Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Yazar, görüşleri ve birçok yararlı tartışmaları için Karoline Dittmer ve Andrew Brittingham'a teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Iowa Osteopatik Eğitim ve Araştırma Fonu'ndan (IOER 03-17-05 ve 03-20-04) gelen hibelerle desteklenmiştir.

1. Glikojen sentaz aktivitesinin tayini
<ol><li>Gerekli reaktiflerin stok çözeltilerini Tablo 1'de belirtildiği gibi hazırlayın (deney gününden önce).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parça</td>
			<td colspan="2">Yol Tarifleri</td>
		</tr><tr><td>50 mM Tris pH 8,0</td>
			<td colspan="2">0.61 g Tris bazını ~ 80 mL suda çözün.  4 °C'ye kadar soğutun.   HCl ile pH'ı 8,0'...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism.">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li><li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase,+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose.">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li><li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1,6-glucosidase.">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li><li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose.">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li><li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis.">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li><li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases.">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li><li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues.">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li><li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates.">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li><li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,+6-diphosphatase,+phosphofructokinase,+glycogen+synthetase,+phosphorylase,+and+protein+kinase+from+swine+kidney.">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li><li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis.">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).</li><li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li><li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification,+properties+and+physiological+role.">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li><li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain:+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain.">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li><li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Enzymes Vol. 5. , 191-234 (1971).</li><li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+of+amylose+and+iodine.">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li><li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1,4,-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltansferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li><li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases.">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li><li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis:+An+unusual+member+of+the+starch/glycogen+synthase+family.">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-1,4-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver.">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li><li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

Genel olarak, sunulan tüm yöntemlerin temel avantajları, düşük maliyetleri, kolaylıkları, hızları ve özel ekipmanlara güvenmemeleridir. Hepsinin paylaştığı en büyük dezavantaj, mevcut diğer yöntemlere kıyasla hassasiyettir. NADH / NADPH üretimini veya tüketimini içeren prosedürlerin hassasiyetini tahmin etmek kolaydır. NADH / NADPH'nin yok olma katsayısının 6.22 M-1 cm-1 olduğu göz önüne alındığında, basit aritmetik konsantrasyondaki ~ 10-20 μM değişikliklerin...

