Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Автор хотел бы поблагодарить Каролин Диттмер и Эндрю Бриттингема за их идеи и множество полезных дискуссий. Эта работа была частично поддержана грантами Фонда остеопатического образования и исследований Айовы (IOER 03-17-05 и 03-20-04).

1. Определение активности гликогенсинтазы
<ol><li>Готовят исходные растворы необходимых реагентов, как указано в таблице 1 (до дня эксперимента).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Компонент</td>
			<td colspan="2">Маршруты</td>
		</tr><tr><td>50 мМ Трис p...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism.">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li><li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase,+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose.">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li><li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1,6-glucosidase.">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li><li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose.">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li><li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis.">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li><li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases.">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li><li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues.">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li><li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates.">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li><li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,+6-diphosphatase,+phosphofructokinase,+glycogen+synthetase,+phosphorylase,+and+protein+kinase+from+swine+kidney.">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li><li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis.">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).</li><li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li><li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification,+properties+and+physiological+role.">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li><li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain:+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain.">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li><li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Enzymes Vol. 5. , 191-234 (1971).</li><li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+of+amylose+and+iodine.">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li><li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1,4,-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltansferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li><li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases.">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li><li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis:+An+unusual+member+of+the+starch/glycogen+synthase+family.">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-1,4-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver.">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li><li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

В целом, ключевыми преимуществами всех представленных методов являются их низкая стоимость, легкость, скорость и отсутствие зависимости от специализированного оборудования. Основным недостатком, который они все разделяют, является чувствительность по сравнению с другими доступными ...

