Name: cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis
Uploaded: 2021-10-07T15:00:00
Duration: 6 min 24 s
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Nous tenons à remercier sincèrement Mathias Mann de nous avoir permis d’effectuer de grandes parties des expériences dans son laboratoire, Fabian Coscia pour l’aide à l’analyse LCM et protéome, Tatiana Simon-Ebert pour les dissections complètes, et Korbinian Mayr et Igor Paron pour leur aide technique. Nous remercions le Conseil allemand de la recherche d’apporter un financement à MG (SFB870, TFR274), à l’UE (Eranet S-700982-5008-001), à l’ERC (aERC « NeuroCentro » à MG), à la société suédoise de recherche médicale (SSMF, à JK) et aux fondations et fonds KI (2020-01351, à JK).

Toutes les procédures expérimentales de cette étude ont été réalisées conformément aux directives allemandes et de l’Union européenne et ont été approuvées par le comité institutionnel de soins aux animaux et le gouvernement de Haute-Bavière (Regierung von Oberbayern). Seules les souris mâles C57Bl6 âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées pour les expériences.
1. Préparation du cerveau de la souris (~ 15 min par souris)
<ol><li>Préparer le milieu de dissection en ajoutant 5 mL de 1 M HEPES (concentration finale 10 mM) à 500 mL de 1x solution saline équilibrée de Hank (HBSS). REMARQUE: La durée de stockage du milieu de dissection (+4 °C) ne doit pas dépasser 2 semaines.</li>
	<li>Sacrifiez les souris par luxation cervicale et disséquez soigneusement le cerveau. REMARQUE: Lors de l’examen de l’ECM, le tissu doit de préférence être non modifié. La luxation cervicale maintient le temps de dissection aussi court que possible, empêchant ainsi autant que possible l’autodigestion enzymatique post-mortelle. Si l’élimination du sang est essentielle à la question de recherche, il suffit de perfuser la souris par voie transcardique avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant de retirer le cerveau.</li>
	<li>Extraire le cerveau par dissection manuelle et le placer dans une boîte de culture contenant un milieu de dissection glacé (Figure 1B - 1). REMARQUE: Gardez le cerveau dans un milieu de dissection sur de la glace tout au long de la dissection.</li>
	<li>Retirer le bulbe olfactif (OB) avec un scalpel (Figure 1B - 2) par une coupe coronale droite entre l’OB et le pôle antérieur du cortex.</li>
	<li>Enlever le pôle antérieur du cortex avec le scalpel à l’aide d’une coupe coronale pour rendre les ventricules latéraux visibles dans le plan coronal (Figure 1B - 3). REMARQUE: Assurez-vous que la coupe coronale est faite ~ 5 mm rostrally à partir du chiasme optique; sinon, la partie rostrale de la ZES/ZEM sera perdue.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux, ouvrez les deux ventricules latéraux par le haut, en commençant par une section sagittale de la surface corticale à la lumière ventriculaire, et allongez cette coupe en forme de C en suivant la flexion ventriculaire (Figure 1B - 4).</li>
	<li>Connectez les extrémités caudales de l’incision sagittale gauche et droite au moyen d’une coupe coronale supplémentaire avec les ciseaux. REMARQUE: Les trois coupes forment maintenant un trapèze et faciliteront l’élimination du cortex et du corps calleux à l’étape suivante.</li>
	<li>Enlever le cortex et le corps calleux recouvrant les ventricules latéraux à l’aide d’une pince (Figure 1B - 5). Ensuite, retirez le cortex et le corps calleux qui recouvrent les parois ventriculaires médiales. Ici, faites des coupures supplémentaires si le tissu est attaché aux parois ventriculaires médiales, ou soulevez simplement le cortex et le corps calleux avec des ciseaux pour déloger le tissu.</li>