Glikojen doğada yaygın olarak dağılmıştır, bileşik bakterilerde, birçok protistte, mantarda ve hayvanda bulunur. Mikroorganizmalarda, besinler sınırlandığında glikojen hücre sağkalımı için önemlidir ve memeliler gibi daha yüksek organizmalarda, glikojen sentezi ve bozulması kan şekeri seviyelerini tamponlamaya hizmet eder 1,2,3. Bu nedenle, glikojen metabolizmasının incelenmesi, mikrobiyoloji ve memeli fizyolojisi gibi çeşitli alanlar için önemlidir. Glikojen metabolizmasını anlamak, glikojen sentezinin (glikojen sentaz ve dallanma enzimi) ve glikojen yıkımının (glikojen fosforilaz ve dallanma enzimi) anahtar enzimlerinin incelenmesini gerektirir. Glikojen sentaz, fosforilaz, dallanma ve dallanma enzim aktivitelerinin altın standart tahlilleri radyoaktif izotoplar kullanır. Örneğin, glikojen sentaz genellikle durdurulmuş bir radyokimyasal tahlilde, glikozun UDP-[14 C] glikozdan (hayvan ve mantar enzimleri durumunda) veya ADP-[14C] glikozdan (bakteriyel enzimler durumunda) glikojen 4,5'e dahil edilmesini takiben ölçülür. Benzer şekilde, glikojen fosforilaz, glikozun [14C] glikoz-1-fosfattan glikojen6'ya dahil edilmesini takiben, glikojen sentezi yönünde ölçülür. Dallanma enzimi, bu enzimin [14 C] glikozun glukoz-1-fosfattan α1,4bağlantılı zincirlere glikojen fosforilaz7 ile dahil edilmesini uyarma kabiliyeti ölçülerek test edilir ve debranching enzim aktivitesi, enzimin [14C] glikozu glikojen8'e dahil etme kabiliyeti izlenerek belirlenir. . Çok hassas olmakla birlikte, düşük enzim aktivitesi seviyelerine sahip ham hücre ekstraktlarında kullanımlarına izin verirken, radyoaktif substratlar pahalıdır ve radyoizotop kullanımına eşlik eden düzenleyici gerekliliklere tabidir. Bu engeller, bazı tahlillerin kullanımını birçok işçinin erişemeyeceği bir yere yerleştirmektedir. Bununla birlikte, uzun yıllar boyunca, bu enzimlerin ölçümüne yönelik etkileyici çeşitlilikte spektrofotometrik yaklaşımlar tanımlanmıştır. Genel olarak, bu yaklaşımlar nihayetinde NADH / NADPH'nin üretimini veya tüketimini veya glikojen ve iyot arasındaki renkli komplekslerin oluşumunu ölçmeye dayanır. Bu nedenle, basittirler ve sadece tungsten veya xenon flaş lambaları ile donatılmış basit spektrofotometreler kullanılarak gerçekleştirilebilirler.
Glikojen sentazın spektrofotometrik testleri, büyüyen glikojen zincirine glikoz eklendikçe şeker nükleotid donöründen salınan nükleozid difosfatın ölçülmesine dayanır 9,10. Aşağıdaki protokolün 1. bölümünde açıklanan glikojen sentaz aktivitesini ölçme prosedürü, Wayllace ve ark.11 tarafından özetlenenlerin bir modifikasyonudur ve bağlantı şeması aşağıda gösterilmiştir:
(Glikoz) n + UPD-glukoz → (Glikoz)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + fosfoenolpiruvat → piruvat + ATP
Piruvat + NADH + H + → Laktat + NAD +
