Name: cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis
Uploaded: 2021-10-07T15:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis at JoVE.com

We willen Mathias Mann oprecht bedanken voor het feit dat hij ons in staat heeft gesteld om grote delen van de experimenten in zijn laboratorium uit te voeren, Fabian Coscia voor hulp bij LCM- en proteoomanalyse, Tatiana Simon-Ebert voor wholemount-dissecties en Korbinian Mayr en Igor Paron voor hun technische hulp. We erkennen dankbaar de financiering van de Duitse Onderzoeksraad aan MG (SFB870, TFR274), de EU (Eranet S-700982-5008-001), de ERC (aERC "NeuroCentro" aan MG), de Zweedse Vereniging voor Medisch Onderzoek (SSMF, aan JK) postdoctorale subsidie en KI-stichtingen en -fondsen (2020-01351, aan JK).

Alle experimentele procedures in deze studie werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse en Europese richtlijnen en werden goedgekeurd door de institutionele dierverzorgingscommissie en de regering van Opper-Beieren (Regierung von Oberbayern). Alleen mannelijke C57Bl6-muizen in de leeftijd van 8-10 weken werden gebruikt voor de experimenten.
1. Voorbereiding van het muizenbrein (~ 15 min per muis)
<ol><li>Bereid het dissectiemedium door 5 ml 1 M HEPES (eindconcentratie 10 mM) toe te voegen aan 500 ml 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). OPMERKING: De bewaartijd van het dissectiemedium (+4 °C) mag niet langer zijn dan 2 weken.</li>
	<li>Offer de muizen op door cervicale dislocatie en ontleed de hersenen zorgvuldig. OPMERKING: Bij het onderzoeken van de ECM moet het weefsel bij voorkeur ongewijzigd zijn. Cervicale dislocatie houdt de dissectietijd zo kort mogelijk, waardoor post-mortale enzymatische autodigestie zoveel mogelijk wordt voorkomen. Als verwijdering van bloed van cruciaal belang is voor de onderzoeksvraag, perfuseer de muis dan eenvoudig transcardiaal met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voordat de hersenen worden verwijderd.</li>
	<li>Extraheer de hersenen door handmatige dissectie en plaats deze in een kweekschaal met ijskoud dissectiemedium (figuur 1B - 1). OPMERKING: Houd de hersenen in dissectiemedium op ijs gedurende de dissectie.</li>
	<li>Verwijder de reukbol (OB) met een scalpel (figuur 1B - 2) door een rechte coronale snede tussen de OB en de voorste pool van de cortex.</li>
	<li>Verwijder de voorste pool van de cortex met het scalpel met behulp van een coronale snee om de laterale ventrikels zichtbaar te maken in het coronale vlak (figuur 1B - 3). OPMERKING: Zorg ervoor dat de coronale snee ~ 5 mm rostrally is gemaakt van het optische chiasme; anders gaat het rostrale deel van de SEZ/MEZ verloren.</li>
	<li>Open met een schaar beide laterale ventrikels vanaf de bovenkant, te beginnen met een sagittale sectie van het corticale oppervlak naar het ventriculaire lumen, en verleng deze snede op een c-vormige manier na de ventriculaire flexie (figuur 1B - 4).</li>
	<li>Verbind de caudale uiteinden van de linker en rechter sagittale incisie door middel van een extra coronale snede met de schaar. OPMERKING: De drie sneden vormen nu een trapezium en zullen de verwijdering van de cortex en het corpus callosum in de volgende stap vergemakkelijken.</li>
	<li>Verwijder de cortex en het corpus callosum dat de laterale ventrikels bedekt met een tang (figuur 1B - 5). Verwijder vervolgens de cortex en het corpus callosum die de mediale ventriculaire wanden bedekken. Maak hier extra sneden als het weefsel is bevestigd aan de mediale ventriculaire wanden, of til eenvoudig de cortex en het corpus callosum op met een schaar om het weefsel los te maken.</li>
	<li>Verdeel de ventriculaire wanden voorzichtig met een tang (figuur 1B - 6). Verwijder de plexus choroid met een tang. OPMERKING: Volledige verwijdering van de plexus choroideus is belangrijk om interferentie met de volgende dissectiestappen te voorkomen en mogelijke besmetting van de SEZ/MEZ-monsters te voorkomen.</li>
	<li>Zet de hersenen op een glazen glijbaan en plaats de glasplaat bovenop droogijs om de hersenen te bevriezen. Onderhoud de ventriculaire wanden in de open configuratie. OPMERKING: Zorg voor voldoende afstand tussen de laterale en mediale wanden van de ventrikel om nauwkeurige en exclusieve dissectie van SEZ en MEZ te vergemakkelijken. Als het weefsel weer samentrekt in een gesloten configuratie, gebruik dan de tang om de wanden tijdens het invriezen in de gewenste positie te fixeren. Vermijd schade aan de SEZ/MEZ. Probeer minimale kracht uit te oefenen, voornamelijk aan de bovenrand van de geopende ventrikels.</li>
</ol>2. Sectie van de voorbereide hersenen (~ 15 min per muis)
<ol><li>Snijd 50-100 μm dikke coronale delen van de hersenen tot het einde van de laterale ventrikel met behulp van een cryostaat en monteer de secties op glazen dia's. Zorg ervoor dat de hersenen met OCT-medium aan de cryostaataanhechtingsplaat aan de achterhersenen worden bevestigd en dat er geen OCT in contact komt met de voorhersenen, vooral bij de ventrikels. OPMERKING: OCT medium zal interfereren met MS metingen. Als het weefsel echter wordt gebruikt voor een antilichaamtest, is het niet nodig om OCT-medium uit te sluiten. Het gebruik van gecoate glasplaten wordt niet aanbevolen. Gecoate dia's brengen te veel houdkracht aan op het weefsel, waardoor de translocatie van het weefselmonster van de dia's in de microcentrifugebuis in de volgende stappen wordt belemmerd.</li>
</ol>3. Vrije hand dissectie van hersenplakken (~ 30 min per muis)
<ol><li>Plaats de glasglaasjes met de hersendelen op droogijs onder een dissectiemicroscoop (figuur 1C - 1).</li>
	<li>Bereid de microcentrifugebuizen voor op droogijs en zorg ervoor dat de buizen ten minste 1 minuut op droogijs blijven om voldoende koud te zijn voordat het monster wordt overgedragen. OPMERKING: Gebruik microcentrifugebuizen van hoge kwaliteit, omdat sommige buizen van lage kwaliteit plastic kunnen afwerpen in de daaropvolgende weefselverteringsstappen die verband houden met MS-metingen.</li>
	<li>Til de plakjes 15-30 s van het droogijs om een korte, onvolledige ontdooiing te bereiken om de compacte myeline van het striatum waarneembaar te maken als dichte witte stippen. OPMERKING: Het lokaliseren van de grens tussen de SEZ en het striatum wordt haalbaar (figuur 1C - 2, zie figuur 2A voor de uitsluiting van myeline en een vergelijking met de wholemount-methode). Als het ontdooien te lang duurt, kan het proces worden versneld door een met handschoenen bedekte vinger op de andere kant van de glasplaat te drukken. Deze manoeuvre moet echter worden geoefend omdat overmatig ontdooien gemakkelijk optreedt.</li>
	<li>Scheid de SEZ met een voorgekoeld scalpel van het aangrenzende striatum (figuur 1C,D).</li>
	<li>Breng de SEZ als een heel stuk of in 2-4 delen verdeeld over in een microcentrifugebuis met behulp van de stompe rand van het gekoelde scalpel. Als het weefsel voor een ander type analyse dan MS moet worden gebruikt, breng het weefselmonster dan in plaats daarvan over in de juiste container (bijvoorbeeld een 96-wells plaat). OPMERKING: Het snijden van het volledig bevroren weefsel kan ertoe leiden dat weefsel snel afbreekt en van de dia valt. Het snijden van volledig ontdooid weefsel leidt tot de desintegratie van het weefsel. Zorg ervoor dat het weefsel niet volledig bevroren of volledig ontdooid is.</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben

De CSD-methode maakte het mogelijk om SEZ-weefsel nauwkeurig te extraheren en een betrouwbaar proteoom met aanzienlijke diepte te genereren met behulp van MS. CSD toont een duidelijk voordeel ten opzichte van wholemount dissectie in termen van sterk verminderde striatale contaminatie van SEZ-monsters en extracellulaire eiwitverrijking. Omdat het ook mogelijk is om een vergelijkbaar aantal eiwitten in individuele monsters (~ 6.500 eiwitten per monster) te detecteren met CSD en wholemount dissectie, is de extra tijd voor CSD de moeite waard. LCM biedt nauwkeurigere SEZ-dissectie, maar bereikte een lagere proteoomdiepte, met slechts 3.500 eiwitten per monster, ondanks het gebruik van hetzelfde MS-protocol als CSD (library matching en labelvrije kwantificering). Belangrijk is dat de variabiliteit veel groter was, waarschijnlijk vanwege de achtvoudig langere bereidingstijd per monster. PCA van de monsters verkregen door LCM en CSD onthult een duidelijke scheiding van beide methoden met strakke regiospecifieke clusters die robuust van elkaar gescheiden zijn. Daarentegen vertoonden de LCM-monsters een meer verspreide verdeling, wat waarschijnlijk deels te wijten is aan de lengte van de voorbereiding. Het is onduidelijk of het verzamelen van veel meer monsters over een langere periode een proteoom van gelijke robuustheid en diepte met LCM zou hebben opgeleverd. Het berekenen van een schatting, het verzamelen van een vergelijkbaar monstervolume als gedaan voor CSD zou 5-8 keer langer duren met LCM, zelfs tot 15 keer langer als monsters die voor de peptidespectrabibliotheken werden verstrekt, werden opgenomen, en veel ervan onder ontdooide omstandigheden. Bovendien, gezien de extra verstoringen van het weefsel die nodig zijn voor LCM (achtergrondkleuring, laserdissectie), leverde LCM weinig of geen winst op ten opzichte van CSD. Daarom kan CSD geschikter worden geacht voor extracellulair proteoomonderzoek, specifiek voor de SEZ.
Met name als het gebied van belang kleiner is dan de SEZ (bijvoorbeeld alleen de ependymale cellaag onderzoeken), valt een benadering uit de vrije hand achter bij de nauwkeurigheid van de LCM. Het gebruik van CSD om het ependymale van de subependymale laag te scheiden is bijvoorbeeld moeilijk omdat de ependymale laag slechts een celdiameter breed is en de afbakening naar de subependymale laag niet zichtbaar is voor het blote oog in vers bevroren weefsel. Daarom zal LCM een betere keuze zijn dan CSD als een precieze dissectie op een schaal onder 50 μm belangrijker is dan ongestoord weefsel of het kort houden van de dissectietijd. Voor regio's met een breedte van 50 μm en meer is de precisie van CSD echter vergelijkbaar met die van LCM voor ECM-eiwitanalyse.
CSD heeft al bewezen nuttig te zijn door bij te dragen aan het onderzoek naar de functionele rol van de ECM in de neurogene niche25. Vandaar dat de voortdurende toepassing van CSD in de SEZ voor verschillende eiwit- en proteoomonderzoeken (of zelfs single-nucleus RNA-sequencing) kan leiden tot de detectie van verdere neurogeneseregulatoren, stamcelactiveringsmarkers en een dieper begrip van SEZ-stamcelnichefysiologie. Gezien de achteruitgang van neurogenese in de veroudering sEZ37, kan een beknopte analyse van ECM-veranderingen van de SEZ van oudere versus jonge muizen het begrip bevorderen van de exacte nichemechanismen die de ontwikkeling en het onderhoud van NSC bevorderen38,39. Bovendien is de invloed van ontsteking en letsel op SEZ-neurogenese goed vastgesteld40,41,42,43. De verrijking van bloed-afgeleid fibrinogeen in de SEZ na corticale hersenbeschadiging en de invloed ervan op SEZ astrogliogenese en littekenvorming44 benadrukt de potentiële invloed van trauma-geïnduceerde micro-omgevingsveranderingen op de SEZ-stamcelfysiologie. Daarom kan het onderzoeken van het SEZ-ECM-proteoom in verband met hersenletsel met behulp van CSD helpen bij het ophelderen van de mechanismen waarmee letsel en ontsteking neurogenese beïnvloeden. Belangrijk is dat de methode ook van toepassing kan zijn op neurogene niches van menselijke hersenen in gezondheid en ziekte, omdat vers bevroren weefsel vaak kan worden verkregen uit operaties. Bovendien zou het, gezien de soortverschillen in volwassen neurogenese, ook fascinerend zijn om de CSD-methode toe te passen op andere soorten, bijvoorbeeld in verband met striatale neurogenese. Bovendien kunnen met andere eiwitdetectiemethoden verschillen in lokaal geproduceerde groeifactoren nauwkeurig en efficiënt worden onderzocht met behulp van CSD voor de SEZ en MEZ (bijv. ELISA).
Ten slotte kan de dissectieprocedure mogelijk worden aangepast voor nauwkeurige extractie van andere hersengebieden, ook voor onderzoeksvragen die geen verband houden met neurogenese. CSD omvat bijvoorbeeld een korte semi-ontdooiende stap, waarbij compacte myeline zichtbaar is als witte gebieden die zich onderscheiden van het meer doorschijnende resterende hersenweefsel. Met een eenvoudige wijziging van de methode zou deze functie de precieze dissectie van alleen corpus callosum compact myelineweefsel mogelijk maken, dat kan worden onderworpen aan proteomische analyse van letselgerelateerde veranderingen. Een suggestie van een protocolwijziging die de corpus harteloze dissectie mogelijk zou maken, is om stap 1.5-1.9 van het protocol weg te laten en direct over te gaan tot het voorbereiden van de coronale secties in plaats van de ventrikels te openen om de SEZ en MEZ toegankelijk te maken. Plaats vervolgens de secties op droogijs, til de plakjes kort op en half ontdooi ze en verwijder eenvoudig het corpus callosum met een scalpel. Dit preparaat moet nu klaar zijn voor elke analyse die een efficiënte dissectie van inheems corpus callosumweefsel vereist.
Samenvattend presenteert deze studie een microdissectiemethode die kan worden gebruikt voor betrouwbare ventriculaire neurogene niche proteoomanalyse. De gegevens onderstrepen de compatibiliteit en het nut van de CSD-methode samen met op MS gebaseerde proteomische analyse van de SEZ-micro-omgeving. De combinatie van precisie, efficiëntie en minimale weefselverstoring maakt de CSD een waardevolle uitbreiding van bestaande methoden.