Гликоген широко распространен в природе, причем соединение содержится в бактериях, многих протистах, грибах и животных. В микроорганизмах гликоген важен для выживания клеток, когда питательные вещества ограничиваются, а у высших организмов, таких как млекопитающие, синтез и деградация гликогена служат для буферизации уровня глюкозы в крови 1,2,3. Поэтому изучение метаболизма гликогена имеет важное значение для таких разнообразных областей, как микробиология и физиология млекопитающих. Понимание метаболизма гликогена требует изучения ключевых ферментов синтеза гликогена (гликогенсинтаза и фермент ветвления) и деградации гликогена (фосфорилаза гликогена и фермент деветривания). Анализы золотого стандарта гликогенсинтазы, фосфорилазы, ветвления и деветвирующего фермента используют радиоактивные изотопы. Например, гликогенсинтазу обычно измеряют в остановленном радиохимическом анализе путем включения глюкозы из UDP-[14C]глюкозы (в случае животных и грибковых ферментов) или ADP-[14C]глюкозы (в случае бактериальных ферментов) в гликоген 4,5. Аналогичным образом, гликогенфосфорилазу измеряют в направлении синтеза гликогена после включения глюкозы из [14С]глюкозо-1-фосфата в гликоген6. Ветвящийся фермент анализируют путем измерения способности этого фермента стимулировать включение [14С]глюкозы из глюкозо-1-фосфата в α1,4-связанные цепи гликогенфосфорилазой7, а активность фермента деветривания определяют путем следования способности фермента включать [14С]глюкозу в гликоген8 . Будучи очень чувствительными, что позволяет использовать их в сырых клеточных экстрактах с низким уровнем активности ферментов, радиоактивные субстраты являются дорогостоящими и подчиняются нормативным требованиям, связанным с использованием радиоизотопов. Эти барьеры делают использование определенных анализов недоступным для многих работников. Однако в течение многих лет было описано впечатляющее разнообразие спектрофотометрических подходов к измерению этих ферментов. В целом, эти подходы в конечном итоге основаны на измерении производства или потребления NADH / NADPH или генерации цветных комплексов между гликогеном и йодом. Таким образом, они просты и могут быть выполнены с помощью простых спектрофотометров, оснащенных только вольфрамовыми или ксеноновыми лампами-вспышками.
Спектрофотометрические анализы гликогенсинтазы основаны на измерении нуклеозиндифосфата, высвобождаемого донором нуклеотида сахара, когда глюкоза добавляется к растущей гликогеннойцепи 9,10. Процедура измерения активности гликогенсинтазы, описанная в разделе 1 протокола ниже, является модификацией процедуры, описанной в Wayllace et al.11, и схема связи показана ниже:
(Глюкоза) n + UPD-глюкоза → (глюкоза)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
АДФ + фосфоенолпируват → пируват + АТФ
Пируват + NADH + H+ → лактат + NAD+
Гликогенсинтаза добавляет глюкозу из UDP-глюкозы на гликоген. UDP, генерируемый в этом процессе, превращается в UTP нуклеозиндифосфаткиназой (NDP-киназой) в реакции, которая генерирует ADP. АДФ, в свою очередь, затем служит субстратом для пируваткиназы, которая фосфорилирует АДФ с использованием фосфоэнолпирувата в качестве донора фосфата. Полученный пируват превращается в лактат ферментом лактатдегидрогеназой в реакции, которая потребляет NADH. Таким образом, анализ может быть выполнен непрерывным образом, контролируя снижение поглощения при 340 нм по мере потребления NADH. Он легко адаптирован для использования с ферментами, которые требуют АДФ-глюкозы в качестве донора глюкозы. Здесь этапы связи проще, поскольку АДФ, высвобождаемый под действием гликогенсинтазы, непосредственно воздействует на пируваткиназу.
Существуют различные спектрофотометрические анализы, доступные для определения активности гликогенфосфорилазы. В классическом варианте фермент движется назад, в направлении синтеза гликогена, как показано ниже:
(Глюкоза) n + Глюкозо-1-фосфат → (Глюкоза)n+1 + Pi
Через определенные промежутки времени аликвоты реакционной смеси удаляются, а количество высвобождаемого фосфата количественно определяется12,13. В наших руках этот анализ имеет ограниченное применение из-за наличия легко измеримого свободного фосфата во многих коммерческих препаратах глюкозо-1-фосфата в сочетании с высокими концентрациями глюкозо-1-фосфата, необходимыми для действия фосфорилазы. Скорее, мы обычно используем альтернативный анализ, который измеряет глюкозо-1-фосфат, высвобождаемый при разложении гликогена фосфорилазой13. Используется схема сопряженной реакции, проиллюстрированная ниже.
(Глюкоза) n + Pi → (глюкоза)n-1 + глюкозо-1-фосфат
Глюкозо-1-фосфат → глюкозо-6-фосфат
Глюкозо-6-фосфат + NADP+ → 6-фосфоглюконолактон + NADPH + H+
Глюкозо-1-фосфат превращается в глюкозо-6-фосфат фосфоглюкомутазой, а глюкозо-6-фосфат затем окисляется до 6-фосфоглюконолактона с сопутствующим восстановлением NADP+ до NADPH. Процедура, описанная в разделе 2 протокола ниже, получена из методов, описанных Mendicino et al.14 и Schreiber & Bowling15. Анализ может быть легко выполнен непрерывным образом, с увеличением абсорбции на 340 нм с течением времени, что позволяет определить скорость реакции.
Спектрофотометрическое определение активности деветвирующего фермента основывается на измерении глюкозы, высвобождаемой действием фермента на предел фосфорилазы декстрина16. Это соединение производится путем исчерпывающей обработки гликогена гликогенфосфорилазой. Поскольку действие фосфорилазы гликогена останавливает 4 остатка глюкозы от точки α1,6-ветви, предел декстрина содержит гликоген, внешние цепи которого были укорочены до ~4 остатков глюкозы. Получение предельного декстрина фосфорилазы описано здесь с использованием процедуры, полученной из тех, которые были разработаны Taylor et al.17 и Makino & Omichi18.
Дебрафингирование представляет собой двухэтапный процесс. Активность 4-α-глюканотрансферазы бифункционального деветвирующего фермента сначала переносит три остатка глюкозы из точки ветви в неизлучающий конец близлежащей α1,4-связанной глюкозной цепи. Одиночный, α1,6-связанный остаток глюкозы, оставшийся в точке ветвления, затем гидролизуется активностью α1,6-глюкозидазы19. Анализ обычно выполняется остановленным образом, глюкоза, высвобождаемая через определенное время (или серию раз), измеряется в связанном ферментном анализе, как показано ниже:
(Глюкоза) n → (глюкоза)n-1 + глюкоза
Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат + АДФ
Глюкозо-6-фосфат + NADP+ → 6-фосфоглюконолактон + NADPH + H+
Определение NADPH производится, дает меру производства глюкозы. Процедура, изложенная в разделе 3 протокола ниже, основана на процедуре, описанной Нельсоном и др.16. Как и другие методы, которые полагаются на потребление или генерацию NADH / NADPH, анализ довольно чувствителен. Однако наличие амилаз или других глюкозидаз, которые также могут высвобождать свободную глюкозу из фосфорилазы предельного декстрина, вызовет значительные помехи (см. Обсуждение).
Колориметрическое определение активности ветвящихся ферментов основывается на том, что α1,4-связанные цепи глюкозы принимают спиральные структуры, которые связываются с йодом, образуя цветные комплексы20. Цвет образующегося комплекса зависит от длины α1,4-связанных цепей. Таким образом, амилоза, состоящая из длинных, в значительной степени неразветвленных цепочек α1,4-связанной глюкозы, образует темно-синий комплекс с йодом. Напротив, гликогены, внешние цепи которых, как правило, имеют длину от 6 до 8 остатков глюкозы, образуют оранжево-красные комплексы. Если раствор амилозы инкубируют с ветвящимся ферментом, введение ветвей в амилозу приводит к образованию более коротких α1,4-связанных цепей глюкозы. Таким образом, максимум поглощения комплексов амилоза/йод смещается в сторону более коротких длин волн. Процедура, обсуждаемая здесь, получена из того, что подробно описано в Boyer & Preiss21 , и активность ветвящегося фермента количественно определяется как снижение поглощения комплекса амилозы / йода при 660 нм с течением времени.
Как должно быть ясно из обсуждения выше, тот факт, что цвета комплексов, образующихся между цепями йода и α1,4-глюкозы, изменяются в зависимости от длины цепи, означает, что спектры поглощения комплексов гликоген/йод должны изменяться в зависимости от степени ветвления гликогена. Это действительно так, и менее разветвленные гликогены / гликогены с более длинными внешними цепями поглощают свет на более длинной длине волны, чем гликогены, которые более разветвлены / имеют более короткие внешние цепи. Таким образом, реакция окрашивания йодом может быть использована для получения быстрых качественных данных о степени ветвления гликогена22. Оранжево-коричневый цвет образуется, когда комплексы гликогена с йодом не отличаются особой интенсивностью. Однако развитие цвета может быть усилено включением насыщенного раствора хлорида кальция22. Это повышает чувствительность метода примерно в 10 раз и позволяет проводить готовый анализ микрограммовых количеств гликогена. Анализ для определения ветвления, описанный в разделе 4 протокола ниже, адаптирован из процедуры, разработанной Krisman22. Его проводят просто путем объединения образца гликогена с раствором йода и хлорида кальция в кювете и сбора спектра поглощения от 330 нм до 800 нм. Максимум поглощения смещается в сторону более длинных волн по мере уменьшения степени ветвления.
В совокупности методы, описанные здесь, обеспечивают простые, надежные средства оценки активности ключевых ферментов метаболизма гликогена и получения качественных данных о степени ветвления гликогена.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

Гликоген синтезируется в качестве формы хранения глюкозы широким спектром организмов, начиная от бактерий и заканчивая животными. Молекула содержит линейные цепи α1,4-связанных остатков глюкозы с ветвями, вводимыми путем добавления α1,6-связей. Понимание того, как регулируется синтез и деградация гликогена и как гликоген достигает своей характерной разветвленной структуры, требует изучения ферментов хранения гликогена. Однако методы, наиболее часто используемые для изучения этих ферментных активностей, обычно используют реагенты или методы, которые доступны не всем исследователям. Здесь мы обсуждаем ряд процедур, которые технически просты, экономически эффективны и все же способны обеспечить ценную информацию о контроле хранения гликогена. Методы требуют доступа к спектрофотометру, работающему в диапазоне от 330 до 800 нм, и описаны при условии, что пользователи будут использовать одноразовые пластиковые кюветы. Тем не менее, процедуры легко масштабируются и могут быть изменены для использования в считывателе микропластин, что позволяет проводить высокопараллельный анализ.

Определение активности гликогенсинтазы На рисунке 1 показаны репрезентативные результаты анализов гликогенсинтазы с использованием очищенных ферментов. На панели А после небольшого отставания наблюдалось линейное снижение поглощения при 340 нм с течением ?...

Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Представлены методики измерения активности ключевых ферментов метаболизма гликогена с использованием простого спектрофотометра, работающего в видимом диапазоне.

Спектрофотометрические методы исследования метаболизма эукариотического гликогена

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

Протоколы важны, потому что они избегают использования радиоактивных изотопов и устраняют барьер, который может помешать многим работникам изучать ферменты метаболизма гликогена. Описанные процедуры недороги, требуя только доступа к простому спектрофотометру. Чтобы начать с определения активности гликогенсинтазы, разморозьте на льду ранее приготовленные исходные растворы UDP глюкозы, АТФ, фосфоэнолпирувата и NDP-киназы.Предварительно нагрейте водяную баню до 30 градусов цельсия. Когда исходные растворы будут готовы, приготовьте достаточную пробирную смесь в соответствии с количеством анализов гликогенсинтазы, добавив реагенты в 15-миллилитровую трубку, как описано в текстовом протоколе. Приготовьте пустую реакцию, заменив NADH из реакционной смеси водой, и перенесите реакцию в одноразовую метакрилатную кювету.Используйте пустую реакцию, чтобы установить ноль на спектрофотометре на длине волны 340 нанометров. Возьмите одну аликвоту 770 микролитров реакционной смеси в 1,5-миллилитровой трубке и последовательно добавьте в пробирку по два микролитра смеси NDP-киназы и пируваткиназы лактатдегидрогеназы. После перемешивания аккуратно инкубируйте трубку при температуре 30 градусов Цельсия на водяной бане в течение трех минут, чтобы предварительно прогреть реакционную смесь.Затем добавляют 30 микролитров образца, содержащего гликогенсинтазу, в 20-миллимолярный буфер Триса при рН 7,8 и аккуратно перемешивают перед переносом реакционной смеси в утилизационную метакрилатную кювету. Поместите кювету в спектрофотометр и запишите поглощение на 340 нанометров с временными интервалами в течение 10-20 минут. Затем нанесите график поглощений, полученных против времени.Чтобы измерить высвобождаемую глюкозу, перенесите 40 микролитров супернатанта из нагретых образцов гликогена в одноразовые метакрилатные кюветы. И добавьте измеренные объемы триэтаноламина, гидрохлоридно-магниевого сульфатного буфера, смеси NADP ATP и воды, как описано в рукописи. Перемешайте смесь, аккуратно пипетируя вверх и вниз, не создавая пузырьков воздуха.Добавьте 0,5 микролитра глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы к каждой кювете. После перемешивания путем пипетки инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем регистрируют поглощение на 340 нанометров. Затем смешайте 0,5 микролитра гексокиназы с каждой кюветой, как описано ранее, и инкубируйте в течение 15 минут перед записью абсорбирующего набора 340 нанометров.Затем продолжают инкубацию при комнатной температуре в течение пяти минут с последующей записью поглощения. Если поглощение увеличилось по сравнению с тем, которое было зарегистрировано через 15 минут, продолжайте инкубацию в течение пяти минут, прежде чем регистрировать окончательное поглощение на 340 нанометров. Чтобы определить разветвление гликогена, соедините 650 микролитров цветного реагента йода хлорида кальция со 100 микролитрами воды в трубке объемом 1,5 миллилитра и тщательно перемешайте раствор перед переносом в одноразовый метакрилатный кювет.Поместите кювету в спектрофотометр для проведения пробега в режиме сканирования длины волны для сбора фонового спектра от 330 до 800 нанометров. В отдельной 1,5-миллилитровой трубке соединить 650 микролитров рабочего цветного реагента йода хлорида кальция с 50 мкг устричного гликогена, и составить конечный объем до 750 микролитров с водой. После тщательного смешивания смеси переложите раствор в одноразовую метакрилатную кювету для сбора спектра поглощения от 330 до 800 нанометров.Аналогично, получите спектр поглощения с 50 микрограммами амилопектина и 30 микрограммами амилозы, как описано ранее. Чтобы получить указание на разветвленную структуру нехарактеризованного образца гликогена, соедините от 25 до 50 мкг гликогена с 650 микролитрами рабочего цветового реагента хлорида кальция йода и приступайте, как объяснялось ранее, к приобретению спектра поглощения. В анализах гликогенсинтазы наблюдалось линейное снижение абсорбции на 340 нанометров с течением времени.Добавление слишком большого количества гликогенсинтазы в анализ привело к тому, что реакция достигла завершения в течение первых двух минут. Контрольная реакция, которая не содержала гликогенсинтазы, не показала измеримого снижения абсорбции. Данные анализа гликогенфосфорилазы с использованием очищенного фермента имели линейную фазу, длящуюся в течение трех минут.Скорость увеличения поглощения от 0,01 до 0,04 единицы в минуту является оптимальной. В анализе гликогена, де-ветвящегося фермента, реакция показала линейную фазу, сохраняющуюся в течение, по меньшей мере, 10 минут. Репрезентативные данные анализов ферментов ветвления гликогена показали разницу в абсорбции между контрольными образцами, в которых отсутствовал ветвящийся фермент, и реакциями, содержащими ветвящийся фермент.Проиллюстрирован узкий динамический диапазон анализа. Максимальное изменение поглощения, которое может быть произведено, составляет 0,4 единицы поглощения, а линейность теряется, когда изменение поглощения составляет приблизительно 0,2 единицы поглощения. Массы гликогена, амилопектина и амилозы, используемые в оценке ветвления гликогена, показали максимальное показание абсорбции от 0,7 до 0,8, каждый при разных максимумах абсорбции.Образец гликогена произвел два пика примерно на 400 нанометров и 460 нанометров. Цветной реагент хлорида йода очень плотный. Важно убедиться, что образцы гликогена полностью смешаны с реагентом до сбора спектра поглощения.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Anatomy and Physiology

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Метод для измерения Метаболизм в отсортированном субпопуляции сложных сообществ клеток с использованием стабильных изотопов Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Определение содержания гликогена в цианобактериях

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Спектрофотометрические определение содержания Phycobiliprotein в цианобактерии Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Выражение, солюбилизация и очистки эукариотических Борат транспортеров

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Изучение метаболизма шести системных инсектицидов в недавно созданной культуре подвески клеток, полученных из чая(Камелия Sinensis L.) Листья

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-обязательные организации (SUBEs) как инструменты для обогащения, изоляции, идентификации и характеристики ПРОтеоме СУМО при раке печени

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Интегрированная Рамана спектроскопия и массовая спектрометрия Платформа для изучения одноклеточного потребления наркотиков, метаболизма и эффектов

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...