Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Författaren vill tacka Karoline Dittmer och Andrew Brittingham för deras insikter och många hjälpsamma diskussioner. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 och 03-20-04).

1. Bestämning av glykogensyntasaktivitet
<ol><li>Bered stamlösningar av erforderliga reagenser enligt tabell 1 (före försöksdagen).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Komponent</td>
			<td colspan="2">Vägbeskrivning</td>
		</tr><tr><td>50 mM Tris pH 8,0</td>
			<td colspan="2">Lös upp 0,61 g Tris-basen i ~ 80 ml vatten.  Kyl till 4 °C.   Justera pH till 8,0 med HCl och gör volyme...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism.">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li><li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase,+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose.">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li><li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1,6-glucosidase.">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li><li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose.">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li><li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis.">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li><li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases.">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li><li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues.">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li><li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates.">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li><li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,+6-diphosphatase,+phosphofructokinase,+glycogen+synthetase,+phosphorylase,+and+protein+kinase+from+swine+kidney.">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li><li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis.">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).</li><li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li><li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification,+properties+and+physiological+role.">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li><li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain:+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain.">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li><li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Enzymes Vol. 5. , 191-234 (1971).</li><li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+of+amylose+and+iodine.">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li><li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1,4,-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltansferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li><li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases.">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li><li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis:+An+unusual+member+of+the+starch/glycogen+synthase+family.">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-1,4-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver.">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li><li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

I allmänhet är de viktigaste fördelarna med alla presenterade metoder deras låga kostnad, lätthet, hastighet och brist på beroende av specialutrustning. Den största nackdelen som de alla delar är känslighet jämfört med andra tillgängliga metoder. Känsligheten hos de förfaranden som involverar produktion eller konsumtion av NADH / NADPH är lätt att uppskatta. Med tanke på att utrotningskoefficienten för NADH / NADPH är 6,22 M-1 cm-1 , indikerar enkel aritmetik att ~ 10-20 μM för?...

