Name: cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis
Uploaded: 2021-10-07T15:00:00
Duration: 6 min 24 s
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私たちは、彼の研究室で実験の大部分を実行することを可能にしたマティアス・マン、LCMとプロテオーム分析の助けを求めるファビアン・コシア、全体のマウント解剖のためのタチアナ・サイモン・エバート、そしてコルビニアン・マイヤーとイゴール・パロンの技術的な助けに心から感謝したいと思います。我々は、ドイツ研究評議会からMG(SFB870、TFR274)、EU(エラネットS-700982-5008-001)、ERC(aERC「NeuroCentro to MG」)、スウェーデン医学研究協会(SSMF、JKへの)博士助成、KI財団と資金(2020-013)への資金提供を感謝しています。

この研究のすべての実験手順は、ドイツおよび欧州連合(EU)のガイドラインに従って行われ、機関動物ケア委員会とバイエルン州(ドイツ・フォン・オーバーバイエルン)政府によって承認された。実験には8~10週の間に雄C57Bl6マウスのみを使用した。
1. マウス脳の準備(マウス1回あたり~15分)
<ol><li>1 M HEPES(最終濃度10mM)の5 mLを1xハンクスバランス塩溶液(HBSS)の500 mLに加えて解剖培地を調製します。 注:解剖媒体(+4°C)の保管時間は2週間を超えてはならない。</li>
	<li>頸部脱臼でマウスを犠牲にし、脳を慎重に解剖する。 注:ECMを調査する場合、組織は好ましくは変更されていない必要があります。頸部脱臼は解剖時間を可能な限り短く保ち、それによって死後の酵素性自己消化を可能な限り防ぐ。血液の除去が研究の問題にとって重要である場合は、脳を除去する前に、リン酸緩衝生理食塩気(PBS)でマウスを心腔内に穿刺するだけです。</li>
	<li>手動解剖で脳を抽出し、氷冷解剖媒体を含む培養皿に入れる(図1B-1)。 注:解剖全体を通して氷の上に解剖媒体で脳を保ちます。</li>
	<li>OBと皮質の前極との間のまっすぐなコロナカットによって、メス(図1B - 2)で嗅球(OB)を取り外します。</li>
	<li>コロナカットを使用してメスで皮質の前極を取り外し、側側心室をコロナ平面に見えるようにします(図1B - 3)。 注:コロナカットが光学チアズムから〜5 mmのロストラリーに行われたことを確認してください。そうしないと、SEZ/MEZ のロストラル部分が失われます。</li>
	<li>はさみを使用して、皮質表面から心室内腔への矢状部から始まり、上から側側心室を開き、心室屈曲に続くc字型の方法でこの切り口を伸ばします(図1B - 4)。</li>
	<li>左右の矢状切開部の尾端を、はさみで追加のコロナカットで接続します。 注:3つの切り傷は台形を形成し、次のステップで皮質と脳梁の除去を容易にします。</li>
	<li>鉗子を使用して側心室を覆う皮質および脳梁を取り除く(図1B - 5)。次に、心室壁を覆う皮質と脳梁を取り除きます。ここでは、組織が内側心室壁に取り付けられている場合は追加のカットを行うか、単に組織を取り除くためにはさみで皮質と脳梁を持ち上げます。</li>
	<li>慎重に鉗子で心室の壁を広げます(図1B - 6)。鉗子で脈絡叢を取り除く。 注: 以下の解剖ステップとの干渉を避け、SEZ/MEZ サンプルの潜在的な汚染を避けるために、脈絡叢の完全な除去が重要です。</li>
	<li>ガラスのスライドに脳を置き、脳を凍結するためにドライアイスの上にガラススライドを置きます。オープン構成で心室壁を維持します。 注:SEZとMEZの正確かつ排他的な解剖を容易にするために、心室の側面壁と内側壁間の十分な距離を確保してください。組織が閉じた構成に戻って収縮する場合は、鉗子を使用して凍結中に目的の位置に壁を固定します。SEZ/MEZ の損傷は避けてください。主に開いた心室の上端に最小限の力を加えてみてください。</li>
</ol>2. 準備された脳の切り離し (マウスあたり 15 分)
<ol><li>クライオスタットを使用して横心室の終わりまで脳の50〜100μmの厚いコロナセクションをカットし、そのセクションをガラススライドに取り付けます。脳がOCT培地の後脳のクライオスタット付着プレートに取り付けられ、特に心室で前脳に接触しないOCTがないことを確認します。 注: OCT 培地は MS 測定に干渉します。しかしながら、組織が抗体アッセイに使用される場合、OCT培地を除外する必要は無い。コーティングされたガラススライドの使用はお勧めしません。コーティングされたスライドは、組織にあまりにも多くの接着力を適用し、それにより、次のステップで、スライドからマイクロ遠心管への組織標本の転位を妨げる。</li>
</ol>3. 脳スライスの自由解剖(マウス1個につき30分)
<ol><li>脳切片を持つガラススライドを、解剖顕微鏡下のドライアイスの上に置きます(図1C - 1)。</li>
