Name: cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis
Uploaded: 2021-10-07T15:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis at JoVE.com

Vi ønsker oppriktig å takke Mathias Mann for at vi lot oss utføre store deler av eksperimentene i laboratoriet hans, Fabian Coscia for hjelp med LCM og proteomanalyse, Tatiana Simon-Ebert for hele disseksjoner, og Korbinian Mayr og Igor Paron for deres tekniske hjelp. Vi anerkjenner takknemlig finansiering fra det tyske forskningsrådet til MG (SFB870, TFR274), EU (Eranet S-700982-5008-001), ERC (aERC "NeuroCentro" til MG), Swedish Society for Medical Research (SSMF, to JK) postdoktorstipend, og KI foundations and Funds (2020-01351, til JK).

Alle eksperimentelle prosedyrer i denne studien ble utført i samsvar med tyske og EU-retningslinjer og ble godkjent av den institusjonelle dyrepleiekomiteen og regjeringen i øvre Bayern (Regierung von Oberbayern). Bare mannlige C57Bl6-mus mellom 8-10 uker ble brukt til forsøkene.
1. Forberedelse av musehjernen (~ 15 min per mus)
<ol><li>Forbered disseksjonsmediet ved å tilsette 5 ml 1 M HEPES (sluttkonsentrasjon 10 mM) til 500 ml 1x Hanks balanserte saltløsning (HBSS). MERK: Oppbevaringstiden til disseksjonsmediet (+4 °C) bør ikke overstige 2 uker.</li>
	<li>Ofre musene ved cervical dislokasjon og forsiktig dissekere hjernen. MERK: Når du undersøker ECM, bør vevet fortrinnsvis være umodifisert. Cervical dislokasjon holder avhandlingen tid så kort som mulig, og dermed hindre post-dødelig enzymatisk autodigestion så mye som mulig. Hvis fjerning av blod er kritisk for forskningsspørsmålet, bare perfuse musen transcardialt med fosfatbufret saltvann (PBS) før du fjerner hjernen.</li>
	<li>Trekk ut hjernen ved manuell disseksjon og legg den i en kulturrett som inneholder iskald disseksjonsmedium (figur 1B - 1). MERK: Hold hjernen i disseksjonsmedium på is gjennom hele disseksjonen.</li>
	<li>Fjern den olfaktoriske pæren (OB) med en skalpell (figur 1B - 2) med et rett koronalsnitt mellom OB og den fremre polen på cortexen.</li>
	<li>Fjern fremre pol av cortex med skalpellen ved hjelp av et koronal kutt for å gjøre laterale ventrikler synlige i koronalplanet (figur 1B - 3). MERK: Pass på at koronalsnittet er laget ~ 5 mm rostrally fra den optiske chiasmen; Ellers vil den rostrale delen av SEZ / MEZ gå tapt.</li>
	<li>Bruk saks, åpne begge laterale ventrikler fra toppen, og start med en sagittal del fra kortikaloverflaten til ventrikulær lumen, og forlenge dette kuttet på en c-formet måte etter ventrikulær fleksjon (figur 1B - 4).</li>
	<li>Koble de kaudale endene av venstre og høyre sagittal snitt ved hjelp av et ekstra koronal kutt med saksen. MERK: De tre kuttene danner nå en trapesformet og vil lette fjerningen av cortex og corpus callosum i neste trinn.</li>
	<li>Fjern cortex og corpus callosum som dekker laterale ventrikler ved hjelp av tang (figur 1B - 5). Fjern deretter cortex og corpus callosum som dekker medial ventrikulære vegger. Her, gjør ytterligere kutt hvis vevet er festet til medialt ventrikkelvegger, eller bare løft cortex og corpus callosum med saks for å løsne vevet.</li>
	<li>Spred forsiktig ventrikkelveggene med tang (figur 1B - 6). Fjern choroid plexus med tang. MERK: Fullstendig fjerning av choroid plexus er viktig for å unngå interferens med følgende disseksjonstrinn og unngå potensiell forurensning av SEZ/MEZ-prøvene.</li>
	<li>Sett hjernen på en glasssklie og legg glasssklie på toppen av tørris for å fryse hjernen. Vedlikehold ventrikkelveggene i den åpne konfigurasjonen. MERK: Sørg for nok avstand mellom side- og medialveggene på ventrikelen for å lette presis og eksklusiv disseksjon av SEZ og MEZ. Hvis vevet trekker seg tilbake til en lukket konfigurasjon, bruk tangene til å fikse veggene i ønsket posisjon under frysing. Unngå skade på SEZ/MEZ. Prøv å bruke minimal kraft, hovedsakelig på øvre kant av de åpnede ventriklene.</li>
</ol>2. Seksjonering av den tilberedte hjernen (~ 15 min per mus)
<ol><li>Klipp 50-100 μm tykke koronal deler av hjernen til slutten av lateral ventrikelen ved hjelp av en kryostat og monter seksjonene på glasssklier. Forsikre deg om at hjernen er festet til kryostatfesteplaten på bakbremsen med OCT-medium, og at ingen OCT kommer i kontakt med forebrain, spesielt ved ventriklene. MERK: OCT-medium vil forstyrre MS-målinger. Men hvis vevet skal brukes til en antistoffanalyse, er det unødvendig å utelukke OCT-medium. Bruk av belagte glasssklier anbefales ikke. Belagte lysbilder bruker for mye limkraft på vevet, og hindrer dermed translokasjonen av vevsprøven fra lysbildene inn i mikrocentrifugerøret i de følgende trinnene.</li>