Glikojen sentaz, UDP-glikozdan glikozu glikojene ekler. Bu işlemde üretilen UDP, ADP üreten bir reaksiyonda nükleozid difosfat kinaz (NDP kinaz) tarafından UTP'ye dönüştürülür. ADP, sırayla, daha sonra, bir fosfat donörü olarak fosfoenolpiruvat kullanarak ADP'yi fosforile eden piruvat kinaz için bir substrat görevi görür. Elde edilen piruvat, NADH tüketen bir reaksiyonda laktat dehidrogenaz enzimi tarafından laktata dönüştürülür. Bu nedenle tahlil, NADH tüketildikçe 340 nm'de absorbanstaki azalmayı izleyerek sürekli bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bir glikoz donörü olarak ADP-glikoz gerektiren enzimlerle kullanım için kolayca uyarlanmıştır. Burada, glikojen sentazın etkisiyle salınan ADP, doğrudan piruvat kinaz tarafından etki edildiğinden, bağlantı adımları daha basittir.
Glikojen fosforilaz aktivitesinin belirlenmesi için çeşitli spektrofotometrik testler mevcuttur. Klasik versiyonda, enzim aşağıda gösterildiği gibi glikojen sentezi yönünde geriye doğru sürülür:
(Glikoz) n + Glikoz-1-fosfat → (Glikoz)n + 1 + Pi
Zamanlanmış aralıklarda, reaksiyon karışımının alikotları çıkarılır ve serbest bırakılan fosfat miktarı12,13 olarak ölçülür. Ellerimizde, bu tahlil, fosforilaz etkisi için gerekli olan yüksek konsantrasyonlarda glikoz-1-fosfat ile birlikte, glikoz-1-fosfatın birçok ticari preparatında kolayca ölçülebilir serbest fosfatın varlığı nedeniyle sınırlı bir kullanım alanına sahiptir. Daha ziyade, glikojen fosforilaz13 tarafından parçalanırken salınan glikoz-1-fosfatı ölçen alternatif bir testi rutin olarak kullandık. Aşağıda gösterilen birleştirilmiş bir reaksiyon şeması kullanılır.
(Glikoz) n + Pi → (Glikoz)n-1 + Glikoz-1-fosfat
Glikoz-1-fosfat → Glikoz-6-fosfat
Glukoz-6-fosfat + NADP + → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H +
Glikoz-1-fosfat, fosfoglukomutaz tarafından glikoz-6-fosfata dönüştürülür ve glikoz-6-fosfat daha sonra NADP + 'nın NADPH'ye eşzamanlı indirgenmesi ile 6-fosfoglukonolakton'a oksitlenir. Aşağıdaki protokolün 2. bölümünde ayrıntılı olarak açıklanan prosedür, Mendicino ve ark.14 ve Schreiber & Bowling15 tarafından açıklanan yöntemlerden türetilmiştir. Tahlil, zaman içinde 340 nm'de absorbanstaki artışla sürekli bir şekilde kolayca gerçekleştirilebilir ve reaksiyon hızının belirlenmesine izin verir.
Dallanma enzimi aktivitesinin spektrofotometrik tayini, enzimin fosforilaz limitli dekstrin16 üzerindeki etkisiyle salınan glikozun ölçümüne dayanır. Bu bileşik, glikojen fosforilaz ile kapsamlı bir şekilde glikojen muamelesi yapılarak yapılır. Glikojen fosforilaz etkisi, 4 glikoz kalıntısını α1,6 dallı bir noktadan uzakta durdurduğundan, sınır dekstrin, dış zincirleri ~ 4 glikoz kalıntısına kısaltılmış glikojeni içerir. Fosforilaz limit dekstrinin hazırlanması, Taylor ve ark.17 ve Makino & Omichi18 tarafından geliştirilenlerden türetilen bir prosedür kullanılarak burada açıklanmaktadır.
Dallanma iki adımlı bir işlemdir. İki fonksiyonlu dallanma enziminin 4-α-glukanotransferaz aktivitesi ilk önce üç glikoz kalıntısını dal noktasından yakındaki α1,4 bağlı glikoz zincirinin indirgemesiz ucuna aktarır. Dallanma noktasında kalan tek, α1,6 bağlantılı glikoz kalıntısı daha sonra α1,6-glukozidaz aktivitesi19 tarafından hidrolize edilir. Tahlil tipik olarak durdurulmuş bir şekilde gerçekleştirilir, belirli bir süreden sonra salınan glikoz (veya bir dizi kez) aşağıda gösterildiği gibi birleştirilmiş bir enzim tahlilinde ölçülür:
(Glikoz) n → (Glikoz)n-1 + Glikoz 
Glikoz + ATP → Glikoz-6-fosfat + ADP