Glykogen är utbredd i naturen, med föreningen som finns i bakterier, många protister, svampar och djur. I mikroorganismer är glykogen viktigt för cellöverlevnad när näringsämnen är begränsande och i högre organismer som däggdjur tjänar syntes och nedbrytning av glykogen till att buffra blodsockernivån 1,2,3. Studiet av glykogenmetabolism är därför av betydelse för så olika områden som mikrobiologi och däggdjursfysiologi. Att förstå glykogenmetabolism kräver att man studerar nyckelenzymerna för glykogensyntes (glykogensyntas och förgreningsenzymet) och glykogennedbrytning (glykogenfosforylas och förgreningsenzym). Guldstandardanalyserna av glykogensyntas, fosforylas, förgrening och avförgrening av enzymaktiviteter använder radioaktiva isotoper. Till exempel mäts glykogensyntas i allmänhet i en stoppad radiokemisk analys genom att följa införlivandet av glukos från UDP-[14 C] glukos (när det gäller djur- och svampenzymer) eller ADP-[14C] glukos (i fallet med bakteriella enzymer) i glykogen 4,5. På liknande sätt mäts glykogenfosforylas i riktning mot glykogensyntes, efter införlivandet av glukos från [14C] glukos-1-fosfat i glykogen6. Förgreningsenzymet analyseras genom att mäta detta enzyms förmåga att stimulera införlivandet av [14 C] glukos från glukos-1-fosfat i a1,4-bundna kedjor av glykogenfosforylas7, och förgrenande enzymaktivitet bestäms genom att följa enzymets förmåga att införliva [14C] glukos i glykogen8 . Även om de är mycket känsliga, vilket tillåter deras användning i råcellsextrakt med låga nivåer av enzymaktivitet, är de radioaktiva substraten dyra och omfattas av de lagstadgade kraven som följer med radioisotopanvändning. Dessa hinder placerar användningen av vissa analyser utom räckhåll för många arbetstagare. Under många år har emellertid en imponerande mängd spektrofotometriska tillvägagångssätt för mätning av dessa enzymer beskrivits. I allmänhet förlitar sig dessa tillvägagångssätt i slutändan på att mäta produktionen eller konsumtionen av NADH / NADPH, eller genereringen av färgade komplex mellan glykogen och jod. Således är de enkla och kan utföras med enkla spektrofotometrar utrustade med endast volfram- eller xenonblixtlampor.
Spektrofotometriska analyser av glykogensyntas är beroende av att mäta nukleosiddifosfatet som frigörs från sockernukleotiddonatorn när glukos tillsätts till den växande glykogenkedjan 9,10. Förfarandet för mätning av glykogensyntasaktivitet som beskrivs i avsnitt 1 i protokollet nedan är en modifiering av det som beskrivs av Wayllace et al.11, och kopplingsschemat visas nedan:
(Glukos) n + UPD-glukos → (glukos)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + fosfoenolpyruvat → pyruvat + ATP
Pyruvat + NADH + H+ → Laktat + NAD+
Glykogensyntas tillför glukos från UDP-glukos till glykogen. UDP som genereras i denna process omvandlas till UTP med nukleosiddifosfatkinas (NDP-kinas), i en reaktion som genererar ADP. ADP fungerar i sin tur sedan som ett substrat för pyruvatkinas, vilket fosforylerar ADP med fosfoenolpyruvat som fosfatgivare. Den resulterande pyruvaten omvandlas till laktat av enzymet laktatdehydrogenas i en reaktion som förbrukar NADH. Analysen kan därför utföras kontinuerligt och övervaka minskningen av absorbansen vid 340 nm när NADH konsumeras. Det är lätt anpassat för användning med enzymer som kräver ADP-glukos som glukosgivare. Här är kopplingsstegen enklare eftersom ADP som frigörs genom verkan av glykogensyntas påverkas direkt av pyruvatkinas.
Det finns en mängd olika spektrofotometriska analyser tillgängliga för bestämning av glykogenfosforylasaktivitet. I den klassiska versionen drivs enzymet bakåt, i riktning mot glykogensyntes, som visas nedan:
(Glukos) n + Glukos-1-fosfat → (glukos)n+1 + Pi
Vid tidsbestämda intervall avlägsnas alikvoter av reaktionsblandningen och mängden fosfat som frigörs kvantifieras12,13. I våra händer har denna analys varit av begränsad användning på grund av närvaron av lätt mätbart fritt fosfat i många kommersiella beredningar av glukos-1-fosfat, i kombination med de höga koncentrationerna av glukos-1-fosfat som krävs för fosforylasverkan. Snarare har vi rutinmässigt använt en alternativ analys som mäter glukos-1-fosfatet som frigörs när glykogen bryts ned av fosforylas13. Ett kopplat reaktionsschema, illustrerat nedan, används.
(Glukos) n + Pi → (glukos)n-1 + glukos-1-fosfat
Glukos-1-fosfat → glukos-6-fosfat
Glukos-6-fosfat + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H+