	<li>ドライアイスにマイクロ遠心チューブを準備し、チューブが少なくとも1分間ドライアイスの上にとどまることを確認して、試料の移送前に十分に冷たくします。 注:いくつかの低品質のチューブは、MS測定に関連する後続の組織消化ステップでプラスチックを流す可能性があるため、高品質のマイクロ遠心チューブを使用してください。</li>
	<li>ドライアイスからスライスを15~30 s持ち上げて、短くて不完全な解凍を行い、線条体のコンパクトミエリンを密な白い点として観察できるようにします。 注: SEZ と線条体の境界の位置を特定することが可能になります (図 1C - 2、図 2A を参照して、ミエリンの除外と、全体マウント方式との比較を行います)。解凍に時間がかかりすぎる場合は、手袋で覆われた指をガラススライドの反対側に押し付けてプロセスを加速させることができます。しかし、過度の解凍が容易に起こるので、この操縦は実践されるべきである。</li>
	<li>SEZを、隣接する線条体からあらかじめ冷却されたメスで分離します(図1C、D)。</li>
	<li>SEZを全体として、または冷却されたメスの鈍い端を使用してマイクロ遠心チューブに2-4部分に切り離して転送します。組織がMS以外の別のタイプの分析に使用される場合は、代わりに組織標本を適切な容器(例えば96ウェルプレート)に移す。 注:完全に凍結した組織を切断すると、組織が急速に壊れ、スライドから落ちる可能性があります。完全に解凍された組織を切断すると、組織の崩壊につながります。組織が完全に凍結も完全に解凍もされていないことを確認してください。</li>
</ol>

著者らは競合する利益を宣言しない

CSD法により、SEZ組織を正確に抽出し、MS.CSDを用いて有意な深度の信頼できるプロテオームを生成することが可能となり、SEZサンプルのストリアタル汚染および細胞外タンパク質濃縮の点で、全山解離に比べて明らかな利点を示しています。CSDおよび全マウント解剖を用いて、個々のサンプル(サンプルあたり約6,500個のタンパク質)で同様の数のタンパク質を検出することもできるので、CSDの追加時間は努力する価値があります。LCMは、より正確なSEZ解剖を提供しますが、CSDと同じMSプロトコル(ライブラリマッチングおよびラベルフリー定量)を使用しているにもかかわらず、サンプルあたりわずか3,500個のタンパク質で、より低いプロテオーム深さに達しました。重要なことに、おそらくサンプル当たりの準備時間が8倍長いため、変動性ははるかに大きかった。LCMとCSDによって得られたサンプルのPCAは互いに強く分離された堅い領域特異的なクラスターとの両方の方法の明確な分離を明らかにする。対照的に、LCMサンプルはより分散した分布を示しており、これはおそらく準備の長さによるものであった。より長い期間にわたってはるかに多くのサンプルを収集することが、LCMと同等の堅牢性と深さのプロテオームをもたらしたかどうかは不明です。推定値を計算すると、CSDに対して行われた同様のサンプル量を収集すると、LCMでは5〜8倍長く、ペプチドスペクトルライブラリに提供されるサンプルが含まれていれば最大15倍も長く、解凍された条件下で大部分を占めます。さらに、LCMに必要な組織の追加の摂動(バックグラウンド染色、レーザー解剖)を考慮すると、LCMはCSDをほとんど得ず、もしも、与えた。したがって、CSDは、特にSEZのために、細胞外プロテオーム研究に適していると考えることができます。
特に、関心領域がSEZよりも小さい場合(例えば、最終的な細胞層のみを調査する)、自由なアプローチはLCMの精度に遅れをとります。例えば、若年層が細胞径幅のみであるため、PCCDを使用して皮下層からエペンディマルを分離することは困難であり、新鮮な凍結組織では肉眼では視差が見えない。したがって、50μm未満のスケールでの精密解剖が、乱れのない組織や解剖時間を短く保つよりも重要である場合、LCMはCSDよりも優れた選択肢となります。しかし、幅が50μm以上の領域では、CSDの精度はECMタンパク質分析のためのLCMの精度と同等です。
CSDは、神経性niche25におけるECMの機能的役割の調査に貢献することによって有用であることが既に証明されている。したがって、様々なタンパク質およびプロテオームの調査(あるいは単核RNAシーケンシング)にCSDを継続的に適用することは、さらなる神経新生調節因子、幹細胞活性化マーカー、およびSEZ幹細胞ニッチ学のより深い理解につながる可能性があります。老化したSEZ37における神経新生の減少を考慮すると、高齢マウスと若年マウスのSEZのECM変化の簡潔な分析は、NSCの発達と維持を促進する正確なニッチメカニズムの理解を促進するかもしれない38,39。さらに、SEZ神経新生に対する炎症および傷害の影響は十分に確立されている40,41,42,43。皮質脳損傷後のSEZにおける血液由来フィブリノーゲンの濃縮とSEZアストロリオジェネシスおよび瘢痕形成に及ぼす影響444は、外傷による微小環境変化がSEZ幹細胞生理学に及ぼす潜在的な影響を強調する。したがって、CSDを用いた脳損傷に関連してSEZ-ECMプロテオームを調査することは、傷害および炎症が神経新生に影響を与えるメカニズムを解明するのに役立つ可能性がある。重要なことに、この方法は、新鮮な凍結組織がしばしば手術から得ることができるので、健康と病気におけるヒト脳神経新生ニッチにも適用できる。さらに、成体神経新生における種差を考えると、CSD法を他の種、例えば線条性神経新生に関連して適用することも魅力的であろう。さらに、他のタンパク質検出法を用いて、SEZおよびMEZ(例えばELISA)に対してCSDを用いて、局所的に産生される成長因子の違いを正確かつ効率的に調査することができる。