Glukoz-6-fosfat + NADP + → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H +
Üretilen NADPH'nin belirlenmesi, glikoz üretiminin bir ölçüsünü verir. Aşağıdaki protokolün 3. bölümünde özetlenen prosedür, Nelson ve ark.16 tarafından açıklanan prosedüre dayanmaktadır. NADH / NADPH'nin tüketimine veya üretilmesine dayanan diğer yöntemler gibi, tahlil de oldukça hassastır. Bununla birlikte, fosforilaz limit dekstrinden serbest glikozu da serbest bırakabilen amilazların veya diğer glukozidazların varlığı, önemli bir girişime neden olacaktır (bkz.
Dallanan enzim aktivitesinin kolorimetrik tayini, α1,4 bağlı glikoz zincirlerinin, iyota bağlanan ve renkli kompleksler oluşturan sarmal yapıları benimsemesine dayanır20. Oluşan kompleksin rengi, α1,4 bağlantılı zincirlerin uzunluğuna bağlıdır. Böylece, uzun, büyük ölçüde dallanmamış α1,4 bağlı glikoz zincirlerinden oluşan amiloz, iyot ile derin mavi bir kompleks oluşturur. Buna karşılık, dış zincirleri genellikle sadece 6 ila 8 glikoz kalıntısı uzunluğunda olan glikojen maddeler turuncu-kırmızı kompleksler oluşturur. Bir amiloz çözeltisi dallanma enzimi ile inkübe edilirse, dalların amiloza sokulması, daha kısa α1,4 bağlı glikoz zincirlerinin üretilmesiyle sonuçlanır. Böylece, amiloz / iyot komplekslerinin emilim maksimumu daha kısa dalga boylarına doğru kayar. Burada tartışılan prosedür, Boyer & Preiss21 tarafından detaylandırılan prosedürden türetilmiştir ve dallanma enzim aktivitesi, zamanla 660 nm'de amiloz / iyot kompleksinin emiliminde bir azalma olarak ölçülür.
Yukarıdaki tartışmadan kolayca anlaşılacağı gibi, iyot ve α1,4-glikoz zincirleri arasında oluşan komplekslerin renklerinin zincir uzunluğuna göre değişmesi, glikojen / iyot komplekslerinin absorbans spektrumlarının glikojen dallanma derecesine göre değişmesi gerektiği anlamına gelir. Bu gerçekten de böyledir ve daha uzun dış zincirlere sahip daha az dallanmış glikojen / glikojen maddeler, daha dallanmış / daha kısa dış zincirlere sahip glikojenlerden daha uzun bir dalga boyunda ışığı emer. Bu nedenle iyot boyama reaksiyonu, glikojen dallanma derecesi22 hakkında hızlı, kalitatif veriler elde etmek için kullanılabilir. Turuncu-kahverengi renk, iyotlu glikojen kompleksleri özellikle yoğun olmadığında oluşur. Bununla birlikte, doymuş kalsiyum klorür çözeltisi22'nin dahil edilmesiyle renk gelişimi arttırılabilir. Bu, yöntemin duyarlılığını yaklaşık 10 kat artırır ve mikrogram glikojenin hazır analizine izin verir. Aşağıdaki protokolün 4. bölümünde açıklanan dallanmanın belirlenmesi için tahlil, Krisman22 tarafından geliştirilen bir prosedürden uyarlanmıştır. Glikojen numunesinin bir küvette iyot çözeltisi ve kalsiyum klorür ile birleştirilmesi ve absorpsiyon spektrumunun 330 nm ila 800 nm arasında toplanmasıyla gerçekleştirilir. Absorbans maksimumu, dallanma derecesi azaldıkça daha uzun dalga boylarına doğru kayar.
Toplu olarak, burada açıklanan yöntemler, glikojen metabolizmasının anahtar enzimlerinin aktivitelerini değerlendirmek ve glikojen dallanmasının derecesi hakkında nitel veriler elde etmek için basit, güvenilir araçlar sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

