Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
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L'autore desidera ringraziare Karoline Dittmer e Andrew Brittingham per le loro intuizioni e molte utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dell'Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 e 03-20-04).

1. Determinazione dell'attività della glicogeno sintasi
<ol><li>Preparare le soluzioni madre dei reagenti necessari come indicato nella Tabella 1 (prima della giornata sperimentale).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td colspan="2">Indicazioni</td>
		</tr><tr><td>50 mM Tris pH 8,0</td>
			<td colspan="2">Sciogliere 0,61 g di Tris base in ~ 80 mL di acqua.  Raffreddare...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism.">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li><li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase,+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose.">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li><li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1,6-glucosidase.">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li><li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose.">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li><li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis.">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li><li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases.">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li><li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues.">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li><li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates.">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li><li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,+6-diphosphatase,+phosphofructokinase,+glycogen+synthetase,+phosphorylase,+and+protein+kinase+from+swine+kidney.">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li><li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis.">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).</li><li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li><li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification,+properties+and+physiological+role.">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li><li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain:+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain.">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li><li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. 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Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. 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C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis:+An+unusual+member+of+the+starch/glycogen+synthase+family.">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-1,4-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver.">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li><li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

In generale, i principali vantaggi di tutti i metodi presentati sono il loro basso costo, la facilità, la velocità e la mancanza di dipendenza da attrezzature specializzate. Il principale svantaggio che tutti condividono è la sensibilità rispetto ad altri metodi disponibili. La sensibilità delle procedure che comportano la produzione o il consumo di NADH / NADPH è facile da stimare. Dato che il coefficiente di estinzione di NADH / NADPH è 6,22 M-1 cm-1, l'aritmetica semplice indica che ~ 10-20 μM i cam...