最後に、解剖手順は、神経新生に関連しない研究問題のために、他の脳領域の正確な抽出のために変更される可能性があります。例えば、CSDは、コンパクトミエリンがより半透明の残留脳組織とは異なる白色領域として見える間、短い半解凍ステップを含む。この方法の簡単な変更により、この機能は、傷害関連の変化のプロテオミクス分析を受けることができる唯一の体のカオスカルサムコンパクトミエリン組織の正確な解剖を可能にするであろう。コーパス無数解離を可能にするプロトコル変更の提案は、プロトコルのステップ1.5-1.9を省略し、SEZとMEZをアクセス可能にするために心室を開く代わりにコロナセクションを準備することに直接進むということです。次に、ドライアイスの上にセクションを置き、スライスを少し持ち上げて半解凍し、メスでコーパスカオスを取り除きます。この調製は、ネイティブの脳梁組織の効率的な解剖を必要とするあらゆる分析の準備ができているはずです。
要約すると、この研究は、信頼性の高い心室神経原性ニッチプロテオーム分析に使用できるマイクロ解剖法を提示する。このデータは、CSD法の適合性と有用性を、SEZ微小環境のMSベースのプロテオミクス解析と共に強調している。精度、効率、および最小限の組織摂動の組み合わせは、CSDを既存の方法の貴重な拡張にします。

脳神経の神経新生は成人の脳で制限されているように, 様々 な中枢神経系の修復戦略は、大人の神経置換の基盤の理解の増加から大いに利益を得る.げっ歯類は、出生後神経新生の基本的なメカニズムを理解するのに役立ちましたが、成体の神経新生は種に大きく依存しています。マウスには、3つの成体神経幹細胞(NSC)ニッチがある。視床下部は神経因性の可能性を有する成人NSCニッチである1,2、連続成人神経新生は主に海馬3および側心室の側壁のSEZに制限される4,5,6。SEZは、トランジット増幅前駆細胞(C型細胞)を介して神経芽細胞(タイプA細胞)に発展するNSC(B型細胞)を含む最大の胚芽領域です。SEZは、B型細胞の20〜35%、C型細胞の1〜15%、A型細胞の1〜30%、および名誉細胞7の25〜50%を含む。SEZは、内皮細胞、ミクログリア細胞、および幹細胞niche8,9,10に存在し、幹細胞に影響を与える素因性細胞を有する複雑なマイクロアーキテクチャを特徴としている。SEZではニューロンが不足していますが、線条体、腹側のテグメンタル領域、視床下部などの遠くの源から発せられる軸索はB型細胞4に到達し、影響を与えます。この幹細胞ニッチのユニークな特徴は、増殖部位と分化部位との分離である。増殖後、ニューロン前駆物質はSEZから嗅球に数ミリメートル移動し、そこで最終的にニューロンに分化し、既存の神経回路に統合する。神経新生に関連する細胞組み込みプログラムの調査は、実験的治療細胞リプログラミングおよび移植戦略に重要な知識を既に提供しています15,16,17,18,19,20。しかし、細胞外因性シグナルも神経新生を調節し、組織環境は幹細胞11、12、14、21、22、23の神経因性の運命を決定することができる。その結果、神経起源ニッチの微小環境の調査と幹細胞との相互作用が極めて重要である。
細胞外マトリックス(ECM)および他の分泌タンパク質は、微小環境の大部分を占めています。正確な同定と定量を行うために、ECM24,25のトランスクリプトームとタンパク質レベルの相関が低いためにECM組成を決定するトランスクリプソミックアプローチよりもプロテオミクスアプローチが適しています。さらに、SEZのニッチレギュレータは、ニッチ自体を含む細胞によって独占的に産生されないという実質的な証拠があります。脈絡叢のようなより遠い場所では、髄液22,23を介して幹細胞に伝達される変調信号を分泌する。ニッチプロテオームを調査することは、細胞外微小環境のかなりの割合がタンパク質によって組み立てられることを考えると、生産部位とは無関係にニッチに存在するニッチな調節因子を同定するのに役立ちます。