	<li>Étalez soigneusement les parois ventriculaires à l’aide d’une pince (Figure 1B - 6). Retirez le plexus choroïde avec une pince. REMARQUE: Le retrait complet du plexus choroïde est important pour éviter toute interférence avec les étapes de dissection suivantes et éviter une contamination potentielle des échantillons de ZES / MEZ.</li>
	<li>Mettez le cerveau sur une lame de verre et placez la lame de verre sur de la glace sèche pour geler le cerveau. Maintenez les parois ventriculaires dans la configuration ouverte. REMARQUE: Assurer une distance suffisante entre les parois latérales et médiales du ventricule pour faciliter la dissection précise et exclusive de la ZES et de la ZEM. Si le tissu se contracte à nouveau dans une configuration fermée, utilisez la pince pour fixer les parois dans la position souhaitée pendant le gel. Évitez tout dommage à la ZES/ZEM. Essayez d’appliquer une force minimale, principalement sur le bord supérieur des ventricules ouverts.</li>
</ol>2. Sectionnement du cerveau préparé (~ 15 min par souris)
<ol><li>Coupez des sections coronales de 50 à 100 μm d’épaisseur du cerveau jusqu’à l’extrémité du ventricule latéral à l’aide d’un cryostat et montez les sections sur des lames de verre. Assurez-vous que le cerveau est attaché à la plaque de fixation du cryostat au niveau du cerveau postérieur avec un milieu OCT et qu’aucun OCT n’entre en contact avec le cerveau antérieur, en particulier au niveau des ventricules. REMARQUE: Le milieu OCT interférera avec les mesures de SEP. Cependant, si le tissu sera utilisé pour un test d’anticorps, il n’est pas nécessaire d’exclure le milieu OCT. L’utilisation de lames en verre revêtu n’est pas recommandée. Les lames enduites appliquent trop de force adhésive sur le tissu, empêchant ainsi la translocation de l’échantillon de tissu des lames dans le tube de microcentrifugation dans les étapes suivantes.</li>
</ol>3. Dissection à main levée de tranches de cerveau (~ 30 min par souris)
<ol><li>Placez les lames de verre avec les sections du cerveau sur de la glace carbonique sous un microscope à dissection (Figure 1C - 1).</li>
	<li>Préparez les tubes de microcentrifugation sur de la glace carbonique et assurez-vous que les tubes restent sur la glace carbonique pendant au moins 1 minute pour être suffisamment froids avant le transfert de l’échantillon. REMARQUE: Utilisez des tubes de microcentrifugation de haute qualité, car certains tubes de mauvaise qualité peuvent perdre du plastique dans les étapes ultérieures de digestion des tissus associées aux mesures de SEP.</li>
	<li>Soulevez les tranches de la glace carbonique pendant 15 à 30 s pour obtenir une décongélation brève et incomplète afin de rendre la myéline compacte du striatum observable sous forme de points blancs denses. REMARQUE: Il devient possible de localiser la frontière entre la ZES et le striatum (figure 1C - 2, voir la figure 2A pour l’exclusion de la myéline et une comparaison avec la méthode du montage complet). Si la décongélation prend trop de temps, le processus peut être accéléré en appuyant sur un doigt recouvert d’un gant sur le côté opposé de la glissière en verre. Cependant, cette manœuvre doit être pratiquée car une décongélation excessive se produit facilement.</li>
	<li>Séparer la ZES à l’aide d’un scalpel prérefroidi du striatum adjacent (Figure 1C,D).</li>
	<li>Transférer la ZES en tant que pièce entière ou sectionnée en 2 à 4 parties dans un tube de microcentrifugation en utilisant le bord émoussé du scalpel refroidi. Si le tissu doit être utilisé pour un autre type d’analyse que la SP, transférer plutôt l’échantillon de tissu dans le contenant approprié (p. ex., une plaque de 96 puits). REMARQUE: Couper le tissu complètement gelé peut entraîner une rupture rapide du tissu et sa chute de la lame. Couper un tissu complètement décongelé conduit à la désintégration du tissu. Assurez-vous que le tissu n’est ni complètement congelé ni complètement décongelé.</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent

La méthode CSD a permis d’extraire avec précision le tissu SEZ et de générer un protéome fiable avec une profondeur significative en utilisant MS. CSD présente un net avantage par rapport à la dissection complète en termes de contamination striatale considérablement réduite des échantillons de ZES et d’enrichissement en protéines extracellulaires. Comme il est également possible de détecter un nombre similaire de protéines dans des échantillons individuels (~ 6 500 protéines par échantillon) avec CSD et dissection complète, le temps supplémentaire pour CSD en vaut la peine. LCM fournit une dissection SEZ plus précise mais a atteint une profondeur de protéome plus faible, avec seulement 3 500 protéines par échantillon malgré l’utilisation du même protocole MS que CSD (correspondance de bibliothèque et quantification sans étiquette). Il est important de noter que la variabilité était beaucoup plus grande, probablement en raison du temps de préparation huit fois plus long par échantillon. L’APC des échantillons obtenus par LCM et CSD révèle une séparation claire des deux méthodes avec des grappes étroites spécifiques à une région solidement séparées les unes des autres. En revanche, les échantillons de LCM présentaient une distribution plus dispersée, ce qui est probablement dû en partie à la durée de la préparation. Il n’est pas clair si la collecte de beaucoup plus d’échantillons sur une période plus longue aurait donné un protéome de robustesse et de profondeur égales à celles du LCM. Le calcul d’une estimation, la collecte d’un volume d’échantillon similaire à celui effectué pour csd prendraient 5 à 8 fois plus de temps avec LCM, voire jusqu’à 15 fois plus longtemps si les échantillons fournis pour les bibliothèques de spectres peptidiques étaient inclus, et une grande partie dans des conditions de dégel. De plus, compte tenu des perturbations supplémentaires du tissu nécessaires à la LCM (coloration de fond, dissection au laser), la LCM a fourni peu, voire aucun, gain par rapport à la CSD. Par conséquent, le CSD peut être considéré comme plus approprié pour la recherche sur le protéome extracellulaire, en particulier pour la ZES.
Notamment, si la région d’intérêt est plus petite que la ZES (p. ex., en étudiant uniquement la couche de cellules épendymaires), une approche à main levée est en retard sur la précision de la LCM. Par exemple, l’utilisation de CSD pour séparer l’épendymaire de la couche sous-épendymaire est difficile car la couche épendymaire n’a qu’un diamètre cellulaire de large et la démarcation vers la couche sous-épendymaire n’est pas visible à l’œil nu dans les tissus frais congelés. Par conséquent, le LCM sera un meilleur choix que le CSD si une dissection précise sur une échelle inférieure à 50 μm est plus importante que le tissu non perturbé ou le temps de dissection court. Pour les régions d’une largeur de 50 μm et plus, cependant, la précision du CSD est comparable à celle du LCM pour l’analyse des protéines ECM.
Csd s’est déjà avéré utile en contribuant à l’étude du rôle fonctionnel de l’ECM dans le créneau neurogène25. Par conséquent, l’application continue de CSD dans la ZES pour diverses études de protéines et de protéomes (ou même le séquençage de l’ARN à noyau unique) pourrait conduire à la détection d’autres régulateurs de neurogenèse, de marqueurs d’activation des cellules souches et à une compréhension plus approfondie de la physiologie de niche des cellules souches SEZ. Compte tenu du déclin de la neurogenèse dans la SEZ37 vieillissante, une analyse concise des changements ECM de la ZES des souris âgées par rapport aux jeunes pourrait promouvoir la compréhension des mécanismes de niche exacts favorisant le développement et le maintien du NSC38,39. En outre, l’influence de l’inflammation et des lésions sur la neurogenèse des ZES est bien établie40,41,42,43. L’enrichissement du fibrinogène sanguin dans la ZES après une lésion cérébrale corticale et son influence sur l’astrogliogenèse de la ZES et la formation de cicatrices44 mettent en évidence l’influence potentielle des changements de microenvironnement induits par un traumatisme sur la physiologie des cellules souches de la ZES. Par conséquent, l’étude du protéome SEZ-ECM en association avec une lésion cérébrale à l’aide de CSD pourrait aider à élucider les mécanismes par lesquels la blessure et l’inflammation affectent la neurogenèse. Il est important de noter que la méthode pourrait également être applicable aux niches neurogènes du cerveau humain dans la santé et la maladie, car des tissus frais congelés peuvent souvent être obtenus à partir de chirurgies. De plus, étant donné les différences entre les espèces dans la neurogenèse adulte, il serait également fascinant d’appliquer la méthode CSD à d’autres espèces, par exemple en association avec la neurogenèse striatale. De plus, avec d’autres méthodes de détection des protéines, les différences dans les facteurs de croissance produits localement peuvent être étudiées avec précision et efficacité à l’aide de CSD pour la ZES et la MEZ (par exemple, ELISA).
Enfin, la procédure de dissection pourrait potentiellement être modifiée pour une extraction précise d’autres régions du cerveau, y compris pour des questions de recherche non liées à la neurogenèse. Par exemple, csd comprend une brève étape de semi-décongélation, au cours de laquelle la myéline compacte est visible sous forme de zones blanches distinctes du tissu cérébral résiduel plus translucide. Avec une simple modification de la méthode, cette caractéristique permettrait la dissection précise du seul tissu de myéline compact du corps calleux, qui pourrait être soumis à une analyse protéomique des changements liés aux blessures. Une suggestion d’une modification du protocole qui permettrait la dissection insensible du corpus est d’omettre les étapes 1.5-1.9 du protocole et de procéder directement à la préparation des sections coronales au lieu d’ouvrir les ventricules pour rendre la ZES et la MEZ accessibles. Ensuite, placez les sections sur de la glace carbonique, soulevez et semi-décongelez brièvement les tranches et retirez simplement le corps calleux avec un scalpel. Cette préparation devrait maintenant être prête pour toute analyse nécessitant une dissection efficace du tissu natif du corps calleux.
En résumé, cette étude présente une méthode de micro-dissection qui pourrait être utilisée pour une analyse fiable du protéome de niche neurogène ventriculaire. Les données soulignent la compatibilité et l’utilité de la méthode CSD ainsi que de l’analyse protéomique basée sur la SEP du microenvironnement des ZES. La combinaison de la précision, de l’efficacité et de la perturbation minimale des tissus fait du CSD une extension précieuse des méthodes existantes.

