Nuestro método de disección permite el aislamiento preciso del nicho neurogénico ventricular y, por lo tanto, es adecuado para estudiar el microambiente molecular de este nicho. La principal ventaja de este método de disección es que es preciso, eficiente y causa una perturbación tisular mínima, al tiempo que es compatible con la espectrometría de masas para el análisis de proteomas. En este protocolo, extraemos el nicho neurogénico del ventrículo de un cerebro de ratón, pero este método también se puede aplicar a otras especies y en varios estados de salud y enfermedad.
La técnica puede requerir algo de entrenamiento. especialmente con los cortes de bisturí al exponer y extraer el nicho neurogénico ventricular. Después de sacrificar a un ratón macho C57 negro/6 de 8 a 10 semanas de edad, extraiga el cerebro mediante disección manual y colóquelo en un plato de cultivo que contenga un medio de disección helado.
Usando un bisturí, retire el bulbo olfatorio haciendo un corte coronal recto entre el bulbo olfatorio y el polo interior de la corteza. A continuación, retire el polo anterior de la corteza haciendo un corte coronal, asegurando que los ventrículos laterales sean visibles en el plano coronal. Luego, usando tijeras, abra ambos ventrículos laterales desde la parte superior, comenzando con la sección sagital desde la superficie cortical hasta la luz ventricular.
Alarga este corte en forma de C siguiendo la flexión ventricular. A continuación, conecte los extremos caudales de la incisión sagital izquierda y derecha, empleando un corte coronal adicional. A continuación, retire la corteza y el cuerpo calloso que cubren las paredes ventriculares mediales.
Si el tejido está unido a las paredes ventriculares mediales, haga cortes adicionales o levante la corteza y el cuerpo calloso con tijeras para desalojar el tejido. Luego, usando fórceps, retire la corteza y el cuerpo calloso que cubren los ventrículos laterales. Usando fórceps, extienda cuidadosamente las paredes ventriculares y retire el plexo coroideo.
Luego, coloque el cerebro en un portaobjetos de vidrio y coloque el portaobjetos sobre hielo seco para congelar el cerebro con las paredes ventriculares en la configuración abierta. Antes de seccionar, asegúrese de que el cerebro esté unido a la placa de unión del criostato en el cerebro posterior con un medio de incrustación para los tejidos congelados. Además, asegúrese de que ningún medio de incrustación entre en contacto con el cerebro anterior, especialmente en los ventrículos.
Luego, corte las secciones coronales del cerebro de 50 a 100 micrómetros de espesor hasta el final del ventrículo lateral y monte las secciones en los portaobjetos de vidrio. Coloque los portaobjetos de vidrio sobre hielo seco bajo un microscopio de disección. Levante las rodajas del hielo seco durante 15 a 30 segundos para lograr una descongelación breve e incompleta, haciendo que la mielina compacta del cuerpo estriado sea observable como puntos blancos densos.
Luego, usando un bisturí preenfriado, separe la zona subependimaria del cuerpo estriado adyacente y transfiéralo como una pieza entera o seccionada en dos a cuatro partes en un tubo de microcentrífuga usando el borde romo del bisturí enfriado. Luego haga lo mismo para la zona ventricular medial. Se identificaron cápsulas internas del cuerpo estriado asociadas a la mielina y positivas para glicoproteínas en las muestras de montura completa, pero rara vez en las muestras de disección de criosección a través de inmunohistoquímica.
La contaminación estriatal en las muestras de todo el monte se confirmó mediante el enriquecimiento de proteínas de mielina en la zona subependimaria, en comparación con las muestras de corteza somatosensorial. Por el contrario, las comparaciones de estas proteínas marcadoras de mielina en las muestras de disección crioseccional no mostraron diferencias significativas en la zona subependimaria y las muestras de corteza somatosensorial. Al comparar los resultados de la