Il glicogeno è ampiamente distribuito in natura, con il composto che si trova in batteri, molti protisti, funghi e animali. Nei microrganismi, il glicogeno è importante per la sopravvivenza cellulare quando i nutrienti sono limitanti e, negli organismi superiori come i mammiferi, la sintesi e la degradazione del glicogeno servono a tamponare i livelli di glucosio nel sangue 1,2,3. Lo studio del metabolismo del glicogeno è, quindi, importante per campi così diversi come la microbiologia e la fisiologia dei mammiferi. Comprendere il metabolismo del glicogeno richiede lo studio degli enzimi chiave della sintesi del glicogeno (glicogeno sintasi e dell'enzima ramificato) e della degradazione del glicogeno (glicogeno fosforilasi ed enzima deramificante). I saggi gold standard della glicogeno sintasi, della fosforilasi, della ramificazione e delle attività enzimatiche di deramificazione impiegano isotopi radioattivi. Ad esempio, la glicogeno sintasi viene generalmente misurata in un saggio radiochimico interrotto seguendo l'incorporazione di glucosio da UDP-[14 C]glucosio (nel caso di enzimi animali e fungini) o ADP-[14C]glucosio (nel caso di enzimi batterici) nel glicogeno 4,5. Analogamente, la glicogeno fosforilasi viene misurata nella direzione della sintesi del glicogeno, in seguito all'incorporazione del glucosio dal [14C]glucosio-1-fosfato nel glicogeno6. L'enzima ramificante viene analizzato misurando la capacità di questo enzima di stimolare l'incorporazione di [14 C]glucosio dal glucosio-1-fosfato in catene legate all'α1,4 mediante glicogeno fosforilasi7, e l'attività dell'enzima deramificante è determinata seguendo la capacità dell'enzima di incorporare [14C]glucosio nel glicogeno8 . Sebbene molto sensibili, consentendo il loro uso in estratti cellulari grezzi con bassi livelli di attività enzimatica, i substrati radioattivi sono costosi e soggetti ai requisiti normativi relativi all'uso di radioisotopi. Queste barriere pongono l'uso di determinati saggi fuori dalla portata di molti lavoratori. Tuttavia, nel corso di molti anni, è stata descritta un'impressionante varietà di approcci spettrofotometrici alla misurazione di questi enzimi. In generale, questi approcci si basano in ultima analisi sulla misurazione della produzione o del consumo di NADH / NADPH o sulla generazione di complessi colorati tra glicogeno e iodio. Pertanto, sono semplici e possono essere eseguiti utilizzando semplici spettrofotometri dotati solo di lampade flash al tungsteno o allo xeno.
I saggi spettrofotometrici della glicogeno sintasi si basano sulla misurazione del difosfato nucleosidico rilasciato dal donatore di nucleotidi di zucchero quando il glucosio viene aggiunto alla catena di glicogeno in crescita 9,10. La procedura per misurare l'attività della glicogeno sintasi descritta nella sezione 1 del protocollo, di seguito, è una modifica di quella delineata da Wayllace et al.11, e lo schema di accoppiamento è mostrato di seguito:
(Glucosio) n + UPD-glucosio → (glucosio)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP
piruvato + NADH + H + → lattato + NAD +
La glicogeno sintasi aggiunge glucosio da UDP-glucosio al glicogeno. L'UDP generato in questo processo viene convertito in UTP dalla nucleoside difosfato chinasi (NDP chinasi), in una reazione che genera ADP. L'ADP, a sua volta, funge quindi da substrato per la piruvato chinasi, che fosforila l'ADP usando il fosfoenolpiruvato come donatore di fosfato. Il piruvato risultante viene convertito in lattato dall'enzima lattato deidrogenasi in una reazione che consuma NADH. Il test può, quindi, essere eseguito in modo continuo, monitorando la diminuzione dell'assorbanza a 340 nm man mano che il NADH viene consumato. È facilmente adattato per l'uso con enzimi che richiedono ADP-glucosio come donatore di glucosio. Qui, le fasi di accoppiamento sono più semplici poiché l'ADP rilasciato dall'azione della glicogeno sintasi è direttamente agito dalla piruvato chinasi.
Sono disponibili diversi saggi spettrofotometrici per la determinazione dell'attività della glicogeno fosforilasi. Nella versione classica, l'enzima viene spinto all'indietro, nella direzione della sintesi del glicogeno, come mostrato di seguito:
(Glucosio) n + Glucosio-1-fosfato → (Glucosio)n+1 + Pi
Ad intervalli di tempo, vengono rimosse le aliquote della miscela di reazione e la quantità di fosfato liberata viene quantificata12,13. Nelle nostre mani, questo test è stato di uso limitato a causa della presenza di fosfato libero facilmente misurabile in molti preparati commerciali di glucosio-1-fosfato, combinato con le alte concentrazioni di glucosio-1-fosfato necessarie per l'azione della fosforilasi. Piuttosto, abbiamo regolarmente impiegato un test alternativo che misura il glucosio-1-fosfato rilasciato quando il glicogeno viene degradato dalla fosforilasi13. Viene utilizzato uno schema di reazione accoppiata, illustrato di seguito.
(Glucosio) n + Pi → (Glucosio)n-1 + Glucosio-1-fosfato
Glucosio-1-fosfato → Glucosio-6-fosfato
Glucosio-6-fosfato + NADP + → 6-fosfogluconolattone + NADPH + H +