Glikojen glikozun bir depolama formu olarak, bakterilerden hayvanlara kadar çok çeşitli organizmalar tarafından sentezlenir. Molekül, α1,4 bağlantılı glikoz kalıntılarının doğrusal zincirlerini ve α1,6 bağlantılarının eklenmesiyle ortaya çıkan dalları içerir. Glikojen sentezinin ve bozunmasının nasıl düzenlendiğini ve glikojen karakteristik dallanmış yapısına nasıl ulaştığını anlamak, glikojen depolama enzimlerinin incelenmesini gerektirir. Bununla birlikte, bu enzim aktivitelerini incelemek için en yaygın olarak kullanılan yöntemler tipik olarak tüm araştırmacılar için mevcut olmayan reaktifleri veya teknikleri kullanır. Burada, teknik olarak basit, uygun maliyetli ve yine de glikojen depolamanın kontrolü hakkında değerli bilgiler sağlayabilen bir dizi prosedürü tartışıyoruz. Teknikler, 330 ila 800 nm aralığında çalışan bir spektrofotometreye erişim gerektirir ve kullanıcıların tek kullanımlık, plastik küvetler kullanacağı varsayılarak açıklanmaktadır. Bununla birlikte, prosedürler kolayca ölçeklenebilir ve bir mikroplaka okuyucuda kullanılmak üzere değiştirilebilir, bu da oldukça paralel analizlere izin verir.