</ol>3. Frihånds disseksjon av hjerneskiver (~ 30 min per mus)
<ol><li>Plasser glasssklier med hjerneseksjonene på tørris under et disseksjonsmikroskop (figur 1C - 1).</li>
	<li>Forbered mikrosentrifugerørene på tørris, og sørg for at rørene holder seg på tørris i minst 1 min for å være tilstrekkelig kalde før prøveoverføring. MERK: Bruk mikrosentrifugerør av høy kvalitet, da noen rør av lav kvalitet kan kaste plast i de påfølgende vevsfordøyelsestrinnene forbundet med MS-målinger.</li>
	<li>Løft skivene fra tørrisen i 15-30 s for å oppnå en kort, ufullstendig opptining for å gjøre den kompakte myelinen i striatum observerbar som tette hvite prikker. MERK: Det blir mulig å finne grensen mellom SEZ og striatum (figur 1C - 2, se figur 2A for utelukkelse av myelin og en sammenligning med metoden for hele forsamlingen). Hvis opptining tar for lang tid, kan prosessen akselereres ved å trykke en hanskedekket finger på motsatt side av glasssklie. Denne manøveren bør imidlertid praktiseres da overdreven opptining skjer lett.</li>
	<li>Skill SEZ med en ferdigkjølt skalpell fra det tilstøtende striatumet (figur 1C,D).</li>
	<li>Overfør SEZ enten som et helt stykke eller seksjonert i 2-4 deler til et mikrosenterrør ved å bruke den stumpe kanten på den avkjølte skalpellen. Hvis vevet skal brukes til en annen type analyse annet enn MS, overfør vevsprøven til riktig beholder i stedet (f.eks. en 96-brønnsplate). MERK: Kutting av det helt frosne vevet kan føre til at vevet raskt brekker bort og faller av skredet. Kutting av helt tint vev fører til oppløsning av vevet. Forsikre deg om at vevet verken er helt frosset eller helt tint.</li>
</ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser

CSD-metoden gjorde det mulig å nøyaktig trekke ut SEZ-vev og generere en pålitelig proteom med betydelig dybde ved hjelp av MS. CSD viser en klar fordel sammenlignet med full desinfeksjon når det gjelder sterkt redusert striatal forurensning av SEZ-prøver og ekstracellulær proteinberikelse. Siden det også er mulig å oppdage et lignende antall proteiner i individuelle prøver (~ 6500 proteiner per prøve) med CSD og full demontering, er tilleggstiden for CSD vel verdt innsatsen. LCM gir mer presis SEZ-disseksjon, men nådde en lavere proteomdybde, med bare 3500 proteiner per prøve til tross for at de brukte samme MS-protokoll som CSD (bibliotekmatching og etikettfri kvantifisering). Det er viktig at variasjonen var mye større, sannsynligvis på grunn av den åttedoble lengre tilberedningstiden per prøve. PCA av prøvene oppnådd av LCM og CSD avslører en klar separasjon av begge metodene med tette regionspesifikke klynger robust skilt fra hverandre. I motsetning viste LCM-prøvene en mer spredt distribusjon, noe som sannsynligvis delvis skyldes lengden på forberedelsen. Det er uklart om innsamling av langt flere prøver over en lengre periode ville gitt et proteom av lik robusthet og dybde med LCM. Beregning av et estimat, innsamling av et lignende prøvevolum som gjort for CSD ville ta 5-8 ganger lengre tid med LCM, selv opptil 15 ganger lenger hvis prøver gitt for peptidspektrabibliotekene ble inkludert, og mye av det under opptinte forhold. Videre, med tanke på de ekstra perturbasjonene av vevet som er nødvendig for LCM (bakgrunnsfarging, laser disseksjon), ga LCM lite, om noen, gevinst over CSD. Derfor kan CSD anses som mer egnet for ekstracellulær proteomforskning, spesielt for SEZ.
Spesielt hvis interesseområdet er mindre enn SEZ (f.eks. undersøker bare det ependymale cellelaget), faller en frihåndstilnærming bak nøyaktigheten til LCM. For eksempel er det vanskelig å bruke CSD til å skille det ependymale fra det subependymale laget, da det ependymale laget bare er en cellediameter bred, og avgrensningen mot det subependymale laget er ikke synlig for det blotte øye i ferskt frossent vev. Derfor vil LCM være et bedre valg enn CSD hvis en presis disseksjon på en skala under 50 μm er viktigere enn uforstyrret vev eller holder disseksjonstiden kort. For regioner med en bredde på 50 μm og mer er imidlertid presisjonen til CSD sammenlignbar med LCM for ECM proteinanalyse.