Il glucosio-1-fosfato viene convertito in glucosio-6-fosfato dalla fosfoglucomutasi, e il glucosio-6-fosfato viene quindi ossidato a 6-fosfogluconolattone, con la concomitante riduzione di NADP+ a NADPH. La procedura descritta nella sezione 2 del protocollo, di seguito, deriva dai metodi descritti da Mendicino et al.14 e Schreiber & Bowling 15. Il saggio può essere facilmente eseguito in modo continuo, con l'aumento dell'assorbanza a 340 nm nel tempo, consentendo la determinazione della velocità di reazione.
La determinazione spettrofotometrica dell'attività enzimatica deramificante si basa sulla misurazione del glucosio rilasciato dall'azione dell'enzima sulla fosforilasi limitedi destrina 16. Questo composto è fatto trattando il glicogeno in modo esaustivo con glicogeno fosforilasi. Poiché l'azione della glicogeno fosforilasi blocca 4 residui di glucosio da un punto di diramazione α1,6, la destrina limite contiene glicogeno, le cui catene esterne sono state ridotte a ~ 4 residui di glucosio. La preparazione della destrina limite della fosforilasi è descritta qui, utilizzando una procedura derivata da quelle sviluppate da Taylor et al.17 e Makino & Omichi 18.
La deramificazione è un processo in due fasi. L'attività della 4-α-glucanotransferasi dell'enzima deramificante bifunzionale trasferisce prima tre residui di glucosio dal punto di ramificazione all'estremità non riducente di una vicina catena di glucosio legata all'α1,4. Il singolo residuo di glucosio legato all'α1,6 che rimane nel punto di diramazione viene quindi idrolizzato dall'attività dell'α1,6-glucosidasi19. Il test viene tipicamente eseguito in modo interrotto, il glucosio rilasciato dopo un dato tempo (o serie di volte) viene misurato in un saggio enzimatico accoppiato come mostrato di seguito:
(Glucosio) n → (Glucosio)n-1 + Glucosio 
Glucosio + ATP → Glucosio-6-fosfato + ADP
Glucosio-6-fosfato + NADP + → 6-fosfogluconolattone + NADPH + H +
La determinazione del NADPH prodotto fornisce una misura della produzione di glucosio. La procedura descritta nella sezione 3 del protocollo, di seguito, si basa su quella descritta da Nelson et al.16. Come gli altri metodi che si basano sul consumo o sulla generazione di NADH / NADPH, il test è abbastanza sensibile. Tuttavia, la presenza di amilasi o altre glucosidasi, che possono anche liberare glucosio libero dalla destrina limite della fosforilasi, causerà interferenze significative (vedi Discussione).
La determinazione colorimetrica dell'attività enzimatica ramificata si basa sul fatto che le catene α1,4-legate di glucosio adottano strutture elicoidali che si legano allo iodio, formando complessi colorati20. Il colore del complesso formato dipende dalla lunghezza delle catene α1,4-legate. Pertanto, l'amilosio, che consiste in lunghe catene in gran parte non ramificate di glucosio legato all'α1,4, forma un complesso blu profondo con iodio. Al contrario, i glicogeni, le cui catene esterne sono generalmente nell'ordine di soli 6-8 residui di glucosio, formano complessi rosso-arancio. Se una soluzione di amilosio viene incubata con enzima ramificato, l'introduzione di rami nell'amilosio provoca la generazione di catene di glucosio più corte legate all'α1,4. Pertanto, il massimo assorbimento dei complessi amilosio/iodio si sposta verso lunghezze d'onda più corte. La procedura qui discussa è derivata da quella dettagliata da Boyer & Preiss21 e l'attività enzimatica ramificata è quantificata come una riduzione dell'assorbimento del complesso amilosio/iodio a 660 nm nel tempo.
Come dovrebbe essere facilmente evidente dalla discussione precedente, il fatto che i colori dei complessi formati tra le catene di iodio e α1,4-glucosio varino con la lunghezza della catena significa che gli spettri di assorbanza dei complessi glicogeno/iodio dovrebbero variare con il grado di ramificazione del glicogeno. Questo è effettivamente il caso, e glicogeni / glicogeni meno ramificati con catene esterne più lunghe assorbono la luce a una lunghezza d'onda più lunga rispetto ai glicogeni che sono più ramificati / hanno catene esterne più corte. La reazione di colorazione dello iodio può quindi essere utilizzata per ottenere dati rapidi e qualitativi sul grado di ramificazione del glicogeno22. Il colore arancione-marrone si forma quando i complessi di glicogeno con iodio non sono particolarmente intensi. Tuttavia, lo sviluppo del colore può essere migliorato dall'inclusione della soluzione satura di cloruro di calcio22. Ciò aumenta la sensibilità del metodo di circa 10 volte e consente un'analisi pronta delle quantità di microgrammi di glicogeno. Il saggio per la determinazione della ramificazione descritto nella sezione 4 del protocollo, di seguito, è adattato da una procedura sviluppata da Krisman22. Viene condotto semplicemente combinando il campione di glicogeno con soluzione di iodio e cloruro di calcio in una cuvetta e raccogliendo lo spettro di assorbimento da 330 nm a 800 nm. Il massimo di assorbanza si sposta verso lunghezze d'onda più lunghe man mano che il grado di ramificazione diminuisce.
Collettivamente, i metodi qui descritti forniscono mezzi semplici e affidabili per valutare le attività degli enzimi chiave del metabolismo del glicogeno e per ottenere dati qualitativi sull'entità della ramificazione del glicogeno.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