不偏プロテオーム解析のためにマウス室領域を収集するために、高精度の方法が必要であり、隣接する線条体の組織を除いた状態で幹細胞を含むca.50μmの細いパラベンタキュラーリボンを捕捉する。さらに、成長因子やサイトカインを含む可溶性タンパク質を容易に洗い流すことができるため、解剖中の組織摂動を細胞外微小環境解析のために最小限に抑える必要があります。固定組織の質量スペクトルを分析することは可能であるが、パラホルムアルデヒドなどの必要な薬剤は、タンパク質同定深度を低下させ、翻訳後修飾を導入する可能性がある。一般的な全山SEZ解剖、例えば、蛍光活性化細胞選別分析のための細胞の収集のために、はさみ26でSEZ全体を除去する。この標準的な解剖は最低のティッシュの摂動と速い。しかし、サンプルの線条体汚染は避けられません。逆に、LCMは優れた解剖精度の顕著な利点を有する。しかし、LCMは、例えば、バックグラウンド染色またはレーザーによるタンパク質変性のために、組織摂動を導入する可能性があります。全山解離とLCMの強みを組み合わせ、MSと互換性のある新しい方法である、いわゆるクライオセクション解離(CSD)が開発された(図1A-D)。CSDは、SEZの抽出と、SEZの理想的な非神経原性制御領域である側心室(MEZ)の内側壁のSEZの解剖を可能にする(プロトコルを参照)。CSDと最先端のMS法の組み合わせによって得られたニッチプロテオームは、この成人NSC niche25における新規調節因子の特性評価および同定に有用であることが判明した。したがって、この方法は、SEZ組織タンパク質組成物の決定に有用であろう。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryostat CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td>cat. no. BPB018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>cat. no. 0030123344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical disposable scalpels</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>cat. no. 5518083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes 60 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>cat. no. 633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>cat. no. A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. AB2253,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-GFAP 1:500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-MAG 1:400</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MAB1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 9</td>
			<td>GraphPad Software, San Diego California USA</td>
			<td></td>
			<td>www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perseus Version 1.6.10.50</td>
			<td>Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis

脳下神経原性ニッチは、側心室の側心室壁の寄室リボンから成る。皮下領域(SEZ)は、心室および脳脊髄液にさらされる薄く、明確な領域である。このニッチの分離は、神経性幹細胞微小環境の分析を可能にする。しかし、プロテオーム分析のための小組織の抽出は、特にかなりの測定深さの維持と信頼性の高い堅牢性の達成のために、困難です。これらの課題に対処するために、高精度と組織摂動を最小限に抑えた新しい方法「クライオセクション解剖(CSD)」が開発されました。この方法は、低い豊富なニッチレギュレータの検出を可能にする最先端の質量分析(MS)法と互換性があります。本研究では、CSDとそのプロテオームデータを、レーザー・キャプチャー・マイクロ解剖(LCM)および標準の全マウント解剖によって得られた方法およびデータと比較した。CSD法は、LCMと比較して半分以下の調製時間で定量深度を2倍にし、同時に全マウント解剖の解剖精度を明確に上回った。したがって、CSDはプロテオーム解析のためのSEZを収集するための優れた方法です。

上記の手順に従うと、マイクロ遠心チューブ内の組織サンプルは、MSサンプル調製に対応可能であり、適合性があります。サンプル調製後、1個のマウス当たりSEZまたはMEZのいずれかのサンプルあたり、約5〜7μgのペプチドを得た。しかし、ペプチドの最終的な量はMS調製方法に依存し得る。以下のプロテオーム比較では、各組織領域に対して作成されたペプチドスペクトルライブラリーにペプチドスペクトルを計算的に一致させることにより、タンパク質同定および定量深度(サンプル当たり500〜1,000個のタンパク質)が増加した。特に、ペプチドスペクトルライブラリの作成にここで用いられる損失を減らさないナノ分画法は、現在市販されていない。生のMSデータはMaxQuantソフトウェア28を用いて分析され、10億範囲当たりの部品の質量精度を達成しました29.最大クォント環境では、MS 実行間のマッチングが可能です。タンパク質の存在量は、ラベルフリー定量アルゴリズム30を用いて定量した。免疫組織化学的染色は、新鮮な凍結組織に対して行われ、先に報告された25(材料表を参照)に実施した。
