Name: cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis
Uploaded: 2021-10-07T15:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis at JoVE.com

Мы хотим искренне поблагодарить Матиаса Манна за то, что он позволил нам выполнить большую часть экспериментов в его лаборатории, Фабиана Кошиа за помощь в анализе LCM и протеомов, Татьяну Симон-Эберт за вскрытие целых гор и Корбиняна Майра и Игоря Парона за их техническую помощь. Мы с благодарностью признаем финансирование от Немецкого исследовательского совета MG (SFB870, TFR274), ЕС (Eranet S-700982-5008-001), ERC (aERC «NeuroCentro» для MG), Шведского общества медицинских исследований (SSMF, для JK) постдокторского гранта и фондов KI (2020-01351, для JK).

Все экспериментальные процедуры в этом исследовании были выполнены в соответствии с руководящими принципами Германии и Европейского Союза и были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и правительством Верхней Баварии (Regierung von Oberbayern). Для экспериментов использовались только самцы мышей C57Bl6 в возрасте от 8 до 10 недель.
1. Подготовка мозга мыши (~ 15 мин на мышь)
<ol><li>Подготовьте среду для рассечения, добавив 5 мл 1 M HEPES (конечная концентрация 10 мМ) к 500 мл 1x сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS). ПРИМЕЧАНИЕ: Срок хранения рассеченной среды (+4 °C) не должен превышать 2 недель.</li>
	<li>Приносят в жертву мышам вывих шейки матки и тщательно рассекают мозг. ПРИМЕЧАНИЕ: При исследовании ECM ткань предпочтительно должна быть немодифицированной. Вывих шейки матки сохраняет время рассечения как можно короче, тем самым максимально предотвращая постсмертное ферментативное аутопереварение. Если удаление крови имеет решающее значение для исследовательского вопроса, просто перфицитируйте мышь транскардиально с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) перед удалением мозга.</li>
	<li>Извлеките мозг методом ручного рассечения и поместите его в культуральную посуду, содержащую ледяную среду для рассечения (рисунок 1B - 1). ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мозг в среде рассечения на льду на протяжении всего рассечения.</li>
	<li>Удалите обонятельную луковицу (OB) скальпелем (рисунок 1B - 2) прямым корональным срезом между OB и передним полюсом коры.</li>
	<li>Удалите передний полюс коры скальпелем с помощью коронального разреза, чтобы сделать боковые желудочки видимыми в корональной плоскости (рисунок 1B - 3). ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что корональный разрез сделан ~ 5 мм рострально из оптического хиазма; в противном случае ростральная часть ОЭЗ/МЭЗ будет утрачена.</li>
	<li>С помощью ножниц откройте оба боковых желудочка сверху, начиная с сагиттального сечения от кортикальной поверхности до просвета желудочков, и удлините этот разрез с помощью С-образного сгибания после сгибания желудочка (рисунок 1B - 4).</li>
	<li>Соедините каудальные концы левого и правого сагиттального разреза с помощью дополнительного коронального разреза ножницами. ПРИМЕЧАНИЕ: Три разреза теперь образуют трапецию и облегчат удаление коры и мозолистого тела на следующем этапе.</li>
	<li>Удалите кору и мозолистое тело, покрывающие боковые желудочки, с помощью щипцов (Рисунок 1В - 5). Затем удалите кору и мозолистое тело, которые покрывают медиальные стенки желудочков. Здесь делают дополнительные разрезы, если ткань прикреплена к медиальным желудочковым стенкам, или просто поднимают кору и мозолистое тело ножницами, чтобы выбить ткань.</li>