Il glicogeno è sintetizzato come una forma di stoccaggio del glucosio da una vasta gamma di organismi, che vanno dai batteri agli animali. La molecola comprende catene lineari di residui di glucosio legati all'α1,4 con rami introdotti attraverso l'aggiunta di legami α1,6. Comprendere come la sintesi e la degradazione del glicogeno sono regolate e come il glicogeno raggiunge la sua caratteristica struttura ramificata richiede lo studio degli enzimi di stoccaggio del glicogeno. Tuttavia, i metodi più comunemente usati per studiare queste attività enzimatiche impiegano tipicamente reagenti o tecniche che non sono disponibili per tutti i ricercatori. Qui, discutiamo una batteria di procedure che sono tecnicamente semplici, economiche e tuttavia in grado di fornire preziose informazioni sul controllo dello stoccaggio del glicogeno. Le tecniche richiedono l'accesso a uno spettrofotometro, operante nell'intervallo da 330 a 800 nm, e sono descritte supponendo che gli utenti utilizzeranno cuvette di plastica usa e getta. Tuttavia, le procedure sono facilmente scalabili e possono essere modificate per l'uso in un lettore di micropiastre, consentendo analisi altamente parallele.

Determinazione dell'attività della glicogeno sintasi La figura 1 mostra risultati rappresentativi dei saggi della glicogeno sintasi utilizzando enzimi purificati. Nel pannello A, a seguito di un leggero ritardo, si è verificata una diminuzione lineare dell'assorbimento a 340 nm nel tempo per un periodo di circa 12 minuti. Il tasso di variazione dell'assorbimento nella Figura 1A era ~0,12 unità di assorbanza/min. Un tasso di variazione dell...

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Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Vengono presentate le tecniche per misurare l'attività degli enzimi chiave del metabolismo del glicogeno, utilizzando un semplice spettrofotometro operante nell'intervallo visibile.

Metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

I protocolli sono significativi, perché evitano l'uso di isotopi radioattivi e rimuovono una barriera che può impedire a molti lavoratori di studiare gli enzimi del metabolismo del glicogeno. Le procedure descritte sono poco costose e richiedono solo l'accesso a un semplice spettrofotometro. Per iniziare con la determinazione dell'attività della glicogeno sintasi, scongelare le soluzioni stock precedentemente preparate di glucosio UDP, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP chinasi su ghiaccio.Preriscaldare un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius. Quando le soluzioni madre sono pronte, preparare una miscela di dosaggio sufficiente in base al numero di saggi della glicogeno sintasi aggiungendo i reagenti a una provetta da 15 millilitri, come descritto nel protocollo di testo. Preparare una reazione in bianco sostituendo il NADH dalla miscela di reazione con l'acqua e trasferire la reazione in una cuvetta di metacrilato usa e getta.Utilizzare la reazione del bianco per impostare lo zero sullo spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 340 nanometri. Prendere un'aliquota da 770 microlitri della miscela di reazione in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere sequenzialmente due microlitri ciascuno di NDP chinasi e piruvato chinasi lattato deidrogenasi miscela al tubo. Dopo la miscelazione, incubare delicatamente il tubo a 30 gradi Celsius nel bagno d'acqua per tre minuti per preriscaldare la miscela di reazione.Quindi aggiungere 30 microlitri del campione contenente glicogeno sintasi in tampone Tris da 20 millimolari a pH 7,8 e mescolare delicatamente prima di trasferire la miscela di reazione in una cuvetta di metacrilato di smaltimento. Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro e registrare l'assorbanza a 340 nanometri a intervalli di tempo per 10-20 minuti. Quindi, tracciare le assorbanze ottenute contro il tempo.Per misurare il glucosio rilasciato, trasferire 40 microlitri di surnatante dai campioni di glicogeno riscaldati alle cuvette di metacrilato usa e getta. E aggiungere i volumi misurati di trietanolammina, tampone cloridrato di solfato di magnesio, miscela di ATP NADP e acqua come descritto nel manoscritto. Mescolare la miscela pipettando su e giù delicatamente senza creare bolle d'aria.Aggiungere 0,5 microlitri di glucosio-6-fosfato deidrogenasi a ciascuna cuvetta. Dopo la miscelazione mediante pipettaggio, incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi registrare l'assorbanza a 340 nanometri. Quindi, mescolare 0,5 microlitri di esochinasi su ciascuna cuvetta come descritto in precedenza e incubare per 15 minuti prima di registrare il set assorbente 340 nanometri.Quindi continuare l'incubazione a temperatura ambiente per cinque minuti, seguita dalla registrazione dell'assorbanza. Se l'assorbimento è aumentato da quello registrato a 15 minuti, continuare l'incubazione per cinque minuti prima di registrare l'assorbimento finale a 340 nanometri. Per determinare la ramificazione del glicogeno, combinare 650 microlitri di reagente colorante di cloruro di calcio iodio con 100 microlitri di acqua in un tubo da 1,5 millilitri e mescolare accuratamente la soluzione prima di trasferirla in una cuvetta di metacrilato usa e getta.Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro per condurre una corsa in modalità di scansione della lunghezza d'onda per raccogliere lo spettro di fondo da 330 a 800 nanometri. In un tubo separato da 1,5 millilitri unire 650 microlitri del reagente colorante cloruro di calcio iodio funzionante con 50 microgrammi di glicogeno ostrica e portare il volume finale a 750 microlitri con acqua. Dopo aver miscelato accuratamente la miscela, trasferire la soluzione in una cuvetta di metacrilato usa e getta per raccogliere uno spettro di assorbimento da 330 a 800 nanometri.Allo stesso modo, ottenere uno spettro di assorbimento con 50 microgrammi di amilopectina e 30 microgrammi di amilosio come descritto in precedenza. Per ottenere un'indicazione della struttura ramificata di un campione di glicogeno non caratterizzato, combinare da 25 a 50 microgrammi di glicogeno con 650 microlitri del reagente colorante di cloruro di calcio iodio funzionante e procedere come spiegato in precedenza per acquisire lo spettro di assorbimento. Nei saggi della glicogeno sintasi è stata osservata una diminuzione lineare dell'assorbimento a 340 nanometri nel tempo.L'aggiunta di troppa glicogeno sintasi al test ha fatto sì che la reazione raggiungesse il completamento entro i primi due minuti. La reazione di controllo, che non conteneva glicogeno sintasi, non mostra alcuna diminuzione misurabile dell'assorbanza. I dati di un test di glicogeno fosforilasi utilizzando un enzima purificato avevano una fase lineare della durata di tre minuti.Un tasso di aumento dell'assorbanza di circa 0,01-0,04 unità al minuto è ottimale. Nel saggio dell'enzima di deramificazione del glicogeno, la reazione ha mostrato una fase lineare persistente per almeno 10 minuti. I dati rappresentativi dei saggi dell'enzima ramificante del glicogeno hanno mostrato la differenza nell'assorbanza tra i campioni di controllo che mancavano dell'enzima ramificato e le reazioni che contenevano l'enzima ramificato.Viene illustrata la gamma dinamica ristretta del test. La variazione massima nell'assorbanza che può essere prodotta è di 0,4 unità di assorbanza e la linearità viene persa quando la variazione dell'assorbimento è di circa 0,2 unità di assorbanza. Le masse di glicogeno, amilopectina e amilosio utilizzate nella valutazione della ramificazione del glicogeno hanno mostrato una lettura massima di assorbanza di circa 0,7-0,8, ciascuna a diversi massimi di assorbanza.Il campione di glicogeno ha prodotto due picchi a circa 400 nanometri e 460 nanometri. Il reagente colorante del cloruro di calcio iodio è molto denso. È importante assicurarsi che i campioni di glicogeno siano completamente miscelati con il reagente prima di raccogliere uno spettro di assorbimento.

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