クライオセクション解剖 成体マウスの完全なSEZおよびMEZ(n=4)は、CSDを用いて得られた( 図1 およびプロトコルを参照)。体性感覚皮質(Cx)を手術用ハサミで解剖した。さらに4匹のマウスを同様に解剖した。しかし、解剖された組織を領域ごとに1つのサンプルにプールし、プロテオームライブラリー(10,923個の同定されたタンパク質)を作成し、個々のサンプル25でタンパク質の同定と定量を増加させた。4つの個別サンプルでは、6,673±317.4タンパク質(平均±SD)をSEZで定量し、MEZで6,747±37.7タンパク質を定量した。MSプロテオミクスデータはすべてPRIDE31 パートナーリポジトリを介してプロテオームエクスチェンジコンソーシアムに預け、ここで報告されたプロテオメの受託数はProteomeXchange:PXD016632(http://proteomecentral.proteomexchange.org) です。
全体マウント解剖との比較 全マウント解剖は、標準プロトコル26に従って行われた。ホールマウント解剖では、CSD25と比較して、同様の数のタンパク質(SEZの場合は約6,000個、Cxでは6,000個、グループあたり6,000個)が明らかになった。全体マウント解剖プロトコルの代わりに、SEZにCSDを使用する意図された改善の1つは、潜在的な線条体汚染の減少です。別の領域の組織で汚染されたSEZサンプルでは、有意な濃縮が対象領域および汚染物質から生じる可能性があるため、検出された候補タンパク質を領域に割り当てることができない。免疫学的には、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)の正のミエリンリッチなストリアタムの内部カプセルは、全マウントサンプルでは同定されたが、CSDサンプルではめったに同定されなかった(図2A)。全マウントサンプルの線条体汚染は、SEZ中のミエリンタンパク質の富化を、体性感覚皮質(Cx)グレイマター(GM)サンプルと比較して同定することによって確認できた(図2B)。Cx GMの大部分、特に上位Cx層は、非髄示32であることに注意してください。
大きな繊維束が線条体を通過するにつれて、この領域による汚染はCxと比較してミエリンタンパク質の濃縮をもたらした。SEZサンプル中の線条体汚染のマーカーとして使用されるミエリンタンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)、プロテオ脂質タンパク質1(Plp1)、および2',3'環状ヌクレオチド3'-リンホスホエステラーゼ(Cnp)であった。すべてのミエリンマーカータンパク質は、SEZにおいてCxと比較して有意に濃縮されたが、CSDデータセット内の4つのミエリンマーカータンパク質の比較は、SEZとCxを比較しても有意な差はなかった(図2B)。striatum3のプロテオミクスデータは、全マウント解剖のSEZサンプル中のミエリンタンパク質の濃縮が線条体組織との汚染によって引き起こされたという仮説を支持する。したがって、CSDは、全体のマウント解剖と比較して、線条体組織(コンパクトミエリンが豊富)による汚染を主に防止した。
非解き分け組織の公平なプロテオーム分析は、興味深い細胞外タンパク質を明らかにすることができます。CSDを用いた解剖の改善により、細胞外関連タンパク質は、全ての取り付けサンプルと比較してサンプル中に有意に富化された(図2C、注釈濃縮試験)。CSDおよびホールマウント解剖は、遺伝子オントロジー(GO)用語「細胞外帯エキソソーム」および「細胞外領域部分」の同等の濃縮を示す。しかし、GO用語「Matrisome関連」は、全体のマウント解剖よりもCSDでわずかに豊かである。従って、ECMクロス結合酵素及び最近発見された神経新生レギュレータトランスグルタミナーゼ-2(Tgm2)は、CSD25を用いたCxと比較してSEZにおいて濃縮されたことがわかった。これに対し、全体マウント解剖で得られたSEZサンプルとCxサンプルの間に差は見つからなかった(図2D)。striatum33のプロテオミクスデータは、全山解離による神経新生レギュレータTgm2の検出が線条体組織との汚染によって妨げられたという仮説を支持する。したがって、全体的に、クライオセクション解剖は成功したが、ニッチ特異的なプロテオーム分析のための標準的な解剖にも必要な改善である。
レーザー捕捉顕微鏡との比較 SEZの前半分と3つの成体マウスのMEZがLCM用に得られた(図3A)。全体的に、LCM法は、特に組織の摂動および効率に関して、いくつかの欠点を示す。解剖顕微鏡下で対象領域を可視化するには、バックグラウンド染色が必要であり、対象となる小さなまたは可溶性のタンパク質、例えば、成長因子、サイトカイン、または酵素などのECM調節因子を洗い流す可能性がある。さらに、スライドはレーザー除去の間室温で様々な時間を費やす。さらに、レーザー自体が目的のタンパク質を変性させる可能性があります。