CSD har allerede vist seg å være nyttig ved å bidra til undersøkelsen av ECM's funksjonelle rolle i den nevrogene nisje25. Derfor kan fortsatt anvendelse av CSD i SEZ for ulike protein- og proteomundersøkelser (eller til og med enkeltkjerne RNA-sekvensering) føre til deteksjon av ytterligere nevrogeneseregulatorer, stamcelleaktiveringsmarkører og en dypere forståelse av SEZ stamcelle nisjefysiologi. Tatt i betraktning nedgangen i nevrogenese i den aldrende SEZ37, kan en kortfattet analyse av ECM-endringer av SEZ av eldre vs. unge mus fremme forståelsen av de eksakte nisjemekanismene som fremmer NSC-utvikling og vedlikehold38,39. Videre er påvirkning av betennelse og skade på SEZ neurogenese godt etablert40,41,42,43. Berikelsen av blod-avledet fibrinogen i SEZ etter kortikale hjerneskade og dens innflytelse på SEZ astrogliogenese og arrdannelse44 fremhever den potensielle påvirkningen av traumeinduserte mikromiljøet endringer på SEZ stamcelle fysiologi. Derfor kan undersøkelse av SEZ-ECM-proteomet i forbindelse med hjerneskade ved hjelp av CSD bidra til å belyse mekanismene der skade og betennelse påvirker nevrogenese. Det er viktig at metoden også kan være aktuell for nevrogene nisjer i mennesker i helse og sykdom, da ferskt frossent vev ofte kan fås fra operasjoner. Videre, gitt artsforskjellene i voksen neurogenese, ville det også være fascinerende å bruke CSD-metoden på andre arter, for eksempel i forbindelse med striatal neurogenese. Videre, med andre proteindeteksjonsmetoder, kan forskjeller i lokalt produserte vekstfaktorer undersøkes nøyaktig og effektivt ved hjelp av CSD for SEZ og MEZ (f.eks. ELISA).
Til slutt kan disseksjonsprosedyren potensielt modifiseres for nøyaktig utvinning av andre hjerneregioner, også for forskningsspørsmål som ikke er relatert til nevrogenese. For eksempel inkluderer CSD et kort halvt tinende trinn, hvor kompakt myelin er synlig som hvite områder som skiller seg fra det mer gjennomskinnelige gjenværende hjernevevet. Med en enkel modifikasjon av metoden vil denne funksjonen tillate presis disseksjon av bare corpus callosum kompakt myelinvev, som kan bli utsatt for proteomisk analyse av skaderelaterte endringer. Et forslag om en protokollendring som vil tillate corpus callous disseksjon er å utelate trinn 1.5-1.9 av protokollen og fortsette direkte til å forberede koronal seksjoner i stedet for å åpne ventriklene for å gjøre SEZ og MEZ tilgjengelig. Plasser deretter seksjonene på tørris, løft kort og skru opp skivene halvveis, og fjern bare corpus callosum med en skalpell. Dette preparatet skal nå være klart for enhver analyse som krever en effektiv disseksjon av innfødt corpus callosum vev.
Oppsummert presenterer denne studien en mikro-disseksjonsmetode som kan brukes til pålitelig ventrikulær nevrogen nisjeproteomanalyse. Dataene understreker kompatibiliteten og nytten av CSD-metoden sammen med MS-basert proteomisk analyse av SEZ-mikromiljøet. Kombinasjonen av presisjon, effektivitet og minimal vevsperturbasjon gjør CSD til en verdifull forlengelse av eksisterende metoder.

Siden neurogenese er begrenset i den voksne hjernen, vil ulike reparasjonsstrategier i sentralnervesystemet ha stor nytte av økt forståelse av understøttelsene av voksen nevral erstatning. Gnagere har hjulpet oss med å forstå de grunnleggende mekanismene for postnatal neurogenese, selv om det bør bemerkes at voksen nevrogenese er sterkt artsavhengig. Hos mus er det tre voksne nevrale stamceller (NSC) nisjer. Hypothalamus er en voksen NSC nisje med nevrogent potensial1,2, mens kontinuerlig voksen neurogenese er hovedsakelig begrenset til hippocampus3 og SEZ av laterale vegger av laterale ventrikler4,5,6. SEZ er den største germinalregionen som inneholder NSC-er (type B-celler) som utvikler seg til nevroblaster (type A-celler) via transittforsterkningsceller (type C-celler). SEZ inneholder 20-35% av type B-celler, 1-15% av type C-celler, 1-30% av type A-celler og 25-50% av ependymale celler7. SEZ har en kompleks mikroarkitektur, med endotelceller, mikrogliale celler og ependymale celler som bor i og påvirker stamcellenisjen8,9,10. Selv om nevroner er knappe i SEZ, kommer axoner fra fjerne kilder som striatum, det ventrale tegmentalområdet, eller hypothalamus-rekkevidden og påvirker type B-celler4. Et unikt trekk ved denne stamcellenisjen er separasjonen mellom spredningsstedet og differensieringsstedet. Etter spredning migrerer de nevronale forfedrene flere millimeter fra SEZ til den olfaktoriske pæren, hvor de terminalt skiller seg ut i nevroner og integreres i eksisterende nevrale kretser. Undersøkelser av celleintrinsiske programmer knyttet til nevrogenese har allerede gitt kunnskap viktig for eksperimentell terapeutisk celle omprogrammering og transplantasjonsstrategier15,16,17,18,19,20. Imidlertid regulerer celleekstrinsiske signaler også nevrogenese, og vevsmiljøer kan bestemme den nevrogene skjebnen til stamceller11,12,14,21,22,23. Følgelig er undersøkelsen av mikromiljøet av de nevrogene nisjene og dens interaksjon med stamcellene av avgjørende betydning.
Den ekstracellulære matrisen (ECM) og andre utskilte proteiner er en stor del av mikromiljøet. For nøyaktig identifisering og kvantifisering er en proteomisk tilnærming bedre egnet enn en trans transcriptomisk tilnærming for å bestemme ECM-sammensetningen på grunn av den lave korrelasjonen mellom transkripsjon og proteinnivåer for ECM24,25. Videre er det betydelige bevis på at nisjeregulatorer i SEZ ikke utelukkende produseres av celler som fyller nisjen selv. Mer fjerne steder, som choroid plexus, utskiller modulatoriske signaler som overføres til stamcellene via cerebrospinalvæsken22,23. Å undersøke nisjeproteomet kan bidra til å identifisere nisjeregulatorer som er tilstede i nisjen uavhengig av produksjonsstedet, gitt at en betydelig del av det ekstracellulære mikromiljøet er samlet av proteiner.