Glukos-1-fosfatet omvandlas till glukos-6-fosfat med fosfoglukomutas och glukos-6-fosfatet oxideras sedan till 6-fosfoglukonolakton, med samtidig reduktion av NADP+ till NADPH. Förfarandet som beskrivs i avsnitt 2 i protokollet nedan härrör från metoder som beskrivs av Mendicino et al.14 och Schreiber & Bowling 15. Analysen kan lätt utföras på ett kontinuerligt sätt, med ökningen av absorbansen vid 340 nm över tiden, vilket möjliggör bestämning av reaktionshastigheten.
Spektrofotometrisk bestämning av förgreningsenzymaktivitet är beroende av mätningen av glukosen som frigörs genom enzymets verkan på fosforylasgränsen dextrin16. Denna förening tillverkas genom att behandla glykogen uttömmande med glykogenfosforylas. Eftersom glykogenfosforylasverkan stoppar 4 glukosrester bort från en α1,6-grenpunkt, innehåller gränsdextrin glykogen, vars yttre kedjor har förkortats till ~ 4 glukosrester. Beredning av fosforylasgräns dextrin beskrivs här med hjälp av ett förfarande härrörande från de som utvecklats av Taylor et al.17 och Makino & Omichi18.
Debranching är en tvåstegsprocess. 4-α-glukanotransferasaktiviteten hos det bifunktionella förgreningsenzymet överför först tre glukosrester från grenpunkten till den icke-reducerande änden av en närliggande α1,4-bunden glukoskedja. Den enda, α1,6-bundna glukosrest som finns kvar vid grenpunkten hydrolyseras sedan av α1,6-glukosidasaktiviteten19. Analysen utförs vanligtvis på ett stoppat sätt, glukosen som frigörs efter en given tid (eller serie gånger) mäts i en kopplad enzymanalys som visas nedan:
(Glukos) n → (glukos)n-1 + glukos 
Glukos + ATP → glukos-6-fosfat + ADP
Glukos-6-fosfat + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H+
Bestämningen av NADPH som produceras ger ett mått på glukosproduktion. Förfarandet som beskrivs i avsnitt 3 i protokollet nedan är baserat på ett som beskrivs av Nelson et al.16. Liksom de andra metoderna som förlitar sig på konsumtion eller generering av NADH / NADPH är analysen ganska känslig. Närvaron av amylaser eller andra glukosidaser, som också kan frigöra fri glukos från fosforylasgräns dextrin, kommer emellertid att orsaka betydande störningar (se Diskussion).
Den kolorimetriska bestämningen av förgreningsenzymaktivitet bygger på det faktum att a1,4-bundna kedjor av glukos antar spiralformade strukturer som binder till jod och bildar färgade komplex20. Färgen på det bildade komplexet beror på längden på de α1,4-länkade kedjorna. Således bildar amylos, som består av långa, till stor del oförgrenade kedjor av α1,4-bunden glukos, ett djupblått komplex med jod. Däremot bildar glykogener, vars yttre kedjor i allmänhet är i storleksordningen 6 till 8 glukosrester långa, orange-röda komplex. Om en lösning av amylos inkuberas med förgreningsenzym, resulterar införandet av grenar i amylosen i genereringen av kortare α1,4-bundna glukoskedjor. Således skiftar absorptionsmaximumet för amylos/ jodkomplexen mot kortare våglängder. Förfarandet som diskuteras här härrör från det som beskrivs av Boyer & Preiss21 och förgreningsenzymaktiviteten kvantifieras som en minskning av absorptionen av amylos/ jodkomplexet vid 660 nm över tiden.
Som det tydligt framgår av diskussionen ovan innebär det faktum att färgerna på de komplex som bildas mellan jod- och α1,4-glukoskedjor varierar med kedjelängden att absorbansspektra för glykogen/ jodkomplex bör variera med graden av glykogenförgrening. Detta är verkligen fallet, och mindre grenade glykogener / glykogener med längre yttre kedjor absorberar ljus vid en längre våglängd än glykogener som är mer grenade / har kortare yttre kedjor. Jodfärgningsreaktionen kan därför användas för att få snabba, kvalitativa data om graden av glykogenförgrening22. Den orangebruna färgen bildas när glykogenkomplex med jod inte är särskilt intensiva. Färgutvecklingen kan emellertid förbättras genom införandet av mättad kalciumkloridlösning22. Detta ökar metodens känslighet cirka 10 gånger och möjliggör klar analys av mikrogrammängder glykogen. Analysen för bestämning av förgrening som beskrivs i avsnitt 4 i protokollet nedan är anpassad från ett förfarande som utvecklats av Krisman22. Det utförs helt enkelt genom att kombinera glykogenprovet med jodlösning och kalciumklorid i en kyvett och samla absorptionsspektrumet från 330 nm till 800 nm. Absorbansens maximala skiftar mot längre våglängder när graden av förgrening minskar.
Sammantaget ger de metoder som beskrivs här enkla, tillförlitliga medel för att bedöma aktiviteterna hos de viktigaste enzymerna i glykogenmetabolismen och för att erhålla kvalitativa data om omfattningen av glykogenförgrening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