CSDは、解剖を実行するために必要な時間と労力に関してLCMよりもかなりの利点があります:プロトコルのステップ1は、CSDとLCMの両方で同様に実行する必要があります。このステップがなければ、心室壁は付着したままであり、MEZおよびSEZサンプルの分離を困難にする。CSDセクション(100 μm)がLCMセクションの最大厚さ34 (15 μm)よりも6〜7倍厚いことを考えると、ステップ2(脳の切片)およびステップ3(各コロナセクションからMEZとSEZを取り除く)はLCMのために少なくとも6〜7倍長くなります。必要なバックグラウンド染色とレーザー顕微鏡の設定は、追加の時間を消費します。ここでは、CSDによる4動物のSEZおよびMEZの100%と比較して、LCMによる3匹の動物のSEZおよびMEZの50%を収穫するのに3倍の時間がかかり、CSDの8倍の速度の利点を構成した。要約すると、LCMは、追加の労力の顕著な量を必要とするだけでなく、組織はまた、操作と温度変化の実質的に長い期間を受ける、その後の分析によって生成されるデータのダイナミクスと信頼性を損なう可能性があります。
CSDのMS結果を、レーザー捕捉マイクロディスセクション(LCM)の結果と比較した。両方のデータセットは、CSDサンプルをプールすることによって生成されたプロテオミクスライブラリに一致した。平均して、LCMはSEZおよび内側室領域の3,441±270.0および3,613±238.7個の個々のタンパク質をそれぞれ生み出した(図3B)。タンパク質同定の顕著な違いを考えると、主成分分析(PCA)は、解剖方法に従って明確な分離を示した(成分1:62.7%、図示しない)。コンポーネント2は、LCMサンプルの中でSEZとMEZの最大の分離を示した(8.5%、 図3C)。コンポーネント 3 は LCM と CSD を分離しているようです。しかし、この違いは、同定されたタンパク質の数(6.4%)ではなく、方法ベースの違いから生じる可能性があります。それにもかかわらず、全体的な地域分離は、凍結解剖データにとって顕著に明確であり、LCMよりも非常に優れたままでした。データダイナミクスにおけるこの不一致は、レーザー解剖中に室温で標本が過ごした異なる時間、またはその後のプロテオミクスプロトコルおよび質量分析測定における変動性に対する小組織量のより高い感受性から生じる可能性がある。
ECMのプロテオームプロファイルの違いを探すために、CSDとLCMの間で2D注釈濃縮試験を行いました(図3D)。LCMとCSDサンプル間のGO用語の相対的な富化を計算することで、組織の量が不均一であり、解剖プロトコルの違いにもかかわらず、2つの方法間のECMタンパク質クラスターの相対的なプロテオームダイナミクスの比較が可能になります。プロットはLCMとCSDの間の良好な相関関係を明らかにする。注釈「細胞外領域部分」および「細胞外膜結合オルガネラ」は、同様に方法および領域の両方で富化される。したがって、LCMの時間需要の増加は、ECM関連タンパク質に対する比較的高い感度によって補償されているようには見えません。代わりに、CSDは、神経新生およびSEZ関連ECMタンパク質Tgm2、トロンボシン4(Thbs4)、S100a6、およびテナシンC(Tnc)のサンプルデータを比較する際に、より堅牢な同定/定量化を提供します(図3E)。TnCの場合、全てのサンプルで定量化されたが、MEZと比較してSEZに対しての濃縮を表示したのはCSDのみである。それにもかかわらず、SEZ関連の基底膜タンパク質ニドゲン-1(Nid1)、ラミニンサブユニットβ-2(Lamb2)、および基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質(Hspg2)35は、CSDサンプル(図示されていない)よりもLCMサンプル中のSEZ(MEZと比較して)でさらに堅牢な濃縮を示した(図示されていない)。したがって、CSDは、組織の完全性やタンパク質の損失を心配することなく、合理的な時間枠でSEZ特性評価のための正確で深い定量プロテオームを提供する組織サンプルを提供することができます。
統計学 統計テスト、2D注釈濃縮テスト、PCAはペルセウス環境で行われました。少なくとも1つのサンプルで各方法に対して有効な値が検出された場合、タンパク質が分析に含まれていた。タンパク質の存在量と数の比較は、データ解析ソフトウェアを使用して視覚化されました( 材料表を参照)。タンパク質比較のために偽発見率(FDR)の順列ベースの制御(FDRを0.05、250無作為化に設定)を採用した。2D注釈濃縮テスト36では、表示されたGO項が大幅に充実します(FDRはベンジャニ・ホッホベルグFDR制御法を使用して0.02に設定されました)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig01.jpg"> 図1: 極低温切除解法. (A)対象領域の概要:神経原性SEZと非神経原性MEZを有する側心室。