For å samle murin ventrikkelsonen for objektiv proteomisk analyse, er det nødvendig med en metode med høy presisjon, og fanger ca. 50 μm tynt paraventrikulært bånd som inneholder stamceller mens du ekskluderer vevet til det tilstøtende striatum. Videre må vevsperturbasjon under avhandlingen minimaliseres for å analysere det ekstracellulære mikromiljøet fordi løselige proteiner, inkludert vekstfaktorer eller cytokiner, lett kan vaskes bort. Selv om det er mulig å analysere massespektraet av fast vev, vil det nødvendige middelet, for eksempel paraformaldehyd, redusere proteinidentifikasjonsdybden og kan introdusere posttranslasjonelle modifikasjoner. En vanlig helmontert SEZ-disseksjon, for eksempel for innsamling av celler for fluorescensaktivert cellesorteringsanalyse, fjerner hele SEZ med saks26. Denne standardavhandlingen er rask med minimal vevsperturbasjon. Striatal forurensning av prøvene kan imidlertid ikke unngås. På den annen side har LCM den enestående fordelen med overlegen disseksjonspresisjon. Imidlertid kan LCM introdusere vevsperturbasjoner, for eksempel på grunn av bakgrunnsfarging eller laser forårsaket protein denaturasjon. For å kombinere styrkene til hele disseksjonen og LCM ble det utviklet en ny metode som er kompatibel med MS, kalt kryo-seksjons-disseksjon (CSD), (figur 1A-D). CSD tillater utvinning av SEZ og disseksjonen av SEZ av medialveggene til laterale ventrikler (MEZ), som er et ideelt, for det meste ikke-nevrogen kontrollområde for SEZ (se protokollen). Nisjeproteomet oppnådd ved kombinasjonen av CSD og toppmoderne MS-metoder viste seg å være nyttig for karakterisering og identifisering av nye regulatorer i denne voksne NSC-nisjen25. Derfor vil denne metoden være nyttig for bestemmelse av SEZ vev proteinsammensetning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryostat CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td>cat. no. BPB018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>cat. no. 0030123344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical disposable scalpels</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>cat. no. 5518083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes 60 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>cat. no. 633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>cat. no. A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. AB2253,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-GFAP 1:500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-MAG 1:400</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MAB1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 9</td>
			<td>GraphPad Software, San Diego California USA</td>
			<td></td>
			<td>www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perseus Version 1.6.10.50</td>
			<td>Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis

Den subependymale nevrogene nisjen består av et paraventrikulært bånd av den laterale ventrikkelveggen til lateral ventrikelen. Den subependymale sonen (SEZ) er et tynt og tydelig område utsatt for ventriklene og cerebrospinalvæsken. Isolasjonen av denne nisjen tillater analyse av et nevrogent stamcellemikromiljø. Imidlertid er utvinning av små vev for proteomanalyse utfordrende, spesielt for vedlikehold av betydelig måledybde og oppnåelse av pålitelig robusthet. En ny metode kalt kryo-seksjon-disseksjon (CSD), som kombinerer høy presisjon med minimal vevsperturbasjon, ble utviklet for å løse disse utfordringene. Metoden er kompatibel med toppmoderne massespektrometri (MS) metoder som tillater påvisning av lav-rikelig nisjeregulatorer. Denne studien sammenlignet CSD og dens proteomdata med metoden og dataene som ble innhentet ved laserfangstmikrodisseksjon (LCM) og en standard fullmontert disseksjon. CSD-metoden resulterte i dobbelt kvantifiseringsdybde på mindre enn halvparten av tilberedningstiden sammenlignet med LCM og utkonkurrerte samtidig klart disseksjonspresisjonen til hele demonteringen. Derfor er CSD en overlegen metode for å samle SEZ for proteomanalyse.

Når du følger trinnene ovenfor, er vevsprøvene i mikrosenterrørene klare for og kompatible med MS-prøvepreparering. Etter prøvepreparering fikk vi ~ 5-7 μg peptider per prøve av enten SEZ eller MEZ per mus. De endelige mengdene av peptidene kan imidlertid avhenge av MS-tilberedningsmetoden. I proteomsammenligningene nedenfor ble proteinidentifikasjons- og kvantifiseringsdybden (500-1000 proteiner per prøve) økt ved beregningsmessig å matche peptidspektraet til peptidspektrabiblioteker opprettet for hver vevsregion25,27. Spesielt er den tapsfrie nanofraksjoneringsmetoden som brukes her for opprettelsen av peptidspektrabibliotekene for tiden ikke kommersielt tilgjengelig. De rå MS-dataene ble analysert ved hjelp av MaxQuant-programvaren28, og oppnådde massenøyaktigheter i delene per milliard rekkevidde29. Max Quant-miljøet tillater samsvar mellom MS-kjøringer. Proteinoverflod ble kvantifisert ved hjelp av en etikettfri kvantifiseringsalgoritme30. Immunhiistokjemisk farging ble gjort på ferskt frossent vev og utført som tidligere rapportert25 (se materialtabellen).