Omdat neurogenese beperkt is in de volwassen hersenen, zouden verschillende herstelstrategieën voor het centrale zenuwstelsel veel baat hebben bij een beter begrip van de onderbouwing van volwassen neurale vervanging. Knaagdieren hebben ons geholpen de basismechanismen van postnatale neurogenese te begrijpen, hoewel moet worden opgemerkt dat volwassen neurogenese sterk soortafhankelijk is. Bij muizen zijn er drie volwassen neurale stamcel (NSC) niches. De hypothalamus is een volwassen NSC-niche met neurogene potentie1,2, terwijl continue volwassen neurogenese voornamelijk beperkt is tot de hippocampus3 en de SEZ van de laterale wanden van de laterale ventrikels4,5,6. De SEZ is het grootste kiemgebied met NSC's (type B-cellen) die zich ontwikkelen tot neuroblasten (type A-cellen) via transit-amplificerende voorlopercellen (type C-cellen). De SEZ bevat 20-35% type B-cellen, 1-15% type C-cellen, 1-30% type A-cellen en 25-50% ependymale cellen7. De SEZ heeft een complexe microarchitectuur, met endotheelcellen, microgliale cellen en ependymale cellen die zich in de stamcelnis bevinden en deze beïnvloeden8,9,10. Hoewel neuronen schaars zijn in de SEZ, bereiken en beïnvloeden axonen afkomstig van verre bronnen zoals het striatum, het ventrale tegmentale gebied of de hypothalamus type B-cellen4. Een uniek kenmerk van deze stamcelniche is de scheiding tussen de plaats van proliferatie en de plaats van differentiatie. Na proliferatie migreren de neuronale voorlopers enkele millimeters van de SEZ naar de reukbol, waar ze terminaal differentiëren in neuronen en integreren in reeds bestaande neurale circuits. Onderzoek naar cel-intrinsieke programma's geassocieerd met neurogenese heeft al kennis opgeleverd die belangrijk is voor experimentele therapeutische celherprogrammering en transplantatiestrategieën15,16,17,18,19,20. Cel-extrinsieke signalen reguleren echter ook neurogenese en weefselomgevingen kunnen het neurogene lot van stamcellen bepalen11,12,14,21,22,22,23. Daarom is het onderzoek naar de micro-omgeving van de neurogene niches en de interactie met de stamcellen van cruciaal belang.
De extracellulaire matrix (ECM) en andere uitgescheiden eiwitten vormen een groot deel van de micro-omgeving. Voor nauwkeurige identificatie en kwantificering is een proteomische benadering beter geschikt dan een transcriptomische benadering om de ECM-samenstelling te bepalen vanwege de lage correlatie tussen transcriptoom- en eiwitniveaus voor ECM24,25. Bovendien is er substantieel bewijs dat nicheregulatoren in de SEZ niet uitsluitend worden geproduceerd door cellen die de niche zelf bevolken. Verder weg gelegen locaties, zoals de plexus choroideus, scheiden modulatorische signalen af die via het hersenvocht naar de stamcellen worden verzonden22,23. Het onderzoeken van het nicheproteoom kan helpen om nicheregulatoren te identificeren die onafhankelijk van hun productielocatie in de niche aanwezig zijn, aangezien een aanzienlijk deel van de extracellulaire micro-omgeving wordt geassembleerd door eiwitten.
Om de muizenventrikelzone te verzamelen voor onbevooroordeelde proteomische analyse, is een methode met hoge precisie vereist, waarbij het ca. 50 μm dunne paraventriculaire lint met stamcellen wordt vastgelegd terwijl het weefsel van het aangrenzende striatum wordt uitgesloten. Bovendien moet weefselverstoring tijdens de dissectie worden geminimaliseerd voor het analyseren van de extracellulaire micro-omgeving, omdat oplosbare eiwitten, waaronder groeifactoren of cytokines, gemakkelijk kunnen worden weggespoeld. Hoewel het mogelijk is om de massaspectra van vast weefsel te analyseren, zal het vereiste agens, zoals paraformaldehyde, de eiwitidentificatiediepte verminderen en posttranslationele modificaties introduceren. Een gemeenschappelijke wholemount SEZ-dissectie, bijvoorbeeld voor het verzamelen van cellen voor fluorescentie-geactiveerde celsorteeranalyse, verwijdert de hele SEZ met een schaar26. Deze standaard dissectie is snel met minimale weefselverstoring. Striatale besmetting van de monsters kan echter niet worden vermeden. Omgekeerd heeft LCM het uitstekende voordeel van superieure dissectieprecisie. LCM kan echter weefselverstoringen introduceren, bijvoorbeeld als gevolg van achtergrondkleuring of door laser veroorzaakte eiwitdenaturatie. Om de sterke punten van de wholemount dissectie en LCM te combineren, werd een nieuwe methode ontwikkeld die compatibel is met MS, cryo-section-dissectie (CSD) genoemd (figuur 1A-D). De CSD maakt de extractie van de SEZ en de dissectie van de SEZ van de mediale wanden van de laterale ventrikels (MEZ) mogelijk, wat een ideaal, meestal niet-neurogeen controlegebied is voor de SEZ (zie het protocol). Het nicheproteoom verkregen door de combinatie van CSD en state-of-the-art MS-methoden bleek nuttig te zijn voor de karakterisering en identificatie van nieuwe regulatoren in deze volwassen NSC-niche25. Daarom zal deze methode nuttig zijn voor de bepaling van de samenstelling van SEZ-weefseleiwitten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryostat CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td>cat. no. BPB018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>cat. no. 0030123344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical disposable scalpels</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>cat. no. 5518083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes 60 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>cat. no. 633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>cat. no. A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. AB2253,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-GFAP 1:500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-MAG 1:400</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MAB1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 9</td>
			<td>GraphPad Software, San Diego California USA</td>
			<td></td>
			<td>www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perseus Version 1.6.10.50</td>
			<td>Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis

De subependymale neurogene niche bestaat uit een paraventriculaire lint van de laterale ventriculaire wand van de laterale ventrikel. De subependymale zone (SEZ) is een dun en apart gebied dat wordt blootgesteld aan de ventrikels en hersenvocht. De isolatie van deze niche maakt de analyse van een neurogene stamcelmicro-omgeving mogelijk. Extractie van kleine weefsels voor proteoomanalyse is echter een uitdaging, vooral voor het behoud van een aanzienlijke meetdiepte en het bereiken van betrouwbare robuustheid. Een nieuwe methode genaamd cryo-section-dissectie (CSD), die hoge precisie combineert met minimale weefselverstoring, werd ontwikkeld om deze uitdagingen aan te pakken. De methode is compatibel met state-of-the-art massaspectrometrie (MS) -methoden die de detectie van laag-overvloedige nicheregelaars mogelijk maken. Deze studie vergeleek de CSD en zijn proteoomgegevens met de methode en gegevens verkregen door laser-capture-microdissectie (LCM) en een standaard wholemount dissectie. De CSD-methode resulteerde in tweemaal de kwantificeringsdiepte in minder dan de helft van de bereidingstijd in vergelijking met de LCM en presteerde tegelijkertijd duidelijk beter dan de dissectieprecisie van de hele hoeveelheid dissectie. Daarom is CSD een superieure methode voor het verzamelen van de SEZ voor proteoomanalyse.