Dcxで免疫化された神経芽細胞(B)OBのステップワイズ除去、前極、皮質、および脳梁が心室および脈絡叢の上に:1.解剖培地への配置、OBの除去、3.前部の外皮の除去、5.上の心室の前部の切開、5. 6.心室壁の広がり。(C)新鮮な凍結マウス脳の100μmのコロナスライス、(1.)前および(2.)氷冷メスで心室壁を除去した後。スケールバー= 4 mm (D) 側心室のコロナ部分の染色 (GFAP: 緑;DAPI: 青)、CSDで解剖されたSEZおよびMEZを示す。スケールバー= 300 μm (A), 200 μm (D).略語: CSD = クライオセクション解剖;SEZ = 皮下ゾーン;MEZ = 中間エペンディマルゾーン;DCX = ダブルコルチン;OB = 嗅球;GFAP = グリア性フィブリル酸タンパク質;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig02.jpg"> 図2:全山解剖と比較したクライオセクション解剖による優れた解離精度(A)全山解離で得られたSEZ試料の免疫学的画像(左)。ミエリンが豊富な線条体組織を含めることは、MAG(緑色)に対する染色によって可視化される。CSDで解剖されたSEZの染色(右)CSDでは、ほぼすべての線条体ミエリン(MAG、緑色に対する染色)がサンプルリボンから除外されます。核はDAPI(青色)を用いて可視化した。(B) SEZ と Cx のミエリン マーカー エンリッチメントの全マウントからの比較 (MBP: p = 0.0074;MAG: p = 0.0016;Plp1: p = 0.0011;CNP: p = 0.0029) および CSD (MBP: p = 0.0667;MAG: p = 0.0236;Plp1: p = 0.3420;CNP: p = 0.1842)。(C) CSD-SEZ サンプルと全体マウント SEZ を比較する 2D アノテーションエンリッチメント テスト。GO用語細胞外空間とMatrisome関連は、全体のマウントデータよりもCSDデータでより豊かにされています。(D) 全マウント解剖およびCSDのためにプロットされたNSCレギュレータTgm225のタンパク質の存在量。Tgm2 は、CSD の Cx と比較して SEZ で大幅に濃縮されます (CSD: p = 0.0029;全体マウント: p = 0.1775)。BおよびDの場合:参照として、シャルマら33からのプロテオームデータは、全山およびCSDサンプルに表示される対応するタンパク質についてプロットされた線条体および皮質の測定値を有する。スケールバー = 200 μm(A)。略語: CSD = クライオセクション解剖;SEZ = 皮下ゾーン;MAG = ミエリン関連糖タンパク質;Cx = 体性感覚皮質;MBP = ミエリン塩基性タンパク質;Plp1 = プロテオ脂質タンパク質 1;CNP = 2',3'-環状ヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ;GO = 遺伝子オントロジー;NSC = 神経幹細胞;Tgm2 = トラングルタミナーゼ 2;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール;LFQ = ラベルなしの数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig03.jpg"> 図3: SEZおよびMEZのレーザー捕捉前後のLCM(A)クレシルスミッレ染色と比較して、クライオセクション解剖による細胞外タンパク質定量が改善された(左)。比較のために、SEZとMEZのCSD切開(右)。スケールバー= 150 μm(B) CSDおよびLCMからのSEZおよびMEZサンプル中の検出されたタンパク質の数の比較。データは、CSDとLCM(分散の成分2:8.5%)、成分3:6.4%を比較するSEZおよびMEZサンプルのSD.(C)主成分分析の平均±として提示される。(D) クライオセクションおよびレーザー解剖 MEZ (上) および SEZ (下部) の 2D 注釈濃縮。GO用語細胞外細胞小器官および細胞外領域部分は有意に富化される(赤色の点)。(E) LCMのSEZおよびMEZにおける細胞外SEZ関連マーカータンパク質の存在量(Tnc: p = 0.3789)およびCSDサンプル(Tgm2:p = 0.2940;S100a6: p = 0.0218;THBS4: p = 0.3941;Tnc: p = 0.0004)。略語: CSD = クライオセクション解剖;LCM =レーザー捕捉-マイクロディシスSEZ = 皮下ゾーン;MEZ = 中間エペンディマルゾーン;GO = 遺伝子オントロジー;Tnc = テナシン-C;Tgm2 = トランスグルタミナーゼ 2;S100a6 = S100カルシウム結合タンパク質 A6;THBS4 = トロンボシン-4;LFQ = ラベルなしの数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