Comme la neurogenèse est limitée dans le cerveau adulte, diverses stratégies de réparation du système nerveux central bénéficieraient grandement d’une meilleure compréhension des fondements du remplacement neuronal adulte. Les rongeurs nous ont aidés à comprendre les mécanismes de base de la neurogenèse postnatale, bien qu’il faille noter que la neurogenèse adulte dépend grandement de l’espèce. Chez la souris, il existe trois niches de cellules souches neurales adultes (NSC). L’hypothalamus est une niche NSC adulte avec un potentiel neurogène1,2, tandis que la neurogenèse adulte continue est principalement limitée à l’hippocampe3 et à la ZES des parois latérales des ventricules latéraux4,5,6. La ZES est la plus grande région germinale contenant des CSN (cellules de type B) qui se développent en neuroblastes (cellules de type A) via des cellules progénitrices amplifiant le transit (cellules de type C). La ZES contient 20 à 35 % des cellules de type B, 1 à 15 % des cellules de type C, 1 à 30 % des cellules de type A et 25 à 50 % des cellules épendymaires7. La ZES comporte une microarchitecture complexe, avec des cellules endothéliales, des cellules microgliales et des cellules épendymaires résidant dans la niche des cellules souches et influençant 8,9,10. Bien que les neurones soient rares dans la ZES, les axones émanant de sources lointaines telles que le striatum, la région tegmentale ventrale ou l’hypothalamus atteignent et influencent les cellules de type B4. Une caractéristique unique de cette niche de cellules souches est la séparation entre le site de prolifération et le site de différenciation. Après prolifération, les progéniteurs neuronaux migrent de plusieurs millimètres de la ZES vers le bulbe olfactif, où ils se différencient en phase terminale en neurones et s’intègrent dans des circuits neuronaux préexistants. Les recherches sur les programmes cellulaires intrinsèques associés à la neurogenèse ont déjà fourni des connaissances importantes pour les stratégies expérimentales de reprogrammation et de transplantation de cellules thérapeutiques15,16,17,18,19,20. Cependant, les signaux cello-extrinsèques régulent également la neurogenèse, et les environnements tissulaires peuvent déterminer le devenir neurogène des cellules souches11,12,14,21,22,23. Par conséquent, l’étude du microenvironnement des niches neurogènes et de son interaction avec les cellules souches est d’une importance cruciale.
La matrice extracellulaire (ECM) et d’autres protéines sécrétées constituent une grande partie du microenvironnement. Pour une identification et une quantification précises, une approche protéomique est mieux adaptée qu’une approche transcriptomique pour déterminer la composition ecm en raison de la faible corrélation entre les niveaux de transcriptome et de protéines pour ECM24,25. En outre, il existe des preuves substantielles que les régulateurs de niche dans la ZES ne sont pas exclusivement produits par des cellules peuplant la niche elle-même. Des endroits plus éloignés, tels que le plexus choroïde, sécrètent des signaux modulateurs transmis aux cellules souches via le liquide céphalo-rachidien22,23. L’étude du protéome de niche peut aider à identifier les régulateurs de niche présents dans la niche indépendamment de leur site de production, étant donné qu’une proportion substantielle du microenvironnement extracellulaire est assemblée par des protéines.
Pour recueillir la zone ventriculaire murine pour une analyse protéomique impartiale, une méthode de haute précision est nécessaire, capturant le ruban paraventriculaire mince d’environ 50 μm contenant des cellules souches tout en excluant le tissu du striatum adjacent. De plus, la perturbation tissulaire pendant la dissection doit être minimisée pour analyser le microenvironnement extracellulaire, car les protéines solubles, y compris les facteurs de croissance ou les cytokines, pourraient être facilement éliminées. Bien qu’il soit possible d’analyser les spectres de masse des tissus fixes, l’agent requis, tel que le paraformaldéhyde, réduira la profondeur d’identification des protéines et peut introduire des modifications post-traductionnelles. Une dissection commune de ZES à montage entier, par exemple pour la collecte de cellules pour l’analyse de tri cellulaire activée par fluorescence, élimine l’ensemble de la ZES avec des ciseaux26. Cette dissection standard est rapide avec une perturbation tissulaire minimale. Cependant, la contamination striatale des échantillons ne peut être évitée. Inversement, le LCM présente l’avantage exceptionnel d’une précision de dissection supérieure. Cependant, le LCM peut introduire des perturbations tissulaires, par exemple, en raison d’une coloration de fond ou d’une dénaturation des protéines causée par le laser. Pour combiner les forces de la dissection de montage complet et de la LCM, une nouvelle méthode compatible avec la SEP, appelée cryo-section-dissection (CSD), a été développée (Figure 1A-D). Le CSD permet l’extraction de la ZES et la dissection de la ZES des parois médiales des ventricules latéraux (MEZ), qui est une région de contrôle idéale, principalement non neurogène pour la ZES (voir le protocole). Le protéome de niche obtenu par la combinaison de CSD et de méthodes de pointe de SEP s’est avéré utile pour la caractérisation et l’identification de nouveaux régulateurs dans ce créneau NSC adulte25. Par conséquent, cette méthode sera utile pour la détermination de la composition des protéines tissulaires SEZ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryostat CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td>cat. no. BPB018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>cat. no. 0030123344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical disposable scalpels</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>cat. no. 5518083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes 60 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>cat. no. 633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>cat. no. A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. AB2253,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-GFAP 1:500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-MAG 1:400</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MAB1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 9</td>
			<td>GraphPad Software, San Diego California USA</td>
			<td></td>
			<td>www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perseus Version 1.6.10.50</td>
			<td>Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis

La niche neurogène sous-épendymaire est constituée d’un ruban paraventriculaire de la paroi ventriculaire latérale du ventricule latéral. La zone sous-épendymaire (ZES) est une région mince et distincte exposée aux ventricules et au liquide céphalo-rachidien. L’isolement de cette niche permet l’analyse d’un microenvironnement de cellules souches neurogènes. Cependant, l’extraction de petits tissus pour l’analyse du protéome est difficile, en particulier pour le maintien d’une profondeur de mesure considérable et l’obtention d’une robustesse fiable. Une nouvelle méthode appelée cryo-section-dissection (CSD), combinant une haute précision avec une perturbation tissulaire minimale, a été développée pour relever ces défis. La méthode est compatible avec les méthodes de spectrométrie de masse (SEP) de pointe qui permettent la détection de régulateurs de niche à faible abondance. Cette étude a comparé les données du CSD et de son protéome à la méthode et aux données obtenues par microdissection par capture laser (LCM) et une dissection complète standard. La méthode CSD a permis d’obtenir deux fois plus de profondeur de quantification en moins de la moitié du temps de préparation par rapport au LCM et a simultanément nettement surpassé la précision de dissection de l’ensemble de la dissection. Par conséquent, csd est une méthode supérieure pour collecter la ZES pour l’analyse du protéome.