Glikojen sentaz aktivitesinin tayini Şekil 1 , saflaştırılmış enzimler kullanılarak yapılan glikojen sentaz testlerinden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Panel A'da, hafif bir gecikmenin ardından, yaklaşık 12 dakikalık bir süre boyunca zaman içinde 340 nm'de emilimde doğrusal bir azalma oldu. Şekil 1A'daki absorpsiyondaki değişim oranı ~ 0.12 absorbans birimi / dak idi. ~0.010 ila ~0.20 absorbans birimi / da...

Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glikojen metabolizmasının anahtar enzimlerinin aktivitesini ölçmek için teknikler, görünür aralıkta çalışan basit bir spektrofotometre kullanılarak sunulmaktadır.

Ökaryotik Glikojen Metabolizmasının İncelenmesi için Spektrofotometrik Yöntemler

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

Protokoller önemlidir, çünkü radyoaktif izotopların kullanımından kaçınırlar ve birçok işçinin glikojen metabolizmasının enzimlerini incelemesini engelleyebilecek bir engeli ortadan kaldırırlar. Açıklanan prosedürler ucuzdur ve sadece basit bir spektrofotometreye erişim gerektirir. Glikojen sentaz aktivitesinin belirlenmesiyle başlamak için, önceden hazırlanmış UDP glikoz, ATP, fosfoenolpiruvat ve NDP kinaz stok çözeltilerini buz üzerinde çözün.Bir su banyosunu önceden 30 santigrat dereceye ısıtın. Stok çözeltileri hazır olduğunda, metin protokolünde açıklandığı gibi, reaktifleri 15 mililitrelik bir tüpe ekleyerek glikojen sentaz tahlillerinin sayısına göre yeterli tahlil karışımı hazırlayın. NADH'yi reaksiyon karışımından su ile değiştirerek boş bir reaksiyon hazırlayın ve reaksiyonu tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın.Spektrofotometrede 340 nanometre dalga boyunda sıfır ayarlamak için boş reaksiyonu kullanın. 1.5 mililitrelik bir tüpte reaksiyon karışımının 770 mikrolitrelik bir alikotunu alın ve sırayla tüpe NDP kinaz ve piruvat kinaz laktat dehidrogenaz karışımının her birine iki mikrolitre ekleyin. Karıştırdıktan sonra, reaksiyon karışımını önceden ısıtmak için tüpü su banyosunda 30 santigrat derecede yavaşça inkübe edin.Daha sonra, pH 7.8'de 20 milimolar Tris tamponuna glikojen sentaz içeren numunenin 30 mikrolitresini ekleyin ve reaksiyon karışımını bir bertaraf metakrilat küvete aktarmadan önce hafifçe karıştırın. Küveti spektrofotometreye yerleştirin ve absorbansı 10 ila 20 dakika boyunca zamanlanmış aralıklarla 340 nanometrede kaydedin. Ardından, zamana karşı elde edilen absorbansları çizin.Salınan glikozu ölçmek için, süpernatantın 40 mikrolitresini ısıtılmış glikojen numunelerinden tek kullanımlık metakrilat küvetlere aktarın. Ve makalede açıklandığı gibi ölçülen trietanolamin, hidroklorür magnezyum sülfat tamponu, NADP ATP karışımı ve su hacimlerini ekleyin. Hava kabarcıkları oluşturmadan karışımı hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.Her küvete 0.5 mikrolitre glikoz-6-fosfat dehidrogenaz ekleyin. Pipetleme ile karıştırdıktan sonra, karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve ardından emilimi 340 nanometrede kaydedin. Daha sonra, daha önce açıklandığı gibi her küvete 0.5 mikrolitre hekzokinaz karıştırın ve emici seti 340 nanometreye kaydetmeden önce 15 dakika inkübe edin.Daha sonra inkübasyona oda sıcaklığında beş dakika devam edin, ardından absorbansı kaydedin. Emilim 15 dakikada kaydedilenden artmışsa, son absorpsiyonu 340 nanometrede kaydetmeden önce beş dakika boyunca inkübasyona devam edin. Glikojen dallanmasını belirlemek için, 650 mikrolitre iyot kalsiyum klorür renk reaktifi stoğunu 1,5 mililitrelik bir tüpte 100 mikrolitre su ile birleştirin ve tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarmadan önce çözeltiyi iyice karıştırın.Arka plan spektrumunu 330 ila 800 nanometre arasında toplamak için dalga boyu tarama modunda bir çalışma yapmak için küveti spektrofotometreye yerleştirin. Ayrı bir 1.5 mililitrelik tüpte, 650 mikrolitre çalışan iyot kalsiyum klorür renk reaktifini 50 mikrogram istiridye glikojeni ile birleştirin ve su ile 750 mikrolitreye kadar son hacmi oluşturun. Karışımı iyice karıştırdıktan sonra, 330 ila 800 nanometre arasında bir absorpsiyon spektrumu toplamak için çözeltiyi tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın.Benzer şekilde, daha önce tarif edildiği gibi 50 mikrogram amilopektin ve 30 mikrogram amiloz içeren bir absorpsiyon spektrumu elde edin. Karakterize edilmemiş bir glikojen numunesinin dallanmış yapısının bir göstergesini elde etmek için, glikojen 25 ila 50 mikrogramını, çalışan iyot kalsiyum klorür renk reaktifinin 650 mikrolitresi ile birleştirin ve absorpsiyon spektrumunu elde etmek için daha önce açıklandığı gibi devam edin. Glikojen sentaz tahlillerinde, zamanla 340 nanometrede emilimde doğrusal bir azalma gözlenmiştir.Tahlil işlemine çok fazla glikojen sentaz eklenmesi, reaksiyonun ilk iki dakika içinde tamamlanmasına neden oldu. Glikojen sentaz içermeyen kontrol reaksiyonu, absorbansta ölçülebilir bir azalma göstermez. Saflaştırılmış bir enzim kullanan bir glikojen fosforilaz testinden elde edilen veriler, üç dakika süren doğrusal bir faza sahipti.Dakikada yaklaşık 0,01 ila 0,04 birim absorbans artışı en uygunudur. Glikojen dallanma enzim testinde, reaksiyon en az 10 dakika boyunca devam eden doğrusal bir faz gösterdi. Glikojen dallanma enzimi tahlillerinden elde edilen temsili veriler, dallanma enzimi olmayan kontrol örnekleri ile dallanma enzimi içeren reaksiyonlar arasındaki absorbanstaki farkı göstermiştir.Tahlilin dar dinamik aralığı gösterilmiştir. Üretilebilecek absorbanstaki maksimum değişim 0.4 absorbans birimidir ve absorpsiyondaki değişim yaklaşık 0.2 absorbans birimi olduğunda doğrusallık kaybolur. Glikojen dallanma değerlendirmesinde kullanılan glikojen, amilopektin ve amiloz kütleleri, her biri farklı absorbans maksimumunda yaklaşık 0.7 ila 0.8 arasında maksimum absorbans okuması göstermiştir.Glikojen örneği, yaklaşık 400 nanometre ve 460 nanometrede iki tepe noktası üretti. İyot kalsiyum klorür renk reaktifi çok yoğundur. Bir absorpsiyon spektrumu toplamadan önce glikojen numunelerinin reaktif ile tamamen karıştırıldığından emin olmak önemlidir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Anatomy and Physiology

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Cyanobacterium Synechocystis Phycobiliprotein içeriğinde spektrofotometrik tayini

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Çay (Camellia sinensis L.) türetilmiştir yeni kurulan hücre süspansiyon kültürü altı sistemik Böcek Ilacı metabolizması üzerinde çalışma Yaprak -ları

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Karaciğer Kanserinde SUMO Proteomunun Zenginleştirilmesi, İzolasyon, Tanımlama ve Karakterizasyonu Için Araçlar Olarak SUMO Bağlayıcı Varlıklar (SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...