Kryo-seksjon-disseksjon Den komplette SEZ og MEZ av voksne mus (n = 4) ble oppnådd ved hjelp av CSD (se figur 1 og protokoll). Den somatosensoriske cortex (Cx) ble dissekert med kirurgisk saks. Ytterligere 4 mus ble dissekert på samme måte; Imidlertid ble det dissekerte vevet samlet i en prøve per region for å lage proteombiblioteket (10 923 identifiserte proteiner) for økt proteinidentifikasjon og kvantifisering i de enkelte prøvene25. I de fire individuelle prøvene ble (gjennomsnittlig ± SD) 6673 ± 317,4 proteiner kvantifisert i SEZ og 6 747 ± 37,7 i MEZ. Alle MS-proteomikkdataene ble deponert i ProteomeXchange Consortium via PRIDE31-partnerlageret , og tiltredelsesnummeret for proteomene som rapporteres her er ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).
Sammenligning med full demontering av disseksjon Full demontering ble utført i henhold til en standardprotokoll26. Wholemount disseksjon avdekket et tilsvarende antall proteiner (ca. 6000 for SEZ og 6000 for Cx, n = 4 per gruppe) sammenlignet med CSD25. En av de tiltenkte forbedringene ved bruk av CSD for SEZ, i stedet for en heltmontert disseksjonsprotokoll, er reduksjonen av potensiell striatal forurensning. I SEZ-prøver forurenset med vev fra en annen region, kan oppdagede kandidatproteiner ikke tildeles en region, da betydelig berikelse kan skyldes interesseområdet og forurenseren. Immunhiistokjemisk ble de myelin-assosierte glykoprotein (MAG) positive myelinrike indre kapslene i striatum identifisert i hele 100-prøvene, men sjelden i CSD-prøvene (figur 2A). Striatal kontaminering i hele stmount-prøvene kan bekreftes ved å identifisere berikelsen av myelinproteiner i SEZ sammenlignet med de somatosensoriske cortex (Cx) Grey Matter (GM)-prøvene (figur 2B). Vær oppmerksom på at store deler av Cx GM, spesielt de øvre Cx-lagene, er unmyelinated32.
Ettersom store fiberbunter passerer gjennom striatum, resulterte forurensning av denne regionen i berikelse av myelinproteiner sammenlignet med Cx. Myelinproteinene som ble brukt som markører for striatal forurensning i SEZ-prøvene var det myelinbaserte proteinet (MBP), det myelin-assosierte glykoproteinet (MAG), proteolipidproteinet 1 (Plp1) og 2',3'-syklisk-nukleotid 3'-fosfodiesterase (Cnp). Alle myelinmarkørproteiner ble betydelig beriket i SEZ sammenlignet med Cx. Omvendt ga sammenligninger for de fire myelinmarkørproteinene i CSD-datasettet ingen signifikante forskjeller når man sammenlignet SEZ med Cx (figur 2B). Proteomiske data fra striatum33 støtter hypotesen om at berikelsen av myelinproteiner i SEZ-prøvene av hele disseksjonen var forårsaket av forurensning med striatalt vev. Derfor forhindret CSD i stor grad forurensning av striatalt vev (rik på kompakt myelin) sammenlignet med en heltmontert disseksjon.
Objektiv proteomanalyse av ikke-dissosiert vev kan avsløre interessante ekstracellulære proteiner. Med forbedret disseksjon ved hjelp av CSD ble ekstracellulære assosierte proteiner betydelig beriket i prøvene sammenlignet med hele utvalgene (figur 2C, annotningsberikelsestest). CSD- og wholemount-disseksjonen viser en sammenlignbar berikelse av gen ontologi (GO) begrepene "ekstracellulært vesikulært eksosom" og "ekstracellulær regiondel". Imidlertid er GO-begrepet "Matrisome-associated" litt mer beriket i CSD enn i hele demonteringen. Følgelig ble ECM kryssbindende enzym og nylig oppdaget neurogenese regulator transglutaminase-2 (Tgm2) funnet beriket i SEZ sammenlignet med Cx ved hjelp av CSD25. Det ble derimot ikke funnet noen forskjell mellom SEZ- og Cx-prøver oppnådd ved hele demonteringen (figur 2D). Proteomiske data fra striatum33 støtter hypotesen om at påvisning av nevrogeneseregulatoren Tgm2 ved fullmount disseksjon ble hindret av forurensning med striatalt vev. Derfor er kryo-seksjon-disseksjonen en vellykket, men også nødvendig forbedring av standard disseksjonen for nisjespesifikk proteomanalyse.
Sammenligning med Laser-capture-mikroskopi Den fremer halvdelen av SEZ og MEZ av 3 voksne mus ble oppnådd for LCM (figur 3A ). Totalt sett har LCM-metoden noen ulemper, spesielt når det gjelder vevsperturbasjon og effektivitet. For å visualisere interesseområdet under disseksjonsmikroskopet, er bakgrunnsfarging nødvendig, og potensielt vaske bort små eller oppløselige proteiner av interesse, for eksempel vekstfaktorer, cytokiner eller ECM-regulatorer som enzymer. Videre bruker lysbilder varierende tider ved romtemperatur under laserfjerning. Dessuten kan laseren selv denaturere proteiner av interesse.