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Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

La cryo-section-dissection permet une préparation fraîche et congelée de la plus grande niche neurogène du cerveau murin pour une analyse quantitative approfondie du protéome. La méthode est précise, efficace et provoque une perturbation tissulaire minimale. Par conséquent, il est idéal pour étudier le microenvironnement moléculaire de cette niche, ainsi que d’autres organes, régions et espèces.

Dissection cryo-section de la zone sous-épendymaire adulte pour une analyse quantitative précise et approfondie du protéome

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

Notre méthode de dissection permet une isolation précise de la niche neurogène ventriculaire et est donc bien adaptée à l’étude du microenvironnement moléculaire de cette niche. Le principal avantage de cette méthode de dissection est qu’elle est précise, efficace et provoque une perturbation tissulaire minimale tout en restant compatible avec la spectrométrie de masse pour l’analyse du protéome. Dans ce protocole, nous extrayons la niche neurogène du ventricule d’un cerveau de souris, mais cette méthode peut également être appliquée à d’autres espèces et dans divers états de santé et de maladie.La technique peut nécessiter une certaine formation. en particulier avec les coupes au scalpel lors de l’exposition et de l’extraction de la niche neurogène ventriculaire. Après avoir euthanasié une souris mâle C57 noire/6 âgée de 8 à 10 semaines, extrayez le cerveau par dissection manuelle et placez-le dans un plat de culture contenant un milieu de dissection glacé.À l’aide d’un scalpel, retirez le bulbe olfactif en effectuant une coupe coronale droite entre le bulbe olfactif et le pôle intérieur du cortex. Ensuite, retirez le pôle antérieur du cortex en faisant une coupure coronale, en veillant à ce que les ventricules latéraux soient visibles dans le plan coronal. Ensuite, à l’aide de ciseaux, ouvrez les deux ventricules latéraux par le haut, en commençant par la section sagittale de la surface corticale à la lumière ventriculaire.Allongez cette coupe en forme de C en suivant la flexion ventriculaire. Ensuite, connectez les extrémités caudales de l’incision sagittale gauche et droite, en utilisant une coupe coronale supplémentaire. Ensuite, retirez le cortex et le corps calleux recouvrant les parois ventriculaires médiales.Si le tissu est attaché aux parois ventriculaires médiales, faites des coupures supplémentaires ou soulevez le cortex et le corps calleux avec des ciseaux pour déloger le tissu. Ensuite, à l’aide de pinces, retirez le cortex et le corps calleux recouvrant les ventricules latéraux. À l’aide d’une pince, étalez soigneusement les parois ventriculaires et retirez le plexus choroïde.Ensuite, placez le cerveau sur une lame de verre et placez la glissière sur de la glace carbonique pour geler le cerveau avec les parois ventriculaires en configuration ouverte. Avant de sectionner, assurez-vous que le cerveau est attaché à la plaque d’attache du cryostat au niveau du cerveau postérieur avec un milieu d’intégration pour les tissus congelés. De plus, assurez-vous qu’aucun milieu d’intégration n’entre en contact avec le cerveau antérieur, en particulier au niveau des ventricules.Ensuite, coupez des sections coronales du cerveau de 50 à 100 micromètres d’épaisseur jusqu’à l’extrémité du ventricule latéral et montez les sections sur les lames de verre. Placez les lames de verre sur de la glace carbonique sous un microscope à dissection. Soulevez les tranches de la glace carbonique pendant 15 à 30 secondes pour obtenir une décongélation brève et incomplète, rendant