Bij het volgen van de bovenstaande stappen zijn de weefselmonsters in de microcentrifugebuizen klaar voor en compatibel met MS-monstervoorbereiding. Na monstervoorbereiding verkregen we ~5-7 μg peptiden per monster van SEZ of MEZ per muis. De uiteindelijke hoeveelheden van de peptiden kunnen echter afhangen van de MS-bereidingsmethode. In de onderstaande proteoomvergelijkingen werden eiwitidentificatie en kwantificeringsdiepte (500-1.000 eiwitten per monster) verhoogd door de peptidespectra computationeel te matchen met peptidespectrabibliotheken die voor elk weefselgebied waren gemaakt25,27. Met name de verliesvrije nanofractioneringsmethode die hier wordt gebruikt voor het maken van de peptidespectrabibliotheken is momenteel niet commercieel beschikbaar. De ruwe MS-gegevens werden geanalyseerd met behulp van de MaxQuant-software28, waardoor massanauwkeurigheden werden bereikt in het bereik van de delen per miljard29. De Max Quant-omgeving maakt matching tussen MS-runs mogelijk. Eiwitrijkdom werd gekwantificeerd met behulp van een labelvrij kwantificeringsalgoritme30. Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd op vers ingevroren weefsels en uitgevoerd zoals eerder gemeld25 (zie de tabel met materialen).
Cryo-sectie-dissectie De volledige SEZ en MEZ van volwassen muizen (n = 4) werden verkregen met behulp van CSD (zie figuur 1 en protocol). De somatosensorische cortex (Cx) werd ontleed met een chirurgische schaar. Nog eens 4 muizen werden op dezelfde manier ontleed; het ontleedde weefsel werd echter samengevoegd tot één monster per regio om de proteoombibliotheek (10.923 geïdentificeerde eiwitten) te creëren voor verhoogde eiwitidentificatie en kwantificering in de individuele monsters25. In de vier individuele monsters (gemiddelde ± SD) werden 6.673 ± 317,4 eiwitten gekwantificeerd in de SEZ en 6.747 ± 37,7 in de MEZ. Alle MS proteomics-gegevens werden gedeponeerd in het ProteomeXchange Consortium via de PRIDE31-partnerrepository en het toetredingsnummer voor de hier gerapporteerde proteomen is ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).
Vergelijking met wholemount dissectie Wholemount dissectie werd uitgevoerd volgens een standaard protocol26. Wholemount-dissectie onthulde een vergelijkbaar aantal eiwitten (ongeveer 6.000 voor SEZ en 6.000 voor Cx, n = 4 per groep) in vergelijking met CSD25. Een van de beoogde verbeteringen van het gebruik van CSD voor de SEZ, in plaats van een wholemount dissectieprotocol, is de vermindering van potentiële striatale besmetting. In SEZ-monsters die besmet zijn met weefsel uit een andere regio, kunnen gedetecteerde kandidaat-eiwitten niet aan een regio worden toegewezen, omdat significante verrijking het gevolg kan zijn van het gebied van belang en de contaminator. Immunohistochemisch werden de myeline-geassocieerde glycoproteïne (MAG) positieve myelinerijke interne capsules van het striatum geïdentificeerd in de wholemount-monsters, maar zelden in de CSD-monsters (figuur 2A). De striatale contaminatie in de wholemount-monsters kon worden bevestigd door de verrijking van myeline-eiwitten in de SEZ te identificeren in vergelijking met de somatosensorische cortex (Cx) Grijze Stof (GM) monsters (figuur 2B). Merk op dat grote delen van de Cx GM, vooral de bovenste Cx-lagen, nietmyeliniseerd zijn32.
Omdat grote vezelbundels door het striatum gaan, resulteerde besmetting door dit gebied in de verrijking van myeline-eiwitten in vergelijking met de Cx. De myeline-eiwitten die werden gebruikt als markers voor striatale besmetting in de SEZ-monsters waren het myelinebasiseiwit (MBP), het myeline-geassocieerde glycoproteïne (MAG), het proteolipide-eiwit 1 (Plp1) en het 2',3'-cyclisch-nucleotide 3'-fosfodiësterase (Cnp). Alle myelinemarkerereiwitten waren significant verrijkt in de SEZ in vergelijking met de Cx. Omgekeerd leverden vergelijkingen voor de vier myelinemarkereleiwitten in de CSD-dataset geen significante verschillen op bij het vergelijken van SEZ met Cx (figuur 2B). Proteomische gegevens van het striatum33 ondersteunen de hypothese dat de verrijking van myeline-eiwitten in de SEZ-monsters van de wholemount dissectie werd veroorzaakt door de besmetting met striatale weefsels. Vandaar dat de CSD besmetting door striatale weefsels (rijk aan compacte myeline) grotendeels voorkwam in vergelijking met een wholemount dissectie.
Onbevooroordeelde proteoomanalyse van niet-gedissocieerd weefsel kan interessante extracellulaire eiwitten onthullen. Met verbeterde dissectie met behulp van de CSD werden extracellulair geassocieerde eiwitten significant verrijkt in de monsters in vergelijking met de wholemount-monsters (figuur 2C, annotatieverrijkingstest). De CSD en wholemount dissectie vertonen een vergelijkbare verrijking van de genontologie (GO) termen "extracellulair vesiculair exosoom" en "extracellulair gebiedsdeel". De GO-term "Matrisome-associated" is echter iets meer verrijkt in de CSD dan in de hele ontleding. Dienovereenkomstig bleken het ECM-kruisbindende enzym en de onlangs ontdekte neurogeneseregulator transglutaminase-2 (Tgm2) verrijkt te zijn in de SEZ in vergelijking met Cx met behulp van de CSD25. Daarentegen werd geen verschil gevonden tussen SEZ- en Cx-monsters verkregen door de wholemount-dissectie (figuur 2D). Proteomische gegevens van het striatum33 ondersteunen de hypothese dat de detectie van de neurogeneseregulator Tgm2 door wholemount dissectie werd belemmerd door de besmetting met striataal weefsel. Daarom is de cryo-sectie-dissectie over het algemeen een succesvolle maar ook noodzakelijke verbetering van de standaarddissectie voor nichespecifieke proteoomanalyse.