CSD har en betydelig fordel i forhold til LCM når det gjelder tid og krefter som er nødvendig for å utføre disseksjonen: trinn 1 i protokollen må utføres på samme måte for både CSD og LCM; uten dette trinnet forblir ventrikulære vegger tilhenger, noe som gjør separasjonen av MEZ- og SEZ-prøver vanskelig. Gitt at CSD-seksjonene (100 μm) er 6-7 ganger tykkere enn maksimal tykkelse34 av LCM-seksjonene (15 μm), vil trinn 2 (seksjonering av hjernen) og trinn 3 (fjerning av MEZ og SEZ fra hver koronaldel) ta minst 6-7 ganger lengre tid for LCM. Den nødvendige bakgrunnsfargingen og oppsettet av lasermikroskopet vil forbruke ekstra tid. Her tok det tre ganger lengre tid å høste 50% av SEZ og MEZ av 3 dyr av LCM sammenlignet med 100% av SEZ og MEZ av 4 dyr av CSD, som utgjør en åtte ganger hastighetsfordel med CSD. Oppsummert krever LCM ikke bare en betydelig mengde ekstra innsats, men vevet blir også utsatt for en betydelig lengre periode med manipulering og temperaturendringer som kan kompromittere dynamikken og påliteligheten til data generert ved etterfølgende analyse.
MS-resultatene av CSD ble sammenlignet med resultatene fra laserfangstmikrodeseksjonen (LCM). Begge datasettene ble matchet med det proteomiske biblioteket som ble generert ved å gruppere CSD-prøver. I gjennomsnitt ga LCM 3 441 ± henholdsvis 270,0 og 3 613 ± 238,7 individuelle proteiner i henholdsvis SEZ- og medial ventrikkelsonen (figur 3B). Gitt den bemerkelsesverdige forskjellen i proteinidentifikasjon, viste hovedkomponentanalyse (PCA) tydelig separasjon i henhold til disseksjonsmetoden (komponent 1: 62,7%, ikke vist). Komponent 2 viste størst separasjon for SEZ og MEZ blant LCM-prøvene (8,5 %, bilde 3C). Komponent 3 ser også ut til å skille LCM og CSD; Denne forskjellen kan imidlertid skyldes metodebaserte forskjeller i stedet for antall identifiserte proteiner (6,4 %). Likevel forble den samlede regionale separasjonen påfallende tydelig for kryo-disseksjonsdataene og langt bedre enn for LCM. Denne uoverensstemmelsen i datadynamikken kan skyldes forskjellige tider brukt av prøvene ved romtemperatur under laserspredningen eller en høyere følsomhet for små vevsmengder til variasjon i de påfølgende proteomiske protokollene og massespektrometrimålingene.
For å søke etter forskjeller i proteomprofilen til ECM ble det utført en 2D-merknadsberikelsestest mellom CSD og LCM for SEZ og MEZ (figur 3D). Beregning av den relative berikelsen av GO-termer mellom LCM- og CSD-prøver gjør det mulig å sammenligne relativ proteomdynamikk i ECM-proteinklyngene mellom de to metodene til tross for ulik mengde vev og forskjellene i disseksjonsprotokollen. Plottene viser en god sammenheng mellom LCM og CSD. Merknadene "extracellular region part" og "extracellular membrane-bound organelle" er tilsvarende beriket i både metoder og regioner. Derfor ser det ikke ut til at den økte tidsbehovet til LCM kompenseres av en relativt høyere følsomhet for ECM-assosierte proteiner. I stedet gir CSD mer robust identifisering/kvantifisering ved sammenligning av prøvedata for nevrogenesen og SEZ-assosierte ECM-proteiner Tgm2, Trombospondin-4 (Thbs4), S100a6 og Tenacin-C (Tnc) (figur 3E). Når det gjelder TnC, selv om det er kvantifisert i alle prøver, viste bare CSD berikelse for SEZ sammenlignet med MEZ. Likevel viste de SEZ-assosierte basale membranproteinene Nidogen-1 (Nid1), Laminin subenhet beta-2 (Lamb2) og kjellermembranspesifikke heparansulfatproteoglykankjerneprotein (Hspg2)35 en enda mer robust berikelse i SEZ (sammenlignet med MEZ) i LCM-prøvene enn i CSD-prøvene (ikke vist). Derfor kan CSD gi vevsprøver som gir et nøyaktig og dypt kvantitativt proteom for SEZ-karakterisering i en rimelig tidsramme, uten å bekymre deg for kompromittert vevsintegritet eller proteintap.