	<li>Аккуратно разложите стенки желудочков щипцами (рисунок 1В - 6). Удалить сосудистое сплетение щипцами. ПРИМЕЧАНИЕ: Полное удаление сосудистого сплетения важно, чтобы избежать вмешательства в следующие этапы рассечения и избежать потенциального загрязнения образцов SEZ/MEZ.</li>
	<li>Положите мозг на стеклянную горку и поместите стеклянную горку поверх сухого льда, чтобы заморозить мозг. Поддерживайте стенки желудочков в открытой конфигурации. ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте достаточное расстояние между боковой и медиальной стенками желудочка, чтобы облегчить точное и эксклюзивное рассечение ОЭЗ и MEZ. Если ткань сжимается обратно в закрытую конфигурацию, используйте щипцы, чтобы зафиксировать стенки в нужном положении во время замораживания. Избегайте любого ущерба для ОЭЗ/МЭЗ. Старайтесь прикладывать минимальное усилие, в основном к верхнему краю открытых желудочков.</li>
</ol>2. Секционирование подготовленного мозга (~ 15 мин на мышь)
<ol><li>Вырежьте корональные участки мозга толщиной 50-100 мкм до конца бокового желудочка с помощью криостата и установите участки на стеклянные слайды. Убедитесь, что мозг прикреплен к пластине крепления криостата в заднем мозге со средой OCT и что ОКТ не вступает в контакт с передним мозгом, особенно в желудочках. ПРИМЕЧАНИЕ: Среда OCT будет мешать измерениям MS. Однако, если ткань будет использоваться для анализа антител, нет необходимости исключать среду OCT. Использование стеклянных горок с покрытием не рекомендуется. Слайды с покрытием оказывают слишком большую адгезивную силу на ткань, тем самым препятствуя транслокации образца ткани со слайдов в трубку микроцентрифуги на следующих этапах.</li>
</ol>3. Свободное рассечение срезов мозга (~ 30 мин на мышь)
<ol><li>Поместите стеклянные слайды с участками мозга на сухой лед под рассеченным микроскопом (рисунок 1С - 1).</li>
	<li>Подготовьте микроцентрифужные трубки на сухом льду и убедитесь, что трубки остаются на сухом льду не менее 1 минуты, чтобы быть достаточно холодными перед переносом образца. ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте микроцентрифужные трубки высокого качества, так как некоторые низкокачественные трубки могут выделять пластик на последующих этапах переваривания тканей, связанных с измерениями РС.</li>
	<li>Поднимите ломтики из сухого льда на 15-30 с, чтобы добиться кратковременного, неполного оттаивания, чтобы сделать компактный миелин полосатого тела видимым в виде плотных белых точек. ПРИМЕЧАНИЕ: Определение границы между ОЭЗ и полосатым телом становится возможным (Рисунок 1С - 2, см. Рисунок 2А для исключения миелина и сравнения с методом wholemount). Если оттаивание занимает слишком много времени, процесс можно ускорить, надавливая пальцем, покрытым перчатками, на противоположную сторону стеклянного слайда. Однако этот маневр следует практиковать, так как чрезмерное оттаивание происходит легко.</li>
	<li>Отделите ОЭЗ предварительно охлажденным скальпелем от соседнего полосатого тела (рисунок 1С,D).</li>
	<li>Перенесите ОЭЗ либо целым куском, либо разрезанным на 2-4 части в микроцентрифужную трубку с помощью тупого края охлажденного скальпеля. Если ткань должна быть использована для другого типа анализа, отличного от РС, перенесите образец ткани в соответствующий контейнер (например, 96-луночную пластину). ПРИМЕЧАНИЕ: Разрезание полностью замороженной ткани может привести к тому, что ткань быстро отколется и упадет с горки. Разрезание полностью размороженной ткани приводит к распаду ткани. Убедитесь, что ткань не заморожена полностью и не полностью разморожена.</li>
</ol>