Vergelijking met Laser-capture-microscopie De voorste helft van de SEZ en de MEZ van 3 volwassen muizen werden verkregen voor LCM (figuur 3A ). Over het algemeen vertoont de LCM-methode enkele nadelen, met name met betrekking tot weefselverstoring en efficiëntie. Om het gebied van belang onder de dissectiemicroscoop te visualiseren, is achtergrondkleuring nodig, waarbij mogelijk kleine of oplosbare eiwitten van belang worden weggespoeld, bijvoorbeeld groeifactoren, cytokines of ECM-regulatoren zoals enzymen. Bovendien brengen dia's tijdens het verwijderen van laserverwijdering wisselende tijden door bij kamertemperatuur. Bovendien kan de laser zelf interessante eiwitten denatureren.
CSD heeft een aanzienlijk voordeel ten opzichte van LCM met betrekking tot de tijd en moeite die nodig is om de dissectie uit te voeren: stap 1 van het protocol moet op dezelfde manier worden uitgevoerd voor zowel CSD als LCM; zonder deze stap blijven ventriculaire wanden hechten, waardoor de scheiding van MEZ- en SEZ-monsters moeilijk wordt. Aangezien de CSD-secties (100 μm) 6-7 keer dikker zijn dan de maximale dikte34 van de LCM-secties (15 μm), zullen stap 2 (sectie van de hersenen) en stap 3 (het verwijderen van de MEZ en SEZ uit elke coronale sectie) minstens 6-7 keer langer duren voor LCM. De noodzakelijke achtergrondkleuring en het instellen van de lasermicroscoop zal extra tijd in beslag nemen. Hier duurde het drie keer langer om 50% van de SEZ en MEZ van 3 dieren door LCM te oogsten in vergelijking met 100% van de SEZ en MEZ van 4 dieren door CSD, wat een achtvoudig snelheidsvoordeel van CSD vormt. Kortom, LCM vereist niet alleen een aanzienlijke hoeveelheid extra inspanning, maar het weefsel wordt ook onderworpen aan een aanzienlijk langere periode van manipulatie en temperatuurveranderingen die de dynamiek en betrouwbaarheid van gegevens die door latere analyse worden gegenereerd, in gevaar kunnen brengen.
De MS-resultaten van CSD werden vergeleken met de resultaten van de laser capture microdissectie (LCM). Beide datasets werden gekoppeld aan de proteomische bibliotheek die werd gegenereerd door CSD-monsters te poolen. Gemiddeld leverde LCM 3.441 ± 270,0 en 3.613 ± 238,7 individuele eiwitten in respectievelijk de SEZ- en mediale ventriculaire zone (figuur 3B). Gezien het opmerkelijke verschil in eiwitidentificatie vertoonde de principal component analysis (PCA) een duidelijke scheiding volgens de dissectiemethode (component 1: 62,7%, niet getoond). Component 2 vertoonde de grootste scheiding voor SEZ en MEZ onder de LCM-monsters (8,5%, figuur 3C). Component 3 lijkt ook LCM en CSD te scheiden; dit verschil kan echter het gevolg zijn van methodische verschillen in plaats van het aantal geïdentificeerde eiwitten (6,4%). Niettemin bleef de algehele regionale scheiding opvallend duidelijk voor de cryo-dissectiegegevens en veel beter dan voor LCM. Deze discrepantie in gegevensdynamica kan het gevolg zijn van verschillende tijden doorgebracht door de monsters bij kamertemperatuur tijdens de laserdissectie of een hogere gevoeligheid van klein weefsel komt neer op variabiliteit in de daaropvolgende proteomics-protocollen en massaspectrometriemetingen.
Om te zoeken naar verschillen in het proteoomprofiel van de ECM, werd een 2D-annotatieverrijkingstest tussen CSD en LCM uitgevoerd voor de SEZ en MEZ (figuur 3D). Het berekenen van de relatieve verrijking van GO-termen tussen LCM- en CSD-monsters maakt de vergelijking van de relatieve proteoomdynamiek van de ECM-eiwitclusters tussen de twee methoden mogelijk, ondanks de ongelijke hoeveelheid weefsel en de verschillen in het dissectieprotocol. De plots laten een goede correlatie zien tussen LCM en CSD. De annotaties "extracellulair regiodeel" en "extracellulair membraangebonden organel" zijn op dezelfde manier verrijkt in zowel methoden als regio's. Vandaar dat de toegenomen tijdsvraag van LCM niet lijkt te worden gecompenseerd door een relatief hogere gevoeligheid voor ECM-geassocieerde eiwitten. In plaats daarvan biedt CSD een robuustere identificatie / kwantificering bij het vergelijken van de monstergegevens voor de neurogenese en SEZ-geassocieerde ECM-eiwitten Tgm2, Trombospondin-4 (Thbs4), S100a6 en Tenacin-C (Tnc) (Figuur 3E). In het geval van TnC vertoonde alleen CSD, hoewel gekwantificeerd in alle monsters, verrijking voor SEZ in vergelijking met MEZ. Niettemin vertoonden de SEZ-geassocieerde basale membraaneiwitten Nidogen-1 (Nid1), Laminine subunit beta-2 (Lamb2) en keldermembraanspecifiek heparansulfaat proteoglycaankerneiwit (Hspg2)35 een nog robuustere verrijking in de SEZ (vergeleken met MEZ) in de LCM-monsters dan in de CSD-monsters (niet getoond). Daarom kan CSD weefselmonsters leveren die een nauwkeurig en diep kwantitatief proteoom bieden voor SEZ-karakterisering binnen een redelijk tijdsbestek, zonder zich zorgen te maken over gecompromitteerde weefselintegriteit of eiwitverlies.