Statistikk Statistisk testing, 2D-annotningsberikelsestester og PCA ble gjort i Perseus-miljøet. Proteiner ble inkludert i analysen hvis det ble påvist en gyldig verdi for hver metode i minst én prøve. Proteinoverflod og tallsammenligninger ble visualisert ved hjelp av dataanalyseprogramvare (se materialtabellen). En permutasjonsbasert kontroll av den falske oppdagelsesraten (FDR) (FDR ble satt til 0,05, 250 randomiseringer) ble brukt til proteinsammenligninger. For 2D-merknadsberikelsestestene36 er de viste GO-begrepene betydelig beriket (FDR ble satt til 0,02 ved hjelp av Benjamini-Hochberg FDR-kontrollmetode).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig01.jpg"> Figur 1: Cryo-Section-Dissection-metoden. (A) Oversikt over interesseområdet: lateral ventrikelen med nevrogen SEZ og den ikke-nevrogene MEZ. Neuroblaster immunostert med Dcx. (B) Trinnvis fjerning av OB, fremre pol, cortex og corpus callosum over ventriklene og choroid plexus: 1. plassering i disseksjonsmedium, 2. fjerning av OB, 3. fjerning av den fremre polen av cortex, 4. sagittale snitt av ventrikkeltoppen, 5. fjerning av ventrikkeltoppen, 5. fjerning av ventrikulær topp, 5. fjerning av ventrikkeltoppen, 5. fjerning av ventrikkeltoppen, 5. fjerning av ventrikkeltoppen, 5. 6. spredning av ventrikkelveggene. (C) 100 μm koronal skiver av den ferskfryste musehjernen, (1.) før og (2.) etter fjerning av ventrikkelveggene med en iskald skalpell. Skalastenger = 4 mm (D) Farging av en koronaldel av en lateral ventrikel (GFAP: grønn; DAPI: blå), som viser SEZ og MEZ dissekert med CSD. Skalastenger = 300 μm (A), 200 μm (D). Forkortelser: CSD = kryo-seksjon disseksjon; SEZ = subependymal sone; MEZ = medial ependymal sone; Dcx = Doublecortin; OB = olfaktorisk pære; GFAP = glial fibrillært surt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig02.jpg"> Figur 2: Overlegen disseksjonspresisjon med kryo-seksjon-disseksjon sammenlignet med fullmount disseksjon. (A) Immunohistokjemisk bilde av en SEZ-prøve oppnådd ved fullmontert disseksjon (venstre). Inkluderingen av myelinrikt striatalvev visualiseres ved farging mot MAG (grønn). Farging av en SEZ dissekert med CSD (høyre). I CSD er nesten all striatal myelin (farging mot MAG, grønn) utelukket fra prøvebåndet. Nuclei ble visualisert ved hjelp av DAPI (blå). (B) Sammenligning av myelinmarkørberikelse i SEZ vs. Cx fra wholemount (MBP: p = 0,0074; MAG: p = 0,0016; Plp1: p = 0,0011; CNP: p = 0,0029) og CSD (MBP: p = 0,0667; MAG: p = 0,0236; Plp1: p = 0,3420; CNP: p = 0,1842). (C) 2D-merknadsberikelsestest som sammenligner hele SEZ med CSD-SEZ-prøvene. GO-termene ekstracellulær plass og Matrisome-assosiert er mer beriket i CSD-dataene enn i fullkomne data. (D) Proteinoverflod av NSC-regulatoren Tgm225 plottet for hele demonteringen og CSD. Tgm2 er betydelig beriket i SEZ sammenlignet med Cx i CSD (CSD: p = 0,0029; Wholemount: p = 0,1775). For B og D: Som referanse, proteome data fra Sharma et al.33 med målinger av striatum og cortex plottet for de tilsvarende proteiner som vises i hele demonterte og CSD prøver. Skalastenger = 200 μm (A). Forkortelser: CSD = kryo-seksjon disseksjon; SEZ = subependymal sone; MAG = myelin-assosiert glykoprotein; Cx = somatosensorisk cortex; MBP = myelin grunnleggende protein; Plp1 = proteolipid-protein 1; CNP = 2',3'-syklisk-nukleotid 3'-fosfodiesterase; GO = gen ontologi; NSC = nevral stamcelle; Tgm2 = tranglutaminase 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; LFQ = etikettfri kvantasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig03.jpg"> Figur 3: Forbedret ekstracellulær protein kvantifisering med kryo-seksjon-disseksjon sammenlignet med LCM. (A) Cresyl fiolett farging av en lateral ventrikel før og etter laserfangst av SEZ og MEZ (venstre). Til sammenligning, CSD snittet av SEZ og MEZ (høyre). Skalastenger = 150 μm. (B) Sammenligning av antall påviste proteiner i SEZ- og MEZ-prøvene fra CSD og LCM. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SD. (C) Hovedkomponentanalyse av SEZ- og MEZ-prøvene som sammenligner CSD og LCM (komponent 2: 8,5 % av variansen; komponent 3: 6,4 %). (D) 2D-merknadsberikelse av kryo-seksjon- og laser-dissekerte MEZ (Top) og SEZ (Bottom). GO-begrepene ekstracellulær organell og ekstracellulær regiondel er betydelig beriket (røde prikker). (E) Overflod av ekstracellulære SEZ-assosierte markørproteiner i SEZ og MEZ for LCM (Tnc: p = 0,3789) og CSD-prøvene (Tgm2: p = 0,2940; S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0,3941; Tnc: p = 0,0004). Forkortelser: CSD = kryo-seksjon disseksjon; LCM = laser-capture-microdissection; SEZ = subependymal sone; MEZ = medial ependymal sone; GO = gen ontologi; Tnc = Tenacin-C; Tgm2 = transglutaminase 2; S100a6 = S100 kalsiumbindende protein A6; THBS4 = trombospondin-4; LFQ = etikettfri kvantasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis at JoVE.com

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

Kryo-seksjon-disseksjon tillater fersk, frossen forberedelse av den største nevrogene nisjen i murinhjernen for dyp kvantitativ proteomanalyse. Metoden er presis, effektiv og forårsaker minimal vevsperturbasjon. Derfor er det ideelt egnet for å studere molekylær mikromiljø av denne nisjen, så vel som andre organer, regioner og arter.

