Name: cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis
Uploaded: 2021-10-07T15:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis at JoVE.com

نود أن نشكر بصدق ماتياس مان على السماح لنا بإجراء أجزاء كبيرة من التجارب في مختبره ، وفابيان كوسكيا للمساعدة في تحليل LCM والبروتيوم ، وتاتيانا سيمون إيبرت على تشريح كامل الجبل ، و Korbinian Mayr و Igor Paron على مساعدتهم التقنية. نحن نقدر بامتنان التمويل المقدم من مجلس الأبحاث الألماني إلى MG (SFB870 ، TFR274) ، والاتحاد الأوروبي (Eranet S-700982-5008-001) ، و ERC (aERC "NeuroCentro" إلى MG) ، والجمعية السويدية للبحوث الطبية (SSMF ، إلى JK) منحة ما بعد الدكتوراه ، ومؤسسات وصناديق KI (2020-01351 ، إلى JK).

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الألمانية والاتحاد الأوروبي وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية وحكومة بافاريا العليا (Regierung von Oberbayern). تم استخدام ذكور الفئران C57Bl6 فقط الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع في التجارب.
1. إعداد دماغ الفأر (~ 15 دقيقة لكل فأر)
<ol><li>قم بإعداد وسط التشريح بإضافة 5 مل من 1 M HEPES (التركيز النهائي 10 mM) إلى 500 مل من محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS). ملاحظة: يجب ألا يتجاوز وقت تخزين وسط التشريح (+4 درجة مئوية) 2 أسابيع.</li>
	<li>التضحية بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم وتشريح الدماغ بعناية. ملاحظة: عند التحقيق في ECM ، يفضل أن يكون النسيج غير معدل. يحافظ خلع عنق الرحم على وقت التشريح قصيرا قدر الإمكان ، وبالتالي يمنع الهضم الذاتي الأنزيمي بعد الموت قدر الإمكان. إذا كانت إزالة الدم أمرا بالغ الأهمية لسؤال البحث ، فما عليك سوى فحص الفأر عبر القلب مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) قبل إزالة الدماغ.</li>
	<li>استخراج الدماغ عن طريق التشريح اليدوي ووضعه في طبق استزراع يحتوي على وسط تشريح بارد (الشكل 1B - 1). ملاحظة: حافظ على الأدمغة في وسط التشريح على الجليد طوال عملية التشريح.</li>
	<li>قم بإزالة المصباح الشمي (OB) باستخدام مشرط (الشكل 1B - 2) عن طريق قطع إكليلي مستقيم بين OB والقطب الأمامي للقشرة.</li>
	<li>قم بإزالة القطب الأمامي للقشرة باستخدام المشرط باستخدام قطع إكليلي لجعل البطينين الجانبيين مرئيين في المستوى الإكليلي (الشكل 1B - 3). ملاحظة: تأكد من أن القطع الإكليلي مصنوع ~ 5 مم من الغشاء البصري؛ خلاف ذلك ، سيتم فقدان الجزء العلوي من المنطقة الاقتصادية الخاصة / MEZ.</li>
	<li>باستخدام المقص ، افتح كلا البطينين الجانبيين من الأعلى ، بدءا من قسم سهمي من السطح القشري إلى تجويف البطين ، وقم بإطالة هذا القطع بطريقة على شكل حرف C بعد انثناء البطين (الشكل 1B - 4).</li>
	<li>قم بتوصيل الأطراف الذيلية للشق السهمي الأيسر والأيمن عن طريق قطع إكليلي إضافي بالمقص. ملاحظة: تشكل الجروح الثلاثة الآن شبه منحرف وستسهل إزالة القشرة والجسم الثفني في الخطوة التالية.</li>
	<li>قم بإزالة القشرة والجسم الثفني الذي يغطي البطينين الجانبيين باستخدام الملقط (الشكل 1B - 5). ثم قم بإزالة القشرة والجسم الثفني اللذين يغطيان جدران البطين الإنسي. هنا ، قم بإجراء جروح إضافية إذا كان النسيج متصلا بجدران البطين الإنسي ، أو ببساطة ارفع القشرة والجسم الثفني بالمقص لإزاحة الأنسجة.</li>
	<li>انشر بعناية جدران البطين باستخدام الملقط (الشكل 1B - 6). إزالة الضفيرة المشيمية مع الملقط. ملاحظة: من المهم الإزالة الكاملة للضفيرة المشيمية لتجنب التداخل مع خطوات التشريح التالية وتجنب التلوث المحتمل لعينات المنطقة الاقتصادية الخاصة / MEZ.</li>
	<li>ضع الدماغ على شريحة زجاجية وضع الشريحة الزجاجية فوق الثلج الجاف لتجميد الدماغ. الحفاظ على جدران البطين في التكوين المفتوح. ملاحظة: تأكد من وجود مسافة كافية بين الجدران الجانبية والإنسية للبطين لتسهيل التشريح الدقيق والحصري للمنطقة الاقتصادية الخاصة ومنطقة الشرق الأوسط وأفريقيا. إذا انقبض النسيج مرة أخرى في تكوين مغلق ، فاستخدم الملقط لإصلاح الجدران في الموضع المطلوب أثناء التجميد. تجنب أي ضرر يلحق بالمنطقة الاقتصادية الخاصة / المنطقة الاقتصادية الخاصة. حاول تطبيق الحد الأدنى من القوة، خاصة عند الحافة العليا للبطينين المفتوحين.</li>
</ol>2. تقسيم الدماغ المحضر (~ 15 دقيقة لكل فأر)
<ol><li>قطع 50-100 ميكرومتر من أقسام إكليلية سميكة من الدماغ حتى نهاية البطين الجانبي باستخدام cryostat وتركيب الأقسام على شرائح زجاجية. تأكد من أن الدماغ متصل بلوحة التعلق cryostat في الدماغ الخلفي مع وسط OCT وأنه لا يوجد OCT يتلامس مع الدماغ الأمامي ، وخاصة في البطينين. ملاحظة: سوف يتداخل وسيط OCT مع قياسات التصلب المتعدد. ومع ذلك ، إذا كان سيتم استخدام الأنسجة لفحص الأجسام المضادة ، فمن غير الضروري استبعاد وسط OCT. لا ينصح باستخدام الشرائح الزجاجية المطلية. تطبق الشرائح المطلية الكثير من القوة اللاصقة على الأنسجة ، مما يعوق نقل عينة الأنسجة من الشرائح إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق في الخطوات التالية.</li>
</ol>3. تشريح حر لشرائح الدماغ (~ 30 دقيقة لكل فأر)
<ol><li>ضع الشرائح الزجاجية مع أقسام الدماغ على الجليد الجاف تحت مجهر التشريح (الشكل 1C - 1).</li>
	<li>قم بإعداد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على الثلج الجاف ، وتأكد من بقاء الأنابيب على الثلج الجاف لمدة 1 دقيقة على الأقل لتكون باردة بما فيه الكفاية قبل نقل العينة. ملاحظة: استخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات الجودة العالية، لأن بعض الأنابيب منخفضة الجودة قد تلقي بالبلاستيك في خطوات هضم الأنسجة اللاحقة المرتبطة بقياسات التصلب المتعدد.</li>
	<li>ارفع الشرائح من الثلج الجاف لمدة 15-30 ثانية لتحقيق ذوبان قصير وغير مكتمل لجعل المايلين المضغوط للمخطط قابلا للملاحظة كنقاط بيضاء كثيفة. ملاحظة: يصبح تحديد الحدود بين المنطقة الاقتصادية الخاصة والمخطط ممكنا (الشكل 1C - 2 ، انظر الشكل 2A لاستبعاد المايلين ومقارنة مع طريقة الجبل بأكمله). إذا استغرق الذوبان وقتا طويلا ، فيمكن تسريع العملية عن طريق الضغط على إصبع مغطى بالقفازات على الجانب الآخر من الشريحة الزجاجية. ومع ذلك ، يجب ممارسة هذه المناورة لأن الذوبان المفرط يحدث بسهولة.</li>
	<li>افصل المنطقة الاقتصادية الخاصة بمشرط مبرد مسبقا عن المخطط المجاور (الشكل 1C ، D).</li>
	<li>انقل المنطقة الاقتصادية الخاصة إما كقطعة كاملة أو مقسمة إلى 2-4 أجزاء في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام الحافة الحادة للمشرط المبرد. إذا كان من المقرر استخدام النسيج لنوع آخر من التحليل بخلاف التصلب المتعدد، فانقل عينة الأنسجة إلى الحاوية المناسبة بدلا من ذلك (على سبيل المثال، صفيحة 96 بئرا). ملاحظة: قد يؤدي قطع الأنسجة المجمدة تماما إلى تفكك الأنسجة بسرعة وسقوطها من الشريحة. قطع الأنسجة المذابة تماما يؤدي إلى تفكك الأنسجة. تأكد من أن الأنسجة ليست مجمدة تماما ولا مذابة تماما.</li>
</ol>

يعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة

جعلت طريقة CSD من الممكن استخراج أنسجة المنطقة الاقتصادية الخاصة بدقة وتوليد بروتين موثوق به بعمق كبير باستخدام MS. CSD يعرض ميزة واضحة مقارنة بالتشريح الكامل من حيث تقليل التلوث الخطي لعينات المنطقة الاقتصادية الخاصة بشكل كبير وإثراء البروتين خارج الخلية. نظرا لأنه من الممكن أيضا اكتشاف عدد مماثل من البروتينات في العينات الفردية (~ 6500 بروتين لكل عينة) باستخدام CSD والتشريح الكامل ، فإن الوقت الإضافي ل CSD يستحق الجهد. يوفر LCM تشريحا أكثر دقة للمنطقة الاقتصادية الخاصة ولكنه وصل إلى عمق بروتين أقل ، مع 3500 بروتين فقط لكل عينة على الرغم من استخدام نفس بروتوكول MS مثل CSD (مطابقة المكتبة والقياس الكمي الخالي من الملصقات). الأهم من ذلك ، كان التباين أكبر بكثير ، ربما بسبب وقت التحضير الأطول ثمانية أضعاف لكل عينة. يكشف PCA للعينات التي تم الحصول عليها بواسطة LCM و CSD عن فصل واضح لكلتا الطريقتين مع مجموعات ضيقة خاصة بالمنطقة منفصلة بقوة عن بعضها البعض. وعلى النقيض من ذلك، أظهرت عينات LCM توزيعا أكثر تشتتا، وهو ما يرجع على الأرجح جزئيا إلى طول فترة التحضير. ومن غير الواضح ما إذا كان جمع عينات أكثر بكثير على مدى فترة أطول من شأنه أن يسفر عن بروتين متساو في المتانة والعمق مع LCM. بحساب التقدير ، فإن جمع حجم عينة مماثل كما هو الحال بالنسبة ل CSD سيستغرق 5-8 مرات أطول مع LCM ، وحتى ما يصل إلى 15 مرة أطول إذا تم تضمين العينات المقدمة لمكتبات أطياف الببتيد ، والكثير منها في ظل ظروف مذابة. علاوة على ذلك ، بالنظر إلى الاضطرابات الإضافية للأنسجة اللازمة ل LCM (تلطيخ الخلفية ، تشريح الليزر) ، قدمت LCM القليل من المكاسب ، إن وجدت ، على CSD. وبالتالي ، يمكن اعتبار CSD أكثر ملاءمة لأبحاث البروتيوم خارج الخلية ، وتحديدا للمنطقة الاقتصادية الخاصة.
ومن الجدير بالذكر أنه إذا كانت المنطقة موضع الاهتمام أصغر من المنطقة الاقتصادية الخاصة (على سبيل المثال، التحقيق فقط في طبقة الخلايا البطانية)، فإن النهج الحر يتخلف عن دقة LCM. على سبيل المثال ، من الصعب استخدام CSD لفصل الطبقة البطانية عن الطبقة تحت البطانية لأن الطبقة البطانية ليست سوى قطر خلية عريض ، وترسيم الحدود نحو الطبقة تحت البطانية غير مرئي للعين المجردة في الأنسجة المجمدة الطازجة. وبالتالي ، سيكون LCM خيارا أفضل من CSD إذا كان التشريح الدقيق على مقياس أقل من 50 ميكرومتر أكثر أهمية من الأنسجة غير المضطربة أو الحفاظ على وقت التشريح قصيرا. بالنسبة للمناطق التي يبلغ عرضها 50 ميكرومتر وأكثر ، فإن دقة CSD قابلة للمقارنة مع دقة LCM لتحليل بروتين ECM.
لقد أثبتت CSD بالفعل أنها مفيدة من خلال المساهمة في التحقيق في الدور الوظيفي ل ECM في المجال العصبي25. وبالتالي ، فإن التطبيق المستمر ل CSD في المنطقة الاقتصادية الخاصة لمختلف تحقيقات البروتين والبروتيوم (أو حتى تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة) قد يؤدي إلى الكشف عن المزيد من منظمات تكوين الخلايا العصبية ، وعلامات تنشيط الخلايا الجذعية ، وفهم أعمق لفسيولوجيا الخلايا الجذعية المتخصصة في المنطقة الاقتصادية الخاصة. بالنظر إلى انخفاض تكوين الخلايا العصبية في SEZ37 المسنة ، فإن تحليلا موجزا لتغيرات ECM في المنطقة الاقتصادية الخاصة بالفئران المسنة مقابل الفئران الصغيرة قد يعزز فهم الآليات المتخصصة الدقيقة التي تعزز تطوير NSC وصيانته38,39. علاوة على ذلك ، فإن تأثير الالتهاب والإصابة على تكوين الخلايا العصبية في المنطقة الاقتصادية الخاصة راسخ بشكل جيد40،41،42،43. إن إثراء الفيبرينوجين المشتق من الدم في المنطقة الاقتصادية الخاصة بعد إصابة الدماغ القشرية وتأثيره على تكوين الخلايا الدبقية الفلكية في المنطقة الاقتصادية الخاصة وتكوين الندبات44 يسلط الضوء على التأثير المحتمل للتغيرات الدقيقة الناجمة عن الصدمة على فسيولوجيا الخلايا الجذعية في المنطقة الاقتصادية الخاصة. وبالتالي ، فإن التحقيق في بروتين SEZ-ECM بالاقتران مع إصابة الدماغ باستخدام CSD يمكن أن يساعد في توضيح الآليات التي تؤثر بها الإصابة والالتهاب على تكوين الخلايا العصبية. الأهم من ذلك ، يمكن أن تكون هذه الطريقة قابلة للتطبيق أيضا على منافذ الدماغ البشري العصبية في الصحة والمرض حيث يمكن في كثير من الأحيان الحصول على الأنسجة المجمدة الطازجة من العمليات الجراحية. علاوة على ذلك ، نظرا للاختلافات في الأنواع في تكوين الخلايا العصبية للبالغين ، سيكون من الرائع أيضا تطبيق طريقة CSD على الأنواع الأخرى ، على سبيل المثال ، بالاقتران مع تكوين الخلايا العصبية المخططية. علاوة على ذلك ، مع طرق الكشف عن البروتين الأخرى ، يمكن التحقيق في الاختلافات في عوامل النمو المنتجة محليا بدقة وكفاءة باستخدام CSD للمنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ (على سبيل المثال ، ELISA).
وأخيرا، يمكن تعديل إجراء التشريح من أجل الاستخراج الدقيق لمناطق الدماغ الأخرى، وكذلك للأسئلة البحثية التي لا تتعلق بتكوين الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، يتضمن CSD خطوة قصيرة شبه ذوبان ، حيث يكون المايلين المضغوط مرئيا كمناطق بيضاء متميزة عن أنسجة المخ المتبقية الأكثر شفافية. مع تعديل بسيط للطريقة ، ستسمح هذه الميزة بالتشريح الدقيق لأنسجة المايلين المدمجة في الجسم الثفني فقط ، والتي يمكن أن تخضع لتحليل بروتيني للتغيرات المرتبطة بالإصابة. اقتراح بتعديل البروتوكول الذي من شأنه أن يسمح بتشريح الجسم القاسي هو حذف الخطوات 1.5-1.9 من البروتوكول والمضي مباشرة في إعداد الأقسام الإكليلية بدلا من فتح البطينين لجعل المنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ في متناول اليد. ثم ، ضع الأقسام على الثلج الجاف ، وارفع الشرائح لفترة وجيزة وشبه إذابتها ، وقم ببساطة بإزالة الجسم الثفني بمشرط. يجب أن يكون هذا التحضير جاهزا الآن لأي تحليل يتطلب تشريحا فعالا لأنسجة الجسم الثفني الأصلية.
باختصار ، تقدم هذه الدراسة طريقة تشريح دقيق يمكن استخدامها لتحليل البروتيوم المتخصص العصبي البطيني الموثوق. وتؤكد البيانات على توافق وفائدة طريقة لجنة التنمية المستدامة جنبا إلى جنب مع التحليل البروتيني القائم على التصلب المتعدد للبيئة الدقيقة للمنطقة الاقتصادية الخاصة. إن الجمع بين الدقة والكفاءة والحد الأدنى من اضطراب الأنسجة يجعل CSD امتدادا قيما للطرق الحالية.

نظرا لأن تكوين الخلايا العصبية مقيد في دماغ البالغين ، فإن استراتيجيات إصلاح الجهاز العصبي المركزي المختلفة ستستفيد بشكل كبير من زيادة فهم أسس الاستبدال العصبي للبالغين. لقد ساعدتنا القوارض على فهم الآليات الأساسية لتكوين الخلايا العصبية بعد الولادة ، على الرغم من أنه تجدر الإشارة إلى أن تكوين الخلايا العصبية لدى البالغين يعتمد إلى حد كبير على الأنواع. في الفئران ، هناك ثلاثة منافذ للخلايا الجذعية العصبية البالغة (NSC). ما تحت المهاد هو مكان NSC للبالغين مع إمكانات عصبية1,2 ، في حين أن التكوين العصبي المستمر للبالغين يقتصر بشكل أساسي على الحصين3 والمنطقة الاقتصادية الخاصة للجدران الجانبية للبطينين الجانبيين4,5,6. المنطقة الاقتصادية الخاصة هي أكبر منطقة جرثومية تحتوي على NSCs (خلايا النوع B) التي تتطور إلى خلايا عصبية (خلايا من النوع A) عبر الخلايا السلفية المضخمة العابرة (خلايا النوع C). تحتوي المنطقة الاقتصادية الخاصة على 20-35٪ من خلايا النوع B ، و 1-15٪ من خلايا النوع C ، و 1-30٪ من خلايا النوع A ، و 25-50٪ من الخلايا البطانية7. تتميز المنطقة الاقتصادية الخاصة ببنية دقيقة معقدة ، مع خلايا بطانية ، وخلايا دبقية صغيرة ، وخلايا إبانديمالية تعيش في مكانة الخلايا الجذعية وتؤثر عليها8،9،10. على الرغم من ندرة الخلايا العصبية في المنطقة الاقتصادية الخاصة، إلا أن المحاور العصبية المنبثقة من مصادر بعيدة مثل المخطط أو منطقة التيجمنتال البطني أو ما تحت المهاد تصل إلى الخلايا البائية وتؤثر عليها4. ميزة فريدة من نوعها لهذا المكان المناسب للخلايا الجذعية هي الفصل بين موقع الانتشار وموقع التمايز. بعد الانتشار ، تهاجر السلف العصبية عدة ملليمترات من المنطقة الاقتصادية الخاصة إلى المصباح الشمي ، حيث تتمايز بشكل نهائي إلى خلايا عصبية وتندمج في الدوائر العصبية الموجودة مسبقا. وقد وفرت التحقيقات في البرامج الجوهرية للخلايا المرتبطة بتكوين الخلايا العصبية بالفعل معرفة مهمة لإعادة برمجة الخلايا العلاجية التجريبية واستراتيجيات زرعها15،16،17،18،19،20. ومع ذلك ، فإن الإشارات الخارجية للخلايا تنظم أيضا تكوين الخلايا العصبية ، ويمكن لبيئات الأنسجة تحديد المصير العصبي للخلايا الجذعية11،12،14،21،22،23. وبالتالي ، فإن التحقيق في البيئة الدقيقة للمنافذ العصبية وتفاعلها مع الخلايا الجذعية له أهمية حاسمة.
المصفوفة خارج الخلية (ECM) وغيرها من البروتينات المفرزة هي جزء كبير من البيئة الدقيقة. من أجل التحديد الدقيق والقياس الكمي ، فإن النهج البروتيني هو الأنسب من النهج النسخي لتحديد تكوين ECM بسبب الارتباط المنخفض بين النسخ ومستويات البروتين ل ECM24,25. علاوة على ذلك ، هناك أدلة كبيرة على أن المنظمين المتخصصين في المنطقة الاقتصادية الخاصة لا يتم إنتاجهم حصريا بواسطة الخلايا التي تملأ المكان نفسه. تفرز المواقع البعيدة، مثل الضفيرة المشيمية، إشارات تعديلية تنتقل إلى الخلايا الجذعية عبر السائل الدماغي الشوكي22,23. يمكن أن يساعد التحقيق في البروتيوم المتخصص في تحديد المنظمين المتخصصين الموجودين في المكانة بشكل مستقل عن موقع إنتاجهم ، بالنظر إلى أن نسبة كبيرة من البيئة الدقيقة خارج الخلية يتم تجميعها بواسطة البروتينات.
لجمع منطقة البطين الفئراني للتحليل البروتيني غير المتحيز ، هناك حاجة إلى طريقة ذات دقة عالية ، لالتقاط الشريط شبه البطيني الرقيق حوالي 50 ميكرومتر الذي يحتوي على خلايا جذعية مع استبعاد أنسجة المخطط المجاور. علاوة على ذلك ، يجب تقليل اضطراب الأنسجة أثناء التشريح إلى الحد الأدنى لتحليل البيئة الدقيقة خارج الخلية لأن البروتينات القابلة للذوبان ، بما في ذلك عوامل النمو أو السيتوكينات ، يمكن غسلها بسهولة. على الرغم من أنه من الممكن تحليل أطياف الكتلة للأنسجة الثابتة ، إلا أن العامل المطلوب ، مثل paraformaldehyde ، سيقلل من عمق تحديد البروتين وقد يدخل تعديلات ما بعد الترجمة. تشريح المنطقة الاقتصادية الخاصة الكامل الشائع ، على سبيل المثال ، لجمع الخلايا لتحليل فرز الخلايا المنشط بالفلور ، يزيل المنطقة الاقتصادية الخاصة بأكملها بالمقص26. هذا التشريح القياسي سريع مع الحد الأدنى من اضطراب الأنسجة. ومع ذلك ، لا يمكن تجنب التلوث الخطي للعينات. على العكس من ذلك ، تتمتع LCM بميزة رائعة تتمثل في دقة التشريح الفائقة. ومع ذلك ، قد يؤدي LCM إلى اضطرابات في الأنسجة ، على سبيل المثال ، بسبب تلطيخ الخلفية أو تمسخ البروتين الناجم عن الليزر. للجمع بين نقاط القوة في تشريح الجبل الكامل و LCM ، تم تطوير طريقة جديدة متوافقة مع مرض التصلب العصبي المتعدد ، تسمى تشريح المقطع البارد (CSD) ، (الشكل 1A-D). يسمح CSD باستخراج المنطقة الاقتصادية الخاصة وتشريح المنطقة الاقتصادية الخاصة للجدران الإنسية للبطينين الجانبيين (MEZ) ، وهي منطقة تحكم مثالية ، معظمها غير عصبية المنشأ للمنطقة الاقتصادية الخاصة (انظر البروتوكول). أثبت البروتيوم المتخصص الذي تم الحصول عليه من خلال الجمع بين CSD وأحدث طرق MS أنه مفيد لتوصيف وتحديد المنظمين الجدد في هذا المجال NSC البالغ25. وبالتالي ، ستكون هذه الطريقة مفيدة لتحديد تكوين بروتين أنسجة المنطقة الاقتصادية الخاصة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryostat CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td>cat. no. BPB018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>cat. no. 0030123344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical disposable scalpels</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>cat. no. 5518083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes 60 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>cat. no. 633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>cat. no. A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. AB2253,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-GFAP 1:500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-MAG 1:400</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MAB1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 9</td>
			<td>GraphPad Software, San Diego California USA</td>
			<td></td>
			<td>www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perseus Version 1.6.10.50</td>
			<td>Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis

يتكون الكوة العصبية تحت البطينية من شريط شبه بطيني لجدار البطين الجانبي للبطين الجانبي. المنطقة تحت البطانية (SEZ) هي منطقة رقيقة ومتميزة تتعرض للبطينين والسائل الدماغي الشوكي. يسمح عزل هذا المكان بتحليل البيئة الدقيقة للخلايا الجذعية العصبية. ومع ذلك ، فإن استخراج الأنسجة الصغيرة لتحليل البروتيوم يمثل تحديا ، خاصة بالنسبة للحفاظ على عمق قياس كبير وتحقيق متانة موثوقة. تم تطوير طريقة جديدة تسمى تشريح المقطع بالتبريد (CSD) ، تجمع بين الدقة العالية والحد الأدنى من اضطراب الأنسجة ، لمواجهة هذه التحديات. تتوافق هذه الطريقة مع أحدث طرق قياس الطيف الكتلي (MS) التي تسمح بالكشف عن منظمات متخصصة منخفضة الوفرة. قارنت هذه الدراسة CSD وبيانات البروتيوم الخاصة به بالطريقة والبيانات التي تم الحصول عليها عن طريق التشريح المجهري للالتقاط بالليزر (LCM) والتشريح القياسي للمالف الكامل. أسفرت طريقة CSD عن ضعف عمق القياس الكمي في أقل من نصف وقت التحضير مقارنة ب LCM وفي الوقت نفسه تفوقت بوضوح على دقة التشريح للتشريح الكامل. وبالتالي ، فإن CSD هي طريقة متفوقة لجمع المنطقة الاقتصادية الخاصة لتحليل البروتينات.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis at JoVE.com

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

يسمح تشريح المقطع بالتبريد بإعداد طازج ومجمد لأكبر مكان عصبي المنشأ في دماغ الفئران لتحليل البروتيوم الكمي العميق. هذه الطريقة دقيقة وفعالة وتسبب الحد الأدنى من اضطراب الأنسجة. لذلك ، فهي مناسبة بشكل مثالي لدراسة البيئة الدقيقة الجزيئية لهذا المكان ، وكذلك الأعضاء والمناطق والأنواع الأخرى.

تشريح المقطع المبرد للمنطقة تحت البطانية للبالغين من أجل تحليل دقيق وعميق للبروتيوم الكمي

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

تسمح طريقة التشريح لدينا بالعزل الدقيق للمكانة العصبية البطينية ، وبالتالي فهي مناسبة تماما لدراسة البيئة الدقيقة الجزيئية لهذا المكان. الميزة الرئيسية لطريقة التشريح هذه هي أنها دقيقة وفعالة وتسبب الحد الأدنى من اضطراب الأنسجة بينما لا تزال متوافقة مع قياس الطيف الكتلي لتحليل البروتيوم. في هذا البروتوكول ، نستخرج المكانة العصبية للبطين من دماغ الفأر ، ولكن يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على الأنواع الأخرى وفي مختلف حالات الصحة والمرض.قد تتطلب هذه التقنية بعض التدريب. خاصة مع قطع المشرط عند تعريض واستخراج مكانة البطين العصبية. بعد القتل الرحيم لفأر أسود C57 / 6 من عمر 8 إلى 10 أسابيع ، قم باستخراج الدماغ عن طريق التشريح اليدوي ووضعه في طبق ثقافي يحتوي على وسط تشريح بارد مثلج.باستخدام مشرط ، قم بإزالة المصباح الشمي عن طريق إجراء قطع إكليلي مستقيم بين المصباح الشمي والقطب الداخلي للقشرة. بعد ذلك ، قم بإزالة القطب الأمامي للقشرة عن طريق إجراء قطع إكليلي ، مما يضمن أن البطينين الجانبيين مرئيان في المستوى الإكليلي. ثم ، باستخدام المقص ، افتح كلا البطينين الجانبيين من الأعلى ، بدءا من القسم السهمي من السطح القشري إلى تجويف البطين.قم بإطالة هذا القطع بطريقة على شكل حرف C بعد ثني البطين. بعد ذلك ، قم بتوصيل النهايات الذيلية للشق السهمي الأيسر والأيمن ، باستخدام قطع إكليلي إضافي. بعد ذلك ، قم بإزالة القشرة والجسم الثفني الذي يغطي جدران البطين الإنسي.إذا كان النسيج متصلا بجدران البطين الإنسي ، فقم بإجراء جروح إضافية أو ارفع القشرة والجسم الثفني باستخدام مقص لإزاحة الأنسجة. ثم ، باستخدام الملقط ، قم بإزالة القشرة والجسم الثفني الذي يغطي البطينين الجانبيين. باستخدام الملقط ، انشر بعناية جدران البطين وقم بإزالة الضفيرة المشيمية.ثم ضع الدماغ على شريحة زجاجية وضع الشريحة فوق الثلج الجاف لتجميد الدماغ مع جدران البطين في التكوين المفتوح. قبل التقسيم، تأكد من توصيل الدماغ بلوحة التعلق بالتبريد في الدماغ الخلفي مع وسيط تضمين للأنسجة المجمدة. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من عدم ملامسة أي وسيط للتضمين للدماغ الأمامي، خاصة عند البطينين.ثم ، قم بقطع أقسام إكليلية بسماكة 50 إلى 100 ميكرومتر من الدماغ حتى نهاية البطين الجانبي ، وقم بتركيب الأقسام على الشرائح الزجاجية. ضع الشرائح الزجاجية على الثلج الجاف تحت مجهر التشريح. ارفع الشرائح من الثلج الجاف لمدة 15 إلى 30 ثانية لتحقيق ذوبان قصير وغير مكتمل ، مما يجعل المايلين المضغوط للمخطط قابلا للملاحظة كنقاط بيضاء كثيفة.ثم ، باستخدام مشرط مبرد مسبقا ، افصل المنطقة تحت البطانية عن المخطط المجاور ، وانقلها كقطعة كاملة أو مقطعة إلى قسمين إلى أربعة أجزاء في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام الحافة الحادة للمشرط المبرد. ثم افعل الشيء نفسه بالنسبة لمنطقة البطين الإنسي. تم تحديد الكبسولات الداخلية المرتبطة بالمايلين وإيجابية البروتين السكري للمخطط في عينات الجبل الكامل ، ولكن نادرا ما تم تحديدها في عينات تشريح المقطع المبرد عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية.تم تأكيد التلوث المخططي في عينات الجبل الكامل عن طريق إثراء بروتينات المايلين في المنطقة تحت البطانية ، مقارنة بعينات القشرة الجسدية الحسية. وعلى النقيض من ذلك، أظهرت المقارنات بين بروتينات علامات المايلين هذه في عينات تشريح المقطع المبرد عدم وجود اختلافات كبيرة في المنطقة تحت البطينية وعينات القشرة الجسدية الحسية. عند مقارنة نتائج قياس الطيف الكتلي بين تشريح المقطع بالتبريد والتشريح المجهري لالتقاط الليزر، أسفر التشريح المجهري لالتقاط الليزر عن ما يقرب من نصف عدد البروتينات الكمية، على الرغم من أن وقت جمع الأنسجة كان حوالي ضعف المدة.يكشف تحليل المكونات الرئيسية أن هناك تباينا أكبر بين العينات التي تم جمعها باستخدام التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، والتي تم تصويرها على أنها مربعات ، مقارنة بالعينات التي تم جمعها باستخدام تشريح المقطع بالتبريد ، والتي تم تصويرها على شكل دوائر. كشف اختبار إثراء التعليق التوضيحي 2D بين تشريح المقطع المبرد والتشريح المجهري لالتقاط الليزر للمناطق تحت البطانية والإنسية عن إثراء مماثل في كل من الطرق والمناطق للبروتينات المرتبطة بالفضاء خارج الخلية. يوفر تشريح المقطع بالتبريد تحديدا أكثر قوة وقياسا كميا لتكوين الخلايا العصبية في بروتينات المصفوفة خارج الخلية المرتبطة بالمنطقة تحت البطانية.وفي حالة التيناسين-سي، لم يظهر سوى تشريح المقطع المبرد إثراء في المنطقة تحت البطانية مقارنة بالمنطقة الإبندية الإنسية. تأكد من أن أقسام الدماغ على الشرائح لا تذوب تماما. بشكل عام ، من الجيد ممارسة الخطوات في إجراء التشريح للحصول على نتيجة متسقة.يمكن أيضا استخدام طريقة التشريح مع طرق تحليل البروتين الأخرى التي يمكنها بسهولة اكتشاف البروتينات الوفيرة المنخفضة جدا ، مثل عوامل النمو والسيتوكينات. سمحت لنا طريقة التشريح المجهري هذه بتحديد منظم جديد لتكوين الخلايا العصبية ، ونعتقد أنها ستسمح للآخرين بتحديد المنظمين الآخرين لتكوين الخلايا العصبية في سياقات مختلفة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

المنطقة Subventricular اون الوجه : يلطخ Wholemount والتدفق البطانة العصبية

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

صب الدماغية للماوس الكبار عن التصوير والتحليل الصرفي 3D

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

مما يعرض القرار السامي درجات الرمادي وقياسات دقيقة وقت الاستجابة على أجهزة الكمبيوتر التقليدية

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

تشريح والمناعية من اليرقات، العذراء وتعليم الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; شبكية العين

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

طرق لتعديل وتحليل NF كيلوبايت التي تعتمد على تكوين الخلايا العصبية الكبار

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

فرز خلية العصبية الجذعية وخلايا السلف من الفأر Subventricular المنطقة الكبار وحية على التصوير من حيوية دورة الخلية الخاصة

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...