ग्लाइकोजन नमूने ने लगभग 400 नैनोमीटर और 460 नैनोमीटर पर दो चोटियों का उत्पादन किया। आयोडीन कैल्शियम क्लोराइड रंग अभिकर्मक बहुत घना है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि अवशोषण स्पेक्ट्रम एकत्र करने से पहले ग्लाइकोजन नमूने अभिकर्मक के साथ पूरी तरह से मिश्रित हैं।

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A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

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Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

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