Glykogen syntetiseras som en lagringsform av glukos av ett brett spektrum av organismer, allt från bakterier till djur. Molekylen består av linjära kedjor av α1,4-bundna glukosrester med grenar införda genom tillsats av α1,6-bindningar. Att förstå hur syntesen och nedbrytningen av glykogen regleras och hur glykogen uppnår sin karakteristiska grenade struktur kräver studier av enzymerna för glykogenlagring. De metoder som oftast används för att studera dessa enzymaktiviteter använder emellertid vanligtvis reagenser eller tekniker som inte är tillgängliga för alla utredare. Här diskuterar vi ett batteri av procedurer som är tekniskt enkla, kostnadseffektiva och ändå kan ge värdefull inblick i kontrollen av glykogenlagring. Teknikerna kräver tillgång till en spektrofotometer, som arbetar i intervallet 330 till 800 nm, och beskrivs förutsatt att användarna kommer att använda engångsplastkuvetter. Procedurerna är dock lätt skalbara och kan modifieras för användning i en mikroplattläsare, vilket möjliggör mycket parallell analys.

Bestämning av glykogensyntasaktivitet Figur 1 visar representativa resultat från glykogensyntasanalyser med renade enzymer. I panel A, efter en liten fördröjning, var det en linjär minskning av absorptionen vid 340 nm över tiden under en period av cirka 12 minuter. Förändringshastigheten i absorptionen i figur 1A var ~0,12 absorbansenheter/min. En förändringshastighet i absorbans mellan ~0,010 och ~0,20 absorbansenheter/min är opti...

Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Tekniker för att mäta aktiviteten hos viktiga enzymer i glykogenmetabolismen presenteras med hjälp av en enkel spektrofotometer som arbetar i det synliga området.