Statistiek Statistische tests, 2D-annotatieverrijkingstests en PCA werden uitgevoerd in de Perseus-omgeving. Eiwitten werden in de analyse opgenomen als voor elke methode in ten minste één monster een geldige waarde werd gedetecteerd. Eiwitrijkdom en getalvergelijkingen werden gevisualiseerd met behulp van data-analysesoftware (zie de tabel met materialen). Een op permutatie gebaseerde controle van de false discovery rate (FDR) (FDR was ingesteld op 0,05, 250 randomisaties) werd gebruikt voor eiwitvergelijkingen. Voor de 2D-annotatieverrijkingstests36 zijn de weergegeven GO-termen aanzienlijk verrijkt (FDR werd ingesteld op 0,02 met behulp van de Benjamini-Hochberg FDR-controlemethode).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig01.jpg"> Figuur 1: De Cryo-Sectie-Dissectie methode. (A) Overzicht van het betreffende gebied: de laterale ventrikel met de neurogene SEZ en de niet-neurogene MEZ. Neuroblasten immunogekleurd met Dcx. (B) Stapsgewijze verwijdering van de OB, de voorste pool, de cortex en corpus callosum boven de ventrikels en de choroïde plexus: 1. plaatsing in dissectiemedium, 2. verwijdering van OB, 3. verwijdering van de voorste pool van de cortex, 4. sagittale incisies van de ventriculaire top, 5. verwijdering van de ventriculaire top, 6. verspreiding van de ventriculaire wanden. (C) 100 μm coronale plakjes van de vers ingevroren muizenhersenen, (1.) vóór en (2.) na het verwijderen van de ventriculaire wanden met een ijskoud scalpel. Schaalstaven = 4 mm (D) Kleuring van een coronale sectie van een laterale ventrikel (GFAP: groen; DAPI: blauw), met de SEZ en MEZ ontleed met de CSD. Schaalbalken = 300 μm (A), 200 μm (D). Afkortingen: CSD = cryo-section dissectie; SEZ = subependymale zone; MEZ = mediale ependymale zone; dcx = dubbelcortine; OB = olfactorische bol; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig02.jpg"> Figuur 2: Superieure dissectieprecisie met de cryosectie-dissectie in vergelijking met wholemount-dissectie. (A) Immunohistochemisch beeld van een SEZ-monster verkregen door wholemount-dissectie (links). De opname van myelinerijk striataal weefsel wordt gevisualiseerd door kleuring tegen MAG (groen). Kleuring van een SEZ ontleed met de CSD (rechts). Bij CSD is bijna alle striatale myeline (kleuring tegen MAG, groen) uitgesloten van het monsterlint. Kernen werden gevisualiseerd met behulp van DAPI (blauw). (B) Vergelijking van myelinemarkerverrijking in SEZ versus Cx van wholemount (MBP: p = 0,0074; MAG: p = 0,0016; Plp1: p = 0,0011; CNP: p = 0,0029) en CSD (MBP: p = 0,0667; MAG: p = 0,0236; Plp1: p = 0,3420; CNP: p = 0,1842). C) 2D-annotatieverrijkingstest waarbij de wholemount-SEZ wordt vergeleken met de CSD-SEZ-monsters. De GO-termen extracellulaire ruimte en matrisome-geassocieerd zijn meer verrijkt in de CSD-gegevens dan in de wholemount-gegevens. (D) De eiwitrijkdom van de NSC-regulator Tgm225 uitgezet voor de gehele ontleding en de CSD. Tgm2 is significant verrijkt in de SEZ in vergelijking met de Cx in CSD (CSD: p = 0,0029; Hele berg: p = 0,1775). Voor B en D: Als referentie, proteoomgegevens van Sharma et al.33 met metingen van striatum en cortex uitgezet voor de overeenkomstige eiwitten weergegeven in de wholemount- en CSD-monsters. Schaalbalken = 200 μm (A). Afkortingen: CSD = cryo-section dissectie; SEZ = subependymale zone; MAG = myeline-geassocieerd glycoproteïne; Cx = somatosensorische cortex; MBP = myeline basiseiwit; Plp1 = proteolipide-eiwit 1; CNP = 2',3'-cyclisch-nucleotide 3'-fosfodiësterase; GO = gen ontologie; NSC = neurale stamcel; Tgm2 = tranglutaminase 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool; LFQ = labelvrije kwantificering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig03.jpg"> Figuur 3: Verbeterde extracellulaire eiwitkwantificering met cryo-sectie-dissectie in vergelijking met LCM. (A) Cresylvioletkleuring van een laterale ventrikel voor en na laseropname van de SEZ en MEZ (links). Ter vergelijking, de CSD-incisie van de SEZ en MEZ (rechts). Schaalstaven = 150 μm. (B) Vergelijking van het aantal gedetecteerde eiwitten in de SEZ- en MEZ-monsters van CSD en LCM. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. (C) Hoofdcomponentenanalyse van de SEZ- en MEZ-monsters waarbij CSD en LCM worden vergeleken (component 2: 8,5% van de variantie; component 3: 6,4%). (D) 2D-annotatieverrijking van de cryo-sectie- en laser-ontleedde MEZ (boven) en SEZ (onder). De GO-termen extracellulair organel en extracellulair gebiedsdeel zijn aanzienlijk verrijkt (rode stippen). (E) Abundanties van extracellulaire SEZ-geassocieerde markereiwitten in SEZ en MEZ voor LCM (Tnc: p = 0,3789) en de CSD-monsters (Tgm2: p = 0,2940; S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0,3941; Tnc: p = 0,0004). Afkortingen: CSD = cryo-section dissectie; LCM = laser-capture-microdissectie; SEZ = subependymale zone; MEZ = mediale ependymale zone; GO = gen ontologie; Tnc = Tenacin-C; Tgm2 = transglutaminase 2; S100a6 = S100 calciumbindend eiwit A6; THBS4 = trombospondin-4; LFQ = labelvrije kwantificering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis at JoVE.com