la myéline compacte du striatum observable sous forme de points blancs denses.Ensuite, à l’aide d’un scalpel pré-refroidi, séparez la zone sous-épendymaire du striatum adjacent et transférez-la en morceau entier ou sectionnée en deux à quatre parties dans un tube de microcentrifugation à l’aide du bord émoussé du scalpel refroidi. Ensuite, faites de même pour la zone ventriculaire médiale. Des capsules internes du striatum associées à la myéline et à glycoprotéine positive ont été identifiées dans les échantillons de montage entier, mais rarement dans les échantillons de cryo-section-dissection par immunohistochimie.La contamination striatale dans l’ensemble des échantillons a été confirmée par l’enrichissement des protéines de myéline dans la zone sous-épendymaire, par rapport aux échantillons de cortex somato-sensoriel. En revanche, les comparaisons de ces protéines marqueurs de la myéline dans les échantillons de cryo-section-dissection n’ont montré aucune différence significative dans la zone sous-épendymaire et les échantillons de cortex somato-sensoriel. En comparant les résultats de la spectrométrie de masse entre la cryo-section-dissection et la microdissection par capture laser, la microdissection par capture laser a donné environ deux fois moins de protéines quantifiées, bien que le temps de collecte des tissus ait été environ deux fois plus long.L’analyse des composants principaux révèle qu’il existe une plus grande variabilité entre les échantillons prélevés avec la microdissection par capture laser, représentés sous forme de carrés, que parmi ceux collectés avec la cryo-section-dissection, représentés sous forme de cercles. Un test d’enrichissement par annotation 2D entre la dissection cryo-section et la microdissection par capture laser pour les zones épendymaires sous-épendymaires et médiales a révélé un enrichissement similaire dans les méthodes et les régions pour les protéines associées à l’espace extracellulaire. La cryo-section-dissection fournit une identification et une quantification plus robustes de la neurogenèse dans les protéines de matrice extracellulaire associées à la zone sous-épendymaire.Dans le cas de la ténascine-C, seule la cryo-section-dissection a montré un enrichissement dans la zone sous-épendymaire par rapport à la zone épendymaire médiale. Assurez-vous que les sections du cerveau sur les diapositives ne deviennent pas complètement décongelées. Dans l’ensemble, il est bon de pratiquer les étapes de la procédure de dissection pour un résultat cohérent.La méthode de dissection peut également être utilisée avec d’autres méthodes d’analyse des protéines qui peuvent facilement détecter des protéines très faibles en abondance, telles que les facteurs de croissance et les cytokines. Cette méthode de microdissection nous a permis d’identifier un nouveau régulateur de neurogenèse, et nous pensons qu’elle permettra à d’autres d’identifier d’autres régulateurs de la neurogenèse dans divers contextes.

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Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Des procédés pour la modulation et de l&#39;analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection du muscle Transversus Abdominis pour l’analyse de jonction neuromusculaire à montage entier

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Tri cellulaire des neurones cellules souches et progénitrices de la souris adulte-ventriculaire Zone et Live-imagerie de la dynamique de leur cycle cellulaire

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolement et culture des adultes cellules souches neurales de la Subcallosal Zone Souris

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...