極度切除は、深い定量的プロテオーム分析のために、マウス脳内で最大の神経原性ニッチの新鮮な凍結製剤を可能にする。この方法は正確で効率的であり、最小限の組織摂動を引き起こす。そのため、このニッチの分子微小環境や、他の臓器、領域、種の研究に最適です。

正確で深い定量プロテオーム分析のための成人皮下帯のクライオセクション解剖

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

我々の解剖法は、心室神経原性ニッチの正確な単離を可能にし、したがって、このニッチの分子微小環境を研究するのに適している。この解剖方法の主な利点は、正確で効率的であり、プロテオーム分析のための質量分析と互換性がある間、最小限の組織摂動を引き起こすということです。このプロトコルでは、マウスの脳から心室の神経性ニッチを抽出しますが、この方法は他の種や健康や病気の様々な状態にも適用できます。このテクニックには、いくつかのトレーニングが必要な場合があります。特に、心室神経原性ニッチを露出して抽出するときのメスカットで。8〜10週齢のC57黒/6オスマウスを安楽死させた後、手動解剖によって脳を抽出し、氷冷解剖培地を含む培養皿に入れる。メスを使用して、嗅球と皮質の内極の間にまっすぐなコロナカットを行うことによって嗅球を取り除きます。次に、コロナカットを行って皮質の前極を取り除き、側心室がコロナ平面に見えるようにします。次に、はさみを使用して、側側心室を皮質表面から心室内腔に開始して、上から両方の側心室を開く。この切り口は、心室屈曲に続いてC字型にして伸ばします。次に、左右の矢状切開部の尾端を接続し、追加のコロナカットを採用する。次に、心室壁を覆う皮質と脳梁を取り除く。組織が心室壁に取り付けられている場合は、追加の切り傷を行うか、組織を取り除くためにはさみで皮質と脳梁を持ち上げます。次に鉗子を使用して、側心室を覆う皮質および脳梁を取り除く。鉗子を使用して、慎重に心室の壁を広げ、脈絡叢を除去する。次に、ガラススライドの上に脳を置き、ドライアイスの上にスライドを置き、オープン構成の心室壁で脳を凍結します。切除する前に、脳が凍結組織用の埋め込み媒体を備えた後部脳のクライオスタット付着プレートに取り付けられていることを確認してください。さらに、埋め込み培地が前脳、特に心室に接触しないようにしてください。次いで、脳の50~100マイクロメートルの厚さのコロナ部分を横心室の終わりまで切り取り、その切片をスライドガラスに取り付けます。ガラススライドをドライアイスの上に置き、解剖顕微鏡で下さい。ドライアイスからスライスを15〜30秒間持ち上げて、短くて不完全な解凍を達成し、線条体のコンパクトミエリンを密な白い点として観察します。次に、あらかじめ冷却されたメスを使用して、隣接する線条体から皮下ゾーンを分離し、冷却されたメスの鈍い端を使用して、それを全体の部分として、または2〜4個に切り離してマイクロ遠心管に移します。その後、内側の心室ゾーンに対して同じことを行います。ミエリンに関連する、線条体の糖タンパク質陽性の内部カプセルは、全マウントサンプルで同定されたが、免疫体系化学を介したクライオセクション解剖サンプルではめったに同定されなかった。全山サンプル中の線条体汚染は、体性感覚皮質サンプルと比較して、腹膜領域におけるミエリンタンパク質の濃縮によって確認された。対照的に、クライオセクション解剖サンプルにおけるこれらのミエリンマーカータンパク質の比較は、皮下帯および体性感覚皮質サンプルに有意な差を示さなかった。質量分析結果をクライオセクション解剖とレーザー捕捉マイクロ解剖の結果を比較すると、レーザー捕捉マイクロ解剖は定量化されたタンパク質の約半分を生み出したが、組織採取時間は約2倍であった。原理成分分析は、円として描かれた凍結セクション解剖で収集されたものよりも、正方形として描かれたレーザー捕捉マイクロ解剖で収集されたサンプルの間で大きな変動性があることを明らかにした。皮下および内側のエペンディマルゾーンのクライオセクション解剖とレーザーキャプチャマイクロ解剖の間の2D注釈濃縮試験は、細胞外空間に関連するタンパク質の方法と領域の両方で同様の濃縮を明らかにした。クライオセクション解剖は、皮下ゾーン関連細胞外マトリックスタンパク質における神経新生のより強固な同定と定量化を提供する。テナシンCの場合、クライオセクション解剖のみが、内側のエペンディマルゾーンと比較して、皮下帯に濃縮を示した。スライド上の脳のセクションが完全に解凍されないことを確認します。全体的に、一貫した結果を得るために、解剖手順の手順を実践することをお勧めします。解剖方法は、成長因子やサイトカインなどの非常に低い豊富なタンパク質を容易に検出できる他のタンパク質分析方法と併用することもできます。このマイクロディセクション法は、新しい神経新生調節因子を同定することを可能にし、他の人が様々な文脈で神経新生の他の調節因子を同定することを可能にすると信じています。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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