Kryo-seksjon Disseksjon av den voksne subependymale sonen for nøyaktig og dyp kvantitativ proteomanalyse

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

Vår disseksjonsmetode tillater presis isolasjon av ventrikulær nevrogen nisje, og er derfor godt egnet til å studere molekylær mikromiljøet til denne nisjen. Den største fordelen med denne avhandlingsmetoden er at den er presis, effektiv og forårsaker minimal vevsperturbasjon, samtidig som den er kompatibel med massespektrometri for proteomanalyse. I denne protokollen trekker vi ut den nevrogene nisjen til ventrikelen fra en musehjerne, men denne metoden kan også brukes på andre arter og i ulike tilstander av helse og sykdom.Teknikken kan kreve litt trening. spesielt med skalpellkuttene når du utsetter og trekker ut ventrikulær nevrogen nisje. Etter å ha avlivet en 8-til-10 uker gammel C57 svart / 6 mannlig mus, trekk ut hjernen ved manuell disseksjon og legg den i en kulturrett som inneholder iskald disseksjonsmedium.Bruk en skalpell, fjern den olfaktoriske pæren ved å lage et rett koronalsnitt mellom den olfaktoriske pæren og den indre polen av cortex. Deretter fjerner du fremre pol av cortex ved å lage et koronal kutt, og sørg for at laterale ventrikler er synlige i koronalplanet. Deretter åpner du begge laterale ventriklene fra toppen, og starter med sagittaldelen fra kortikale overflaten til ventrikulær lumen.Forlenge dette kuttet på en C-formet måte etter ventrikulær fleksjon. Deretter kobler du de kaudale endene av venstre og høyre sagittal snitt, og bruker et ekstra koronalkutt. Deretter fjerner du cortex og corpus callosum som dekker medial ventrikulære vegger.Hvis vevet er festet til medial ventrikulære vegger, gjør ytterligere kutt eller løft cortex og corpus callosum med saks for å løsne vevet. Deretter, ved hjelp av tang, fjern cortex og corpus callosum som dekker laterale ventrikler. Bruk tang, spred forsiktig ventrikkelveggene og fjern choroid plexus.Legg deretter hjernen på en glasssklie og legg lysbildet på toppen av tørris for å fryse hjernen med ventrikkelveggene i den åpne konfigurasjonen. Før du seksjonerer, sørg for at hjernen er festet til kryostatfesteplaten i bakhjernen med et innbyggingsmedium for frossent vev. I tillegg må du sørge for at ingen innbyggingsmedium kommer i kontakt med forhjernen, spesielt ved ventriklene.Klipp deretter 50-til-100-mikrometer tykke koronardeler av hjernen til slutten av lateral ventrikelen, og monter seksjonene på glasssklierene. Plasser glasssklier på tørris under et disseksjonsmikroskop. Løft skivene fra tørrisen i 15 til 30 sekunder for å oppnå en kort, ufullstendig opptining, noe som gjør den kompakte myelinen i striatum observerbar som tette hvite prikker.Deretter, ved hjelp av en forhåndskjølt skalpell, skille den subependymale sonen fra tilstøtende striatum, og overfør den som et helt stykke eller seksjonert i to til fire deler i et mikrocentrifugerør ved hjelp av den stumpe kanten av den avkjølte skalpellen. Gjør det samme for medial ventrikkelsonen. Myelin-assosierte, glykoproteinpositive interne kapsler i striatum ble identifisert i hele stmount-prøvene, men sjelden i kryo-seksjon-disseksjonsprøvene via immunhiistokjemi.Striatal forurensning i hele monteringsprøvene ble bekreftet ved berikelse av myelinproteiner i den subependymale sonen, sammenlignet med de somato-sensoriske cortex-prøvene. Sammenlignet med disse myelinmarkørproteinene i kryo-seksjons-disseksjonsprøvene viste derimot ingen signifikante forskjeller i den subependymale sonen og somato-sensoriske cortex-prøvene. Ved sammenligning av massespektrometriresultater mellom kryo-seksjon-disseksjon og laserfangstmikrodisseksjon, ga laserfangstmikrodeseksjon omtrent halvparten så mange kvantifiserte proteiner, selv om vevsinnsamlingstiden var omtrent dobbelt så lang.Prinsippkomponentanalyse viser at det er større variasjon blant prøver samlet inn med laserfangstmikrodeseksjon, avbildet som firkanter, enn blant de som er samlet inn med kryo-seksjon-disseksjon, avbildet som sirkler. En 2D-annotasjonsberikelsestest mellom kryo-seksjon-disseksjon og laserfangstmikrodisseksjon for de subependymale og mediale ependymale sonene avslørte lignende berikelse i både metoder og regioner for proteiner forbundet med det ekstracellulære rommet. Kryo-seksjon-disseksjon gir en mer robust identifisering og kvantifisering av nevrogenese i subependymal sone-assosierte ekstracellulære matriseproteiner.Når det gjelder tenascin-C, viste bare kryo-seksjon-disseksjon berikelse i den subependymale sonen sammenlignet med medial ependymal sone. Pass på at hjerneseksjonene på lysbildene ikke blir helt tint. Samlet sett er det godt å øve på trinnene i disseksjonsprosedyren for et konsistent resultat.Disseksjonsmetoden kan også brukes med andre proteinanalysemetoder som lett kan oppdage svært lave rikelige proteiner, som vekstfaktorer og cytokiner. Denne mikrodisseksjonsmetoden tillot oss å identifisere en ny nevrogeneseregulator, og vi tror det vil tillate andre å identifisere andre regulatorer for nevrogenese i ulike sammenhenger.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovaskulær Støping av Adult Mouse for 3D Imaging og morfologisk analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Aktivering Høy Gråtone Resolution Displays og nøyaktig respons tid målinger på konvensjonelle datamaskiner

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Disseksjon av Adult Mouse Utricle og Adenovirus-mediert støttende-celle Infeksjon

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Disseksjon og Immunhistokjemi av larver, pupal og Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; Netthinne

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Metoder for Modulation og analyse av NF-κB-avhengig Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Disseksjon av Transversus Abdominis Muscle for hel-mount Neuromuscular Junction Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Cell Sortering av Neural stilk og stamceller fra Adult Mouse subventricular Zone og Live-avbildning av deres Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissection og Immunfluorescens av Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolasjon og Culture of Adult Neural stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...