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов

Метод CSD позволил точно извлечь ткань ОЭЗ и получить надежный протеом со значительной глубиной с использованием MS. CSD демонстрирует явное преимущество по сравнению с цельноразмерной диссекцией с точки зрения значительно сниженного стриатального загрязнения образцов ОЭЗ и внеклеточного обогащения белка. Поскольку также можно обнаружить аналогичное количество белков в отдельных образцах (~ 6 500 белков на образец) с помощью CSD и рассечения wholemount, дополнительное время для CSD стоит усилий. LCM обеспечивает более точную рассечение ОЭЗ, но достигает более низкой глубины протеома, имея только 3 500 белков на образец, несмотря на использование того же протокола MS, что и CSD (сопоставление библиотек и количественная оценка без меток). Важно отметить, что изменчивость была намного больше, вероятно, из-за восьмикратно более длительного времени подготовки на образец. PCA образцов, полученных LCM и CSD, показывает четкое разделение обоих методов с плотными кластерами, специфичными для региона, надежно отделенными друг от друга. Напротив, образцы LCM показали более рассеянное распределение, что, вероятно, частично связано с продолжительностью подготовки. Неясно, дал ли бы сбор гораздо большего количества образцов в течение более длительного периода протеом такой же прочности и глубины с LCM. Расчет оценки, сбор аналогичного объема образца, как это было сделано для CSD, занял бы в 5-8 раз больше времени с LCM, даже до 15 раз дольше, если бы были включены образцы, предоставленные для библиотек пептидных спектров, и большая часть из них в размороженных условиях. Кроме того, учитывая дополнительные возмущения ткани, необходимые для LCM (фоновое окрашивание, лазерное рассечение), LCM обеспечил небольшой, если таковой имелся, выигрыш по сравнению с CSD. Следовательно, CSD можно считать более подходящим для внеклеточных исследований протеома, особенно для ОЭЗ.
Примечательно, что если область интереса меньше, чем ОЭЗ (например, исследуя только эпендимальный клеточный слой), подход от руки отстает от точности LCM. Например, использование CSD для отделения эпендимального от субэпендимального слоя затруднено, поскольку эпендимальный слой имеет ширину только диаметр клетки, а демаркация в сторону субэпендимального слоя не видна невооруженным глазом в свежезамороженной ткани. Следовательно, LCM будет лучшим выбором, чем CSD, если точное рассечение по шкале ниже 50 мкм более важно, чем ненарушенная ткань или сохранение короткого времени рассечения. Однако для областей шириной 50 мкм и более точность CSD сопоставима с точностью LCM для анализа белка ECM.
CSD уже доказал свою полезность, внеся свой вклад в исследование функциональной роли ECM в нейрогенной нише25. Следовательно, продолжающееся применение CSD в ОЭЗ для различных исследований белков и протеомов (или даже секвенирования одноядерной РНК) может привести к обнаружению дальнейших регуляторов нейрогенеза, маркеров активации стволовых клеток и более глубокому пониманию нишевой физиологии стволовых клеток SEZ. Учитывая снижение нейрогенеза в стареющей SEZ37, краткий анализ изменений ECM ОЭЗ пожилых и молодых мышей может способствовать пониманию точных нишевых механизмов, способствующих развитию и поддержанию NSC38,39. Кроме того, влияние воспаления и травмы на нейрогенез ОЭЗ хорошо известно40,41,42,43. Обогащение фибриногена крови в ОЭЗ после корковой черепно-мозговой травмы и его влияние на астроглиогенез ОЭЗ и образование рубцов44 подчеркивает потенциальное влияние вызванных травмой изменений микросреды на физиологию стволовых клеток ОЭЗ. Следовательно, исследование протеома SEZ-ECM в связи с черепно-мозговой травмой с использованием CSD может помочь прояснить механизмы, с помощью которых травма и воспаление влияют на нейрогенез. Важно отметить, что метод также может быть применим к нейрогенным нишам человеческого мозга в области здоровья и заболеваний, поскольку свежезамороженная ткань часто может быть получена из операций. Кроме того, учитывая видовые различия во взрослом нейрогенезе, было бы также интересно применить метод CSD к другим видам, например, в ассоциации со стриатальным нейрогенезом. Кроме того, с помощью других методов обнаружения белка различия в локально продуцируемых факторах роста могут быть исследованы точно и эффективно с использованием CSD для ОЭЗ и MEZ (например, ИФА).
Наконец, процедура рассечения потенциально может быть модифицирована для точного извлечения других областей мозга, а также для исследовательских вопросов, не связанных с нейрогенезом. Например, CSD включает в себя короткую стадию полуоттаивания, во время которой компактный миелин виден в виде белых областей, отличных от более полупрозрачной остаточной ткани мозга. При простой модификации метода эта особенность позволила бы точно рассечение только компактной миелиновой ткани мозолистого тела, которая могла бы быть подвергнута протеомному анализу изменений, связанных с травмой. Предложение об изменении протокола, которое позволило бы мозолистому рассечению тела, состоит в том, чтобы опустить шаги 1.5-1.9 протокола и перейти непосредственно к подготовке корональных секций вместо открытия желудочков, чтобы сделать SEZ и MEZ доступными. Затем поместите срезы на сухой лед, ненадолго поднимите и полуоттравьте ломтики, а также просто удалите мозолистое тело скальпелем. Теперь этот препарат должен быть готов к любому анализу, требующему эффективного рассечения нативной ткани мозолистого тела.
Таким образом, в этом исследовании представлен метод микродиссекции, который может быть использован для надежного анализа нейрогенного нишевого протеома желудочков. Полученные данные подчеркивают совместимость и полезность метода CSD вместе с протеомным анализом микросреды ОЭЗ на основе MS. Сочетание точности, эффективности и минимального возмущения тканей делает CSD ценным расширением существующих методов.