Spektrofotometriska metoder för studier av eukaryot glykogenmetabolism

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

Protokollen är betydelsefulla, eftersom de undviker användning av radioaktiva isotoper och tar bort en barriär som kan hindra många arbetare från att studera enzymer av glykogenmetabolism. De beskrivna förfarandena är billiga och kräver endast tillgång till en enkel spektrofotometer. För att börja med bestämningen av glykogensyntasaktiviteten, tina de tidigare beredda stamlösningarna av UDP-glukos, ATP, fosfoenolpyruvat och NDP-kinas på is.Förvärm ett vattenbad till 30 grader celsius. När stamlösningarna är klara, förbered tillräcklig analysblandning i enlighet med antalet glykogensyntasanalyser genom att tillsätta reagenserna till ett 15 ml-rör, enligt beskrivningen i textprotokollet. Förbered en blank reaktion genom att ersätta NADH från reaktionsblandningen med vattnet och överför reaktionen till en engångsmetakrylatkyvett.Använd den tomma reaktionen för att ställa in noll på spektrofotometern vid våglängden 340 nanometer. Ta en alikvot på 770 mikroliter av reaktionsblandningen i ett 1,5 ml rör och tillsätt sekventiellt två mikroliter vardera av NDP-kinas och pyruvatkinaslaktatdehydrogenasblandning till röret. Efter blandning, inkubera försiktigt röret vid 30 grader celsius i vattenbadet i tre minuter för att förvärma reaktionsblandningen.Tillsätt sedan 30 mikroliter av provet innehållande glykogensyntas i 20 millimolar Tris-buffert vid pH 7,8 och blanda försiktigt innan reaktionsblandningen överförs till en bortskaffande metakrylatkuvett. Placera kyvetten i spektrofotometern och registrera absorbansen vid 340 nanometer med tidsbestämda intervall i 10 till 20 minuter. Plotta sedan de erhållna absorbanserna mot tiden.För att mäta den frigjorda glukosen, överför 40 mikroliter av supernatanten från de uppvärmda glykogenproverna till engångsmetakrylatkuvetterna. Och tillsätt de uppmätta volymerna trietanolamin, hydrokloridmagnesiumsulfatbuffert, NADP ATP-blandning och vatten enligt beskrivningen i manuskriptet. Blanda blandningen genom att pipettera upp och ner försiktigt utan att skapa luftbubblor.Tillsätt 0,5 mikroliter glukos-6-fosfatdehydrogenas till varje kyvett. Efter blandning genom pipettering, inkubera blandningen vid rumstemperatur i 10 minuter och registrera sedan absorbansen vid 340 nanometer. Blanda sedan 0,5 mikroliter hexokinas till varje kyvett som beskrivits tidigare och inkubera i 15 minuter innan du registrerar den absorberande uppsättningen 340 nanometer.Fortsätt sedan inkubationen vid rumstemperatur i fem minuter, följt av registrering av absorbansen. Om absorptionen har ökat från den som registrerades vid 15 minuter, fortsätt inkubationen i fem minuter innan du registrerar den slutliga absorptionen vid 340 nanometer. För att bestämma glykogenförgreningen, kombinera 650 mikroliter jodkalciumkloridfärgreagensbuljong med 100 mikroliter vatten i ett 1,5 ml rör och blanda lösningen noggrant innan den överförs till en engångsmetakrylatkuvett.Placera kyvetten i spektrofotometern för att genomföra en körning i ett våglängdsskanningsläge för att samla bakgrundsspektrumet från 330 till 800 nanometer. I ett separat 1,5 ml rör kombineras 650 mikroliter av det arbetande jodkalciumkloridfärgreagenset med 50 mikrogram ostronglykogen och fyll den slutliga volymen till 750 mikroliter med vatten. Efter blandning av blandningen noggrant, överför lösningen till en engångsmetakrylatkyvett för att samla ett absorptionsspektrum från 330 till 800 nanometer.På liknande sätt erhålla ett absorptionsspektrum med 50 mikrogram amylopektin och 30 mikrogram amylos som beskrivits tidigare. För att få en indikation på den grenade strukturen hos ett okarakteriserat glykogenprov, kombinera 25 till 50 mikrogram glykogen med 650 mikroliter av det arbetande jodkalciumkloridfärgreagenset och fortsätt som förklarats tidigare för att förvärva absorptionsspektrumet. I glykogensyntasanalyserna observerades en linjär minskning av absorptionen vid 340 nanometer över tiden.Att tillsätta för mycket glykogensyntas till analysen fick reaktionen att slutföras inom de första två minuterna. Kontrollreaktionen, som inte innehöll glykogensyntas, visar ingen mätbar minskning av absorbansen. Data från en glykogenfosforylasanalys med användning av ett renat enzym hade en linjär fas som varade i tre minuter.En absorbansökning på cirka 0,01 till 0,04 enheter per minut är optimal. I glykogenavförgreningsenzymanalysen visade reaktionen en linjär fas som kvarstod i minst 10 minuter. De representativa data från glykogenförgreningsenzymanalyserna visade skillnaden i absorbansen mellan kontrollproverna som saknade förgreningsenzym och reaktionerna som innehöll förgreningsenzym.Analysens smala dynamiska omfång illustreras. Den maximala förändringen i absorbansen som kan produceras är 0,4 absorbansenheter och linjäriteten går förlorad när förändringen i absorptionen är ungefär 0,2 absorbansenheter. Massorna av glykogen, amylopektin och amylos som användes vid glykogenförgreningsbedömningen visade en maximal absorbansavläsning på cirka 0,7 till 0,8, var och en vid olika absorbansmaxima.Glykogenprovet producerade två toppar på cirka 400 nanometer och 460 nanometer. Jodkalciumkloridfärgreagenset är mycket tätt. Det är viktigt att se till att glykogenproverna är helt blandade med reagenset innan man samlar in ett absorptionsspektrum.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Anatomy and Physiology

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

En metod för att mäta Metabolism i Sorterade subpopulationer av komplexa cell gemenskapernas Använda stabila isotopen Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinitetsrening av proteinkomplex från eukaryota celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestämning av glykogeninnehållet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestämning av Phycobiliprotein innehåll i Cyanobakterien Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enda Liposom mätningar för studien av Proton-pumpning membran enzymer med elektrokemi och fluorescerande mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttryck, lösbarhet och rening av eukaryota Borat transportörer

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie om metabolismen av sex systemiska insekticider i en nyetablerad cell SUS pension kultur härledd från Tea (Camellia sinensis L.) Lämnar

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindande enheter (SUBEs) som verktyg för berikning, isolering, identifiering och karakterisering av SUMO Proteome i lever cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

En integrerad Raman spektroskopi och masspektrometri plattform för att studera Single-cell drog upptag, metabolism, och effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...