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

Cryo-sectie-dissectie maakt verse, bevroren bereiding van de grootste neurogene niche in de muizenhersenen mogelijk voor diepe kwantitatieve proteoomanalyse. De methode is nauwkeurig, efficiënt en veroorzaakt minimale weefselverstoring. Daarom is het bij uitstek geschikt voor het bestuderen van de moleculaire micro-omgeving van deze niche, evenals andere organen, regio's en soorten.

Cryo-sectie dissectie van de volwassen subependymale zone voor nauwkeurige en diepe kwantitatieve proteoomanalyse

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

Onze dissectiemethode maakt een nauwkeurige isolatie van de ventriculaire neurogene niche mogelijk en is daarom zeer geschikt voor het bestuderen van de moleculaire micro-omgeving van deze niche. Het belangrijkste voordeel van deze dissectiemethode is dat het nauwkeurig en efficiënt is en minimale weefselverstoring veroorzaakt, terwijl het nog steeds compatibel is met massaspectrometrie voor proteoomanalyse. In dit protocol extraheren we de neurogene niche van de ventrikel uit een muizenbrein, maar deze methode kan ook worden toegepast op andere soorten en in verschillende gezondheids- en ziektetoestanden.De techniek kan enige training vereisen. vooral met de scalpelsneden bij het blootstellen en extraheren van de ventriculaire neurogene niche. Na het euthanaseren van een 8 tot 10 weken oude C57 zwarte /6 mannelijke muis, extraheer de hersenen door handmatige dissectie en plaats deze in een kweekschaal met ijskoud dissectiemedium.Verwijder met behulp van een scalpel de reukbol door een rechte coronale snede te maken tussen de reukbol en de binnenste pool van de cortex. Verwijder vervolgens de voorste pool van de cortex door een coronale snede te maken, zodat de laterale ventrikels zichtbaar zijn in het coronale vlak. Open vervolgens met een schaar beide laterale ventrikels van bovenaf, te beginnen met het sagittale gedeelte van het corticale oppervlak tot het ventriculaire lumen.Verleng deze snede op een C-vormige manier na de ventriculaire flexie. Verbind vervolgens de caudale uiteinden van de linker- en rechter sagittale incisie, met behulp van een extra coronale snede. Verwijder vervolgens de cortex en het corpus callosum dat de mediale ventriculaire wanden bedekt.Als het weefsel is bevestigd aan de mediale ventriculaire wanden, maak dan extra sneden of til de cortex en het corpus callosum op met een schaar om het weefsel los te maken. Verwijder vervolgens met behulp van een tang de cortex en het corpus callosum dat de laterale ventrikels bedekt. Gebruik een tang, spreid voorzichtig de ventriculaire wanden en verwijder de plexus choroideus.Plaats vervolgens de hersenen op een glazen dia en plaats de glijbaan bovenop droogijs om de hersenen te bevriezen met de ventriculaire wanden in de open configuratie. Zorg er voordat u doorsnede voordat u doorgaat, dat de hersenen zijn bevestigd aan de cryostaataanhechtingsplaat aan de achterste hersenen met een insluitmedium voor bevroren weefsels. Zorg er bovendien voor dat er geen inbeddingsmedium in contact komt met de voorhersenen, vooral bij de ventrikels.Snijd vervolgens 50 tot 100 micrometer dikke coronale delen van de hersenen tot het einde van de laterale ventrikel en monteer de secties op de glazen dia's. Plaats de glasglaasjes op droogijs onder een dissectiemicroscoop. Til de plakjes 15 tot 30 seconden van het droogijs om een korte, onvolledige ontdooiing te bereiken, waardoor de compacte myeline van het striatum waarneembaar wordt als dichte witte stippen.Scheid vervolgens met behulp van een voorgekoeld scalpel de subependymale zone van het aangrenzende striatum en breng het als een heel stuk of in twee tot vier delen verdeeld over in een microcentrifugebuis met behulp van de stompe rand van het gekoelde scalpel. Doe vervolgens hetzelfde voor de mediale ventriculaire zone. Myeline-geassocieerde, glycoproteïne-positieve interne capsules van het striatum werden geïdentificeerd in de wholemount-monsters, maar zelden in de cryo-sectie-dissectiemonsters via immunohistochemie.Striatale contaminatie in de wholemount-monsters werd bevestigd door verrijking van myeline-eiwitten in de subependymale zone, vergeleken met de somato-sensorische cortexmonsters. Daarentegen toonden vergelijkingen van deze myelinemarkereiwitten in de cryo-sectie-dissectiemonsters geen significante verschillen in de subependymale zone en somato-sensorische cortexmonsters. Bij het vergelijken van massaspectrometrieresultaten tussen cryo-sectie-dissectie en laservangstmicrodissectie, leverde laservangstmicrodissectie ongeveer de helft minder gekwantificeerde eiwitten op, hoewel de weefselverzamelingstijd ongeveer twee keer zo lang was.Principe component analyse laat zien dat er een grotere variabiliteit is tussen monsters verzameld met laser capture microdissectie, afgebeeld als vierkanten, dan tussen degenen verzameld met cryo-sectie-dissectie, afgebeeld als cirkels. Een 2D-annotatieverrijkingstest tussen cryo-sectie-dissectie en laservangmicrodissectie voor de subependymale en mediale ependymale zones onthulde vergelijkbare verrijking in zowel methoden als regio's voor eiwitten geassocieerd met de extracellulaire ruimte. Cryo-sectie-dissectie biedt een robuustere identificatie en kwantificering van neurogenese in subependymale zone-geassocieerde extracellulaire matrixeiwitten.In het geval van tenascine-C vertoonde alleen cryo-sectie-dissectie verrijking in de subependymale zone in vergelijking met de mediale ependymale zone. Zorg ervoor dat de hersensecties op de dia's niet volledig ontdooid raken. Over het algemeen is het goed om de stappen in de dissectieprocedure te oefenen voor een consistent resultaat.De dissectiemethode kan ook worden gebruikt met andere eiwitanalysemethoden die gemakkelijk zeer lage overvloedige eiwitten kunnen detecteren, zoals groeifactoren en cytokines. Deze microdissectiemethode stelde ons in staat om een nieuwe neurogeneseregulator te identificeren, en we geloven dat het anderen in staat zal stellen om andere regulatoren van neurogenese in verschillende contexten te identificeren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

De subventriculaire zone En-face: Wholemount Beitsen en ependymale Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovasculaire Gieten van de volwassen muis voor 3D Imaging en morfologische analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Waardoor een hoge Grijswaarden resolutie schermen en nauwkeurig Response Time Metingen aan conventionele computers

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Dissectie van volwassen muis Utricle en Adenovirus-gemedieerde Ondersteunende-cel infectie

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissectie en Immunohistochemie van larven, popstadium en Volwassen<em&gt; Drosophila</em&gt; Netvliezen

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Methoden voor de modulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke Adult Neurogenese

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissectie van de Transversus Abdominis Spier voor Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Celsortering van neurale stamcellen en stamcellen uit de Adult Mouse subventriculaire zone en Live-beeldvorming van de celcyclus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...