Поскольку нейрогенез ограничен во взрослом мозге, различные стратегии восстановления центральной нервной системы значительно выиграют от более глубокого понимания основ замены нейронов у взрослых. Грызуны помогли нам понять основные механизмы постнатального нейрогенеза, хотя следует отметить, что взрослый нейрогенез сильно зависит от вида. У мышей есть три ниши взрослых нервных стволовых клеток (NSC). Гипоталамус представляет собой взрослую нишу НСК с нейрогенным потенциалом1,2, в то время как непрерывный взрослый нейрогенез в основном ограничен гиппокампом3 и ОЭЗ боковых стенок боковых желудочков4,5,6. ОЭЗ является крупнейшей зародышевой областью, содержащей НСК (клетки типа В), которые развиваются в нейробласты (клетки типа А) через транзитно-амплифицирующие клетки-предшественники (клетки типа С). ОЭЗ содержит 20-35% клеток типа В, 1-15% клеток типа С, 1-30% клеток типа А и 25-50% эпендимальных клеток7. ОЭЗ имеет сложную микроархитектуру с эндотелиальными клетками, микроглиальными клетками и эпендимальными клетками, находящимися в нише стволовых клеток и влияющими на нее8,9,10. Хотя нейронов в ОЭЗ мало, аксоны, исходящие из отдаленных источников, таких как полосатое тело, вентральная тегментальная область или гипоталамус, достигают и влияют на клетки типа B4. Уникальной особенностью этой ниши стволовых клеток является разделение между участком пролиферации и участком дифференцировки. После пролиферации предшественники нейронов мигрируют на несколько миллиметров из ОЭЗ в обонятельную луковицу, где они терминально дифференцируются в нейроны и интегрируются в уже существующие нейронные цепи. Исследования клеточных программ, связанных с нейрогенезом, уже предоставили знания, важные для экспериментальных терапевтических стратегий перепрограммирования и трансплантации клеток15,16,17,18,19,20. Однако клеточно-внешние сигналы также регулируют нейрогенез, и тканевая среда может определять нейрогенную судьбу стволовых клеток11,12,14,21,22,23. Следовательно, исследование микросреды нейрогенных ниш и ее взаимодействия со стволовыми клетками имеет решающее значение.
Внеклеточный матрикс (ECM) и другие секретируемые белки составляют большую часть микросреды. Для точной идентификации и количественной оценки лучше подходит протеомный подход, чем транскриптомный подход, для определения состава ECM из-за низкой корреляции между транскриптомомом и уровнями белка для ECM24,25. Более того, есть существенные доказательства того, что нишевые регуляторы в ОЭЗ не производятся исключительно клетками, заполняющими саму нишу. Более отдаленные места, такие как сосудистое сплетение, секретируют модулирующие сигналы, передаваемые стволовым клеткам через спинномозговую жидкость22,23. Исследование нишевого протеома может помочь идентифицировать нишевые регуляторы, присутствующие в нише независимо от их производственной площадки, учитывая, что значительная часть внеклеточной микросреды собирается белками.
Для сбора мышиной желудочковой зоны для объективного протеомного анализа требуется метод с высокой точностью, захват тонкий паравентрикулярной ленты толщиной около 50 мкм, содержащей стволовые клетки, при исключении ткани соседнего полосатого тела. Кроме того, возмущение тканей во время рассечения должно быть сведено к минимуму для анализа внеклеточной микросреды, поскольку растворимые белки, включая факторы роста или цитокины, могут быть легко смыты. Хотя можно анализировать масс-спектры неподвижной ткани, требуемый агент, такой как параформальдегид, уменьшит глубину идентификации белка и может ввести посттрансляционные модификации. Обычное рассечение цельной СЭЗ, например, для сбора клеток для анализа сортировки клеток, активированных флуоресценцией, удаляет всю ОЭЗ ножницами26. Это стандартное рассечение является быстрым с минимальным возмущением тканей. Однако стриатального загрязнения образцов не избежать. И наоборот, LCM имеет выдающееся преимущество в превосходной точности рассечения. Тем не менее, LCM может вводить возмущения тканей, например, из-за фонового окрашивания или лазерной денатурации белка. Чтобы объединить сильные стороны рассечения цельного монтажа и LCM, был разработан новый метод, совместимый с РС, называемый крио-секционным рассечением (CSD), (рисунок 1A-D). CSD позволяет экстракцию ОЭЗ и рассечение ОЭЗ медиальных стенок боковых желудочков (MEZ), что является идеальной, в основном ненейрогенной областью контроля для ОЭЗ (см. протокол). Нишевый протеом, полученный комбинацией CSD и современных методов MS, оказался полезным для характеристики и идентификации новых регуляторов в этой взрослой нише NSC25. Следовательно, этот метод будет полезен для определения белкового состава тканей ОЭЗ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryostat CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>cat. no. 15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td>cat. no. BPB018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>cat. no. 0030123344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>cat. no. 15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical disposable scalpels</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>cat. no. 5518083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes 60 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>cat. no. 633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>cat. no. A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. AB2253,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-GFAP 1:500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cat. no. G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-MAG 1:400</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MAB1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 9</td>
			<td>GraphPad Software, San Diego California USA</td>
			<td></td>
			<td>www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perseus Version 1.6.10.50</td>
			<td>Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-section dissection of the adult subependymal zone for accurate and deep quantitative proteome analysis

Субэпендимальная нейрогенная ниша состоит из паравентрикулярной ленты боковой желудочковой стенки бокового желудочка. Субэпендимальная зона (ОЭЗ) представляет собой тонкую и отчетливую область, подверженную воздействию желудочков и спинномозговой жидкости. Выделение этой ниши позволяет провести анализ микроокружения нейрогенных стволовых клеток. Однако извлечение мелких тканей для анализа протеома является сложной задачей, особенно для поддержания значительной глубины измерения и достижения надежной прочности. Для решения этих проблем был разработан новый метод, называемый криосекцией-диссекцией (CSD), сочетающий высокую точность с минимальным возмущением тканей. Метод совместим с современными методами масс-спектрометрии (МС), которые позволяют обнаруживать низкообильные нишевые регуляторы. В этом исследовании сравнивали CSD и его протеомные данные с методом и данными, полученными с помощью лазерного захвата-микродиссекции (LCM) и стандартной рассечения цельного расстояния. Метод CSD привел к удвоенной глубине количественной оценки менее чем за половину времени приготовления по сравнению с LCM и одновременно явно превзошел точность рассечения всего рассечения. Следовательно, CSD является превосходным методом сбора ОЭЗ для анализа протеома.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis at JoVE.com

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

Крио-секция-рассечение-рассечение позволяет свежей, замороженной подготовке самой большой нейрогенной ниши в мышином мозге для глубокого количественного анализа протеома. Метод является точным, эффективным и вызывает минимальное возмущение тканей. Поэтому он идеально подходит для изучения молекулярного микроокружения этой ниши, а также других органов, регионов и видов.

Криосекционное рассечение субэпендимальной зоны взрослого человека для точного и глубокого количественного анализа протеома

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

Наш метод рассечения позволяет точно выделить нейрогенную нишу желудочков и поэтому хорошо подходит для изучения молекулярной микросреды этой ниши. Основным преимуществом этого метода рассечения является то, что он точен, эффективен и вызывает минимальное возмущение тканей, но при этом совместим с масс-спектрометрией для анализа протеомов. В этом протоколе мы извлекаем нейрогенную нишу желудочка из мозга мыши, но этот метод также может быть применен к другим видам и в различных состояниях здоровья и болезни.Техника может потребовать некоторой подготовки. особенно при скальпельных разрезах при обнажении и извлечении желудочковой нейрогенной ниши. После усыпления 8-10-недельной мыши C57 black/6 мужского пола, извлеките мозг путем ручного рассечения и поместите его в культуральную посуду, содержащую ледяную среду для рассечения.Используя скальпель, удалите обонятельную луковицу, сделав прямой корональный разрез между обонятельной луковицей и внутренним полюсом коры. Затем удалите передний полюс коры, сделав корональный разрез, гарантируя, что боковые желудочки видны в корональной плоскости. Затем с помощью ножниц откройте оба боковых желудочка сверху, начиная с сагиттального сечения от кортикальной поверхности до просвета желудочков.Удлините этот разрез С-образным способом после сгибания желудочков. Далее соедините каудальные концы левого и правого сагиттального разреза, используя дополнительный корональный разрез. Далее удаляют кору и мозолистое тело, покрывающие медиальные стенки желудочков.Если ткань прикреплена к медиальным желудочковым стенкам, сделайте дополнительные разрезы или поднимите кору и мозолистое тело ножницами, чтобы выбить ткань. Затем, используя щипцы, удаляют кору и мозолистое тело, покрывающие боковые желудочки. С помощью щипцов аккуратно раздвиньте стенки желудочков и удалите сосудистое сплетение.Затем положите мозг на стеклянную горку и поместите горку поверх сухого льда, чтобы заморозить мозг стенками желудочков в открытой конфигурации. Перед разделением убедитесь, что мозг прикреплен к пластине прикрепления криостата в заднем мозге с помощью встраивающей среды для замороженных тканей. Кроме того, убедитесь, что никакая среда встраивания не вступает в контакт с передним мозгом, особенно в желудочках.Затем отрежьте корональные участки мозга толщиной от 50 до 100 микрометров до конца бокового желудочка и установите участки на стеклянные слайды. Поместите стеклянные слайды на сухой лед под рассеченный микроскоп. Поднимите ломтики из сухого льда на 15-30 секунд, чтобы добиться кратковременного, неполного оттаивания, сделав компактный миелин полосатого тела наблюдаемым в виде плотных белых точек.Затем, используя предварительно охлажденный скальпель, отделяют субэпендимальную зону от соседнего полосатого тела и переносят его целым куском или разрезанным на две-четыре части в микроцентрифужную трубку с помощью тупого края охлажденного скальпеля. Затем проделайте то же самое для медиальной желудочковой зоны. Миелин-ассоциированные, гликопротеин-положительные внутренние капсулы полосатого тела были идентифицированы во всех образцах, но редко в крио-секционно-диссекционных образцах с помощью иммуногистохимии.Стриатальное загрязнение в образцах wholemount было подтверждено обогащением миелиновых белков в субэпендимальной зоне по сравнению с образцами сомато-сенсорной коры. Напротив, сравнение этих белков-маркеров миелина в образцах крио-секции-диссекции не показало существенных различий в субэпендимальной зоне и образцах сомато-сенсорной коры. При сравнении результатов масс-спектрометрии между криосекцией-рассечением и микродиссекцией лазерного захвата микродиссекция лазерного захвата дала примерно вдвое меньше количественных белков, хотя время сбора тканей было примерно в два раза больше.Принципиальный компонентный анализ показывает, что существует большая вариабельность среди образцов, собранных с помощью микродиссекции лазерного захвата, изображенных в виде квадратов, чем среди образцов, собранных с помощью криосекции-рассечения, изображенных в виде кругов. Тест на обогащение 2D-аннотации между криосекцией-рассечением и микродиссекцией лазерного захвата для субэпендимальных и медиальных эпендимальных зон выявил аналогичное обогащение как в методах, так и в областях для белков, связанных с внеклеточным пространством. Криосекция-диссекция обеспечивает более надежную идентификацию и количественную оценку нейрогенеза в субэпендимальных зонально-ассоциированных белках внеклеточного матрикса.В случае тенасцина-С только криосекция-диссекция отображала обогащение в субэпендимальной зоне по сравнению с медиальной эпендимальной зоной. Следите за тем, чтобы участки мозга на слайдах не стали полностью размороженными. В целом, хорошо практиковать этапы процедуры рассечения для получения последовательного результата.Метод рассечения также может быть использован с другими методами анализа белка, которые могут легко обнаружить очень низкие обильные белки, такие как факторы роста и цитокины. Этот метод микродиссекции позволил нам идентифицировать новый регулятор нейрогенеза, и мы считаем, что он позволит другим идентифицировать другие регуляторы нейрогенеза в различных контекстах.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

Субвентрикулярной зоне En-лицо: Wholemount Окрашивание и эпендимальных потока

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Цереброваскулярные Литье взрослых мышь для 3D-визуализации и морфологический анализ

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Включение высокого серого резолюция дисплеи и точное время отклика Измерения на обычных компьютерах

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Препарирование взрослых маточки мыши и аденовирус-опосредованный опорно-клетки инфекции

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Вскрытие и иммуногистохимического личинок, куколок и взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Сетчатки

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Методы модуляции и анализа NF-kB-зависимой нейрогенез

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Рассечение мышц Transversus Abdominis для анализа нервно-мышечной развязки

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Сотовый Сортировка нейронных стволовых и прогениторных клеток из взрослых мышей субвентрикулярной зоны и Live-визуализация клеточного цикла динамика

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Всего горе Вскрытие и Иммунофлуоресценции взрослых мышей улитки

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...