Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Forfatteren vil gjerne takke Karoline Dittmer og Andrew Brittingham for deres innsikt og mange nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 og 03-20-04).

1. Bestemmelse av glykogensyntaseaktivitet
<ol><li>Klargjør stamløsninger av nødvendige reagenser som angitt i tabell 1 (før forsøksdagen).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Komponent</td>
			<td colspan="2">Veibeskrivelser</td>
		</tr><tr><td>50 mM Tris pH 8,0</td>
			<td colspan="2">Løs opp 0,61 g Tris-basen i ~ 80 ml vann.  Chill til 4 ° C.   Juster pH til 8,0 med HCl og gjør ...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism.">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li><li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase,+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose.">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li><li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1,6-glucosidase.">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li><li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose.">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li><li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis.">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li><li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases.">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li><li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues.">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li><li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates.">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li><li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,+6-diphosphatase,+phosphofructokinase,+glycogen+synthetase,+phosphorylase,+and+protein+kinase+from+swine+kidney.">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li><li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis.">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).</li><li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li><li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification,+properties+and+physiological+role.">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li><li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain:+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain.">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li><li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Enzymes Vol. 5. , 191-234 (1971).</li><li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+of+amylose+and+iodine.">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li><li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1,4,-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltansferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li><li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases.">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li><li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis:+An+unusual+member+of+the+starch/glycogen+synthase+family.">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-1,4-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver.">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li><li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

Generelt er de viktigste fordelene ved alle metodene som presenteres deres lave kostnader, letthet, hastighet og mangel på avhengighet av spesialutstyr. Den største ulempen som de alle deler er følsomhet sammenlignet med andre tilgjengelige metoder. Sensitiviteten til prosedyrene som involverer produksjon eller forbruk av NADH / NADPH er enkle å estimere. Gitt at utryddelseskoeffisienten til NADH / NADPH er 6,22 M-1 cm-1 , indikerer enkel aritmetikk at ~ 10-20 μM endringer i konsentrasjon lett ...

Glykogen er utbredt i naturen, med forbindelsen som finnes i bakterier, mange protister, sopp og dyr. I mikroorganismer er glykogen viktig for celleoverlevelse når næringsstoffer er begrensende, og i høyere organismer som pattedyr tjener syntese og nedbrytning av glykogen til å buffere blodsukkernivået 1,2,3. Studien av glykogenmetabolisme er derfor av betydning for så forskjellige felt som mikrobiologi og pattedyrfysiologi. Å forstå glykogenmetabolismen krever å studere de viktigste enzymene for glykogensyntese (glykogensyntase og forgreningsenzymet) og glykogennedbrytning (glykogenfosforylase og avgreningsenzym). Gullstandardanalysene av glykogensyntase, fosforylase, forgrening og debranching enzymaktiviteter benytter radioaktive isotoper. For eksempel måles glykogensyntase vanligvis i en stoppet radiokjemisk analyse ved å følge inkorporering av glukose fra UDP-[14 C] glukose (i tilfelle av dyre- og soppenzymer) eller ADP-[14C] glukose (i tilfelle av bakterielle enzymer) i glykogen 4,5. Tilsvarende måles glykogenfosforylase i retning av glykogensyntese, etter inkorporering av glukose fra [14C]glukose-1-fosfat til glykogen6. Forgreningsenzymet analyseres ved å måle dette enzymets evne til å stimulere inkorporering av [14 C] glukose fra glukose-1-fosfat i α1,4-bundne kjeder av glykogenfosforylase7, og avgreningsenzymaktivitet bestemmes ved å følge enzymets evne til å inkorporere [14C] glukose i glykogen8 . Selv om de er svært følsomme, slik at de kan brukes i råcelleekstrakter med lave nivåer av enzymaktivitet, er de radioaktive substratene dyre og underlagt forskriftskravene som følger med radioisotopbruk. Disse barrierene plasserer bruken av visse analyser utenfor rekkevidde for mange arbeidstakere. I løpet av mange år har imidlertid et imponerende utvalg av spektrofotometriske tilnærminger til måling av disse enzymene blitt beskrevet. Generelt er disse tilnærmingene til slutt avhengige av å måle produksjonen eller forbruket av NADH / NADPH, eller genereringen av fargede komplekser mellom glykogen og jod. Dermed er de enkle og kan utføres ved hjelp av enkle spektrofotometere utstyrt med bare wolfram- eller xenonblitslamper.
Spektrofotometriske analyser av glykogensyntase er avhengige av å måle nukleosiddifosfatet frigjort fra sukkernukleotiddonoren når glukose tilsettes til den voksende glykogenkjeden 9,10. Prosedyren for måling av glykogensyntaseaktivitet beskrevet i avsnitt 1 i protokollen nedenfor er en modifikasjon av den som er skissert av Wayllace et al.11, og koblingsskjemaet er vist nedenfor:
(Glukose) n + UPD-glukose → (glukose)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + fosfoenolpyruvat → pyruvat + ATP
Pyruvat + NADH + H + → Laktat + NAD +
Glykogensyntase tilfører glukose fra UDP-glukose til glykogen. UDP generert i denne prosessen omdannes til UTP av nukleosiddifosfatkinase (NDP-kinase), i en reaksjon som genererer ADP. ADP tjener i sin tur som et substrat for pyruvatkinase, som fosforylerer ADP ved bruk av fosfoenolpyruvat som fosfatdonor. Det resulterende pyruvatet omdannes til laktat av enzymet laktatdehydrogenase i en reaksjon som forbruker NADH. Analysen kan derfor utføres kontinuerlig, og overvåker reduksjonen i absorbans ved 340 nm når NADH forbrukes. Det er lett tilpasset for bruk med enzymer som krever ADP-glukose som glukosedonor. Her er koblingstrinnene enklere siden ADP frigjort ved virkningen av glykogensyntase påvirkes direkte av pyruvatkinase.
Det finnes en rekke spektrofotometriske analyser tilgjengelig for bestemmelse av glykogenfosforylaseaktivitet. I den klassiske versjonen drives enzymet bakover, i retning av glykogensyntese, som vist nedenfor:
(Glukose) n + glukose-1-fosfat → (glukose)n+1 + Pi
Ved tidsbestemte intervaller fjernes aliquots av reaksjonsblandingen, og mengden fosfatfrigjort kvantifiseres12,13. I våre hender har denne analysen vært av begrenset bruk på grunn av tilstedeværelsen av lett målbart fritt fosfat i mange kommersielle preparater av glukose-1-fosfat, kombinert med de høye konsentrasjonene av glukose-1-fosfat som kreves for fosforylasevirkning. Snarere har vi rutinemessig brukt en alternativ analyse som måler glukose-1-fosfat frigjort som glykogen nedbrytes av fosforylase13. En koblet reaksjonsordning, illustrert nedenfor, er brukt.
(Glukose) n + Pi → (glukose)n-1 + glukose-1-fosfat
Glukose-1-fosfat → glukose-6-fosfat
Glukose-6-fosfat + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H+
Glukose-1-fosfatet omdannes til glukose-6-fosfat av fosfoglukomutase, og glukose-6-fosfatet oksyderes deretter til 6-fosfoglukonolakton, med samtidig reduksjon av NADP + til NADPH. Prosedyren beskrevet i avsnitt 2 i protokollen nedenfor er avledet fra metoder beskrevet av Mendicino et al.14 og Schreiber & Bowling 15. Analysen kan lett utføres kontinuerlig, med økning i absorbans ved 340 nm over tid, slik at reaksjonshastigheten kan bestemmes.
Spektrofotometrisk bestemmelse av avgrenende enzymaktivitet er avhengig av måling av glukosen frigjort ved enzymets virkning på fosforylasegrensedekstrin 16. Denne forbindelsen er laget ved å behandle glykogen uttømmende med glykogenfosforylase. Siden glykogenfosforylasevirkningen stopper 4 glukoserester fra et α1,6-grenpunkt, inneholder grensen dekstrin glykogen, hvis ytre kjeder er forkortet til ~ 4 glukoserester. Fremstilling av fosforylasegrense dextrin er beskrevet her, ved hjelp av en prosedyre avledet fra de som er utviklet av Taylor et al.17 og Makino &Omichi 18.
Debranching er en to-trinns prosess. 4-α-glukanotransferaseaktiviteten til det bifunksjonelle avgreningsenzymet overfører først tre glukoserester fra grenpunktet til den ikke-reduserende enden av en nærliggende α1,4-bundet glukosekjede. Den enkle, α1,6-bundne glukoseresten som er igjen ved grenpunktet, hydrolyseres deretter av α1,6-glukosidaseaktiviteten19. Analysen utføres vanligvis på en stoppet måte, glukosen frigjøres etter en gitt tid (eller serie ganger) måles i en koblet enzymanalyse som vist nedenfor:
(Glukose) n → (glukose)n-1 + glukose 
Glukose + ATP → glukose-6-fosfat + ADP
Glukose-6-fosfat + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H+
Bestemmelsen av NADPH produsert gir et mål på glukoseproduksjon. Prosedyren som er skissert i avsnitt 3 i protokollen nedenfor, er basert på en som er beskrevet av Nelson et al.16. Som de andre metodene som er avhengige av forbruk eller generering av NADH / NADPH, er analysen ganske følsom. Imidlertid vil tilstedeværelsen av amylaser eller andre glukosidaser, som også kan frigjøre fri glukose fra fosforylasegrense dextrin, forårsake betydelig forstyrrelse (se diskusjon).
Den kolorimetriske bestemmelsen av forgreningsenzymaktivitet er avhengig av det faktum at α1,4-bundne kjeder av glukose vedtar spiralformede strukturer som binder seg til jod, og danner fargede komplekser20. Fargen på komplekset som dannes avhenger av lengden på α1,4-bundne kjeder. Dermed danner amylose, som består av lange, stort sett uforgrenede kjeder av α1,4-bundet glukose, et dypblått kompleks med jod. I motsetning til dette danner glykogener, hvis ytre kjeder vanligvis er i størrelsesorden bare 6 til 8 glukoserester lange, oransje-røde komplekser. Hvis en løsning av amylose inkuberes med forgreningsenzym, resulterer innføringen av grener i amylosen i generering av kortere α1,4-bundne glukosekjeder. Dermed skifter absorpsjonsmaksimumet til amylose/jodkompleksene mot kortere bølgelengder. Prosedyren diskutert her er avledet fra det som er beskrevet av Boyer & Preiss21 og forgreningsenzymaktivitet kvantifiseres som en reduksjon i absorpsjon av amylose / jodkomplekset ved 660 nm over tid.
Som det fremgår av diskusjonen ovenfor, betyr det faktum at fargene på kompleksene dannet mellom jod og α1,4-glukosekjeder varierer med kjedelengden, at absorbansspektrene til glykogen / jodkomplekser bør variere med graden av glykogenforgrening. Dette er faktisk tilfelle, og mindre forgrenede glykogener / glykogener med lengre ytre kjeder absorberer lys ved en lengre bølgelengde enn glykogener som er mer forgrenede / har kortere ytre kjeder. Jodfargingsreaksjonen kan derfor brukes til å få raske, kvalitative data om graden av glykogenforgrening22. Den oransjebrune fargen dannes når glykogenkomplekser med jod ikke er spesielt intense. Imidlertid kan fargeutviklingen forbedres ved inkludering av mettet kalsiumkloridoppløsning22. Dette øker følsomheten til metoden rundt 10 ganger og tillater klar analyse av mikrogrammengder glykogen. Analysen for bestemmelse av forgrening beskrevet i avsnitt 4 i protokollen, nedenfor, er tilpasset fra en prosedyre utviklet av Krisman22. Det utføres ganske enkelt ved å kombinere glykogenprøven med jodoppløsning og kalsiumklorid i en kyvette og samle absorpsjonsspekteret fra 330 nm til 800 nm. Absorbansmaksimumet forskyves mot lengre bølgelengder etter hvert som graden av forgrening avtar.
Samlet gir metodene beskrevet her enkle, pålitelige midler for å vurdere aktivitetene til nøkkelenzymene for glykogenmetabolisme, og for å oppnå kvalitative data om omfanget av glykogenrenering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

Glykogen syntetiseres som en lagringsform av glukose av et bredt spekter av organismer, alt fra bakterier til dyr. Molekylet består av lineære kjeder av α1,4-bundne glukoserester med grener introdusert ved tilsetning av α1,6-koblinger. Å forstå hvordan syntesen og nedbrytningen av glykogen reguleres og hvordan glykogen oppnår sin karakteristiske forgrenede struktur, krever studier av enzymer for glykogenlagring. Imidlertid bruker metodene som oftest brukes til å studere disse enzymaktivitetene, reagenser eller teknikker som ikke er tilgjengelige for alle etterforskere. Her diskuterer vi et batteri av prosedyrer som er teknisk enkle, kostnadseffektive og likevel i stand til å gi verdifull innsikt i kontrollen av glykogenlagring. Teknikkene krever tilgang til et spektrofotometer, som opererer i området 330 til 800 nm, og er beskrevet under forutsetning av at brukerne vil benytte engangs plastkuvetter. Prosedyrene er imidlertid lett skalerbare og kan modifiseres for bruk i en mikroplateleser, noe som muliggjør svært parallell analyse.

Bestemmelse av glykogensyntaseaktivitet Figur 1 viser representative resultater fra glykogensyntaseanalyser med rensede enzymer. I panel A, etter et lite etterslep, var det en lineær reduksjon i absorpsjonen ved 340 nm over tid i en periode på rundt 12 minutter. Endringshastigheten i absorpsjon i figur 1A var ~0,12 absorbansenheter/min. En endringshastighet i absorbans mellom ~0,010 og ~0,20 absorbansenheter/min er optimal, og mengden tilsa...

Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Teknikker for å måle aktiviteten til viktige enzymer av glykogenmetabolisme presenteres ved hjelp av et enkelt spektrofotometer som opererer i det synlige området.

Spektrofotometriske metoder for studier av eukaryotisk glykogenmetabolisme

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

Protokollene er signifikante, fordi de unngår bruk av radioaktive isotoper og fjerner en barriere som kan hindre mange arbeidere i å studere enzymer av glykogenmetabolisme. Prosedyrene som er beskrevet er billige, og krever bare tilgang til et enkelt spektrofotometer. For å starte med bestemmelsen av glykogensyntaseaktivitet, tine de tidligere tilberedte stamløsningene av UDP-glukose, ATP, fosfoenolpyruvat og NDP-kinase på is.Forvarm et vannbad til 30 grader celsius. Når stamløsningene er klare, lag tilstrekkelig analyseblanding i henhold til antall glykogensyntaseanalyser ved å tilsette reagensene til et 15 milliliter rør, som beskrevet i tekstprotokollen. Forbered en tom reaksjon ved å erstatte NADH fra reaksjonsblandingen med vannet, og overfør reaksjonen til en engangs metakrylatkyvette.Bruk den tomme reaksjonen til å sette null på spektrofotometeret ved bølgelengden på 340 nanometer. Ta en 770 mikroliter aliquot av reaksjonsblandingen i et 1,5 milliliter rør, og tilsett sekvensielt to mikroliter hver av NDP-kinase og pyruvatkinaselaktatdehydrogenaseblanding til røret. Etter blanding, inkuber forsiktig røret ved 30 grader celsius i vannbadet i tre minutter for å forvarme reaksjonsblandingen.Tilsett deretter 30 mikroliter av prøven som inneholder glykogensyntase i 20 millimolar Tris-buffer ved pH 7,8, og bland forsiktig før reaksjonsblandingen overføres til en deponeringsmetakrylatkyvette. Plasser kyvetten i spektrofotometeret, og registrer absorbansen ved 340 nanometer med tidsbestemte intervaller i 10 til 20 minutter. Deretter plotter du absorbansene som er oppnådd mot tiden.For å måle den frigjorte glukosen, overfør 40 mikroliter av supernatanten fra de oppvarmede glykogenprøvene til engangsmetakrylatkyvettene. Og tilsett de målte volumene trietanolamin, hydrokloridmagnesiumsulfatbuffer, NADP ATP-blanding og vann som beskrevet i manuskriptet. Bland blandingen ved å pipettere forsiktig opp og ned uten å skape luftbobler.Tilsett 0,5 mikroliter glukose-6-fosfat dehydrogenase til hver kyvette. Etter blanding ved pipettering, inkuber blandingen ved romtemperatur i 10 minutter, og registrer deretter absorbansen ved 340 nanometer. Bland deretter 0,5 mikroliter heksokinase til hver kyvette som beskrevet tidligere, og inkuber i 15 minutter før du registrerer det absorberende settet 340 nanometer.Fortsett deretter inkubasjonen ved romtemperatur i fem minutter, etterfulgt av opptak av absorbansen. Hvis absorpsjonen har økt fra det som er registrert på 15 minutter, fortsett inkubasjonen i fem minutter før du registrerer den endelige absorpsjonen ved 340 nanometer. For å bestemme glykogenforgreningen, kombiner 650 mikroliter jodkalsiumkloridfargereagenslager med 100 mikroliter vann i et 1, 5 milliliter rør, og bland løsningen grundig før du overfører til en engangs metakrylatkyvette.Plasser kyvetten i spektrofotometeret for å utføre en kjøring i en bølgelengdeskanningsmodus for å samle bakgrunnsspekteret fra 330 til 800 nanometer. I et separat 1,5 milliliter rør kombineres 650 mikroliter av det arbeidende jodkalsiumkloridfargereagenset med 50 mikrogram østersglykogen, og utgjør sluttvolumet til 750 mikroliter med vann. Etter å ha blandet blandingen grundig, overfør løsningen til en engangs metakrylatkyvette for å samle et absorpsjonsspektrum fra 330 til 800 nanometer.Tilsvarende oppnå et absorpsjonsspektrum med 50 mikrogram amylopektin og 30 mikrogram amylose som beskrevet tidligere. For å få en indikasjon på den forgrenede strukturen til en ukarakterisert glykogenprøve, kombiner 25 til 50 mikrogram av glykogenet med 650 mikroliter av det arbeidende jodkalsiumkloridfargereagenset, og fortsett som forklart tidligere for å skaffe absorpsjonsspekteret. I glykogensyntaseanalysene ble det observert en lineær reduksjon i absorpsjonen ved 340 nanometer over tid.Tilsetning av for mye glykogensyntase til analysen førte til at reaksjonen ble fullført i løpet av de første to minuttene. Kontrollreaksjonen, som ikke inneholdt glykogensyntase, viser ingen målbar reduksjon i absorbans. Dataene fra en glykogenfosforylaseanalyse ved bruk av et renset enzym hadde en lineær fase som varte i tre minutter.En absorbansøkning på rundt 0,01 til 0,04 enheter per minutt er optimalt. I glykogendeforgreningsenzymanalysen viste reaksjonen en lineær fase som vedvarte i minst 10 minutter. De representative dataene fra glykogenforgreningsenzymanalysene viste forskjellen i absorbansen mellom kontrollprøvene som manglet forgreningsenzym, og reaksjonene som inneholdt forgreningsenzym.Det smale dynamiske området til analysen er illustrert. Den maksimale endringen i absorbansen som kan produseres er 0,4 absorbansenheter, og lineariteten går tapt når endringen i absorpsjonen er ca. 0,2 absorbansenheter. Massene av glykogen, amylopektin og amylose som ble brukt i glykogenforgreningsvurderingen viste en maksimal absorbansavlesning på rundt 0,7 til 0,8, hver ved forskjellige absorbansmaksima.Glykogenprøven produserte to topper på omtrent 400 nanometer og 460 nanometer. Jod kalsiumkloridfargereagenset er veldig tett. Det er viktig å sikre at glykogenprøvene blandes fullt ut med reagenset før de samler et absorpsjonsspektrum.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Anatomy and Physiology

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

En metode for å måle metabolismen i sortert subpopulasjoner av komplekse Cell Communities Bruke stabile isotoper Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse av glykogeninnholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometri fastsettelse av Phycobiliprotein innhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposome mål for studiet av Proton pumpe membran enzymer elektrokjemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttrykk, Solubilization og rensing av eukaryote Borate transportører

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studier på metabolismen av seks systemiske insektmidler i en nylig etablert Cell suspensjon kultur avledet fra Tea (Camellia Sinensis L.) Blader

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheter (SUBEs) som verktøy for berikelse, isolasjon, identifisering og karakterisering av SUMO proteom i leverkreft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

En integrert Raman spektroskopi og Mass massespektrometri Platform å studere single-Cell Drug opptak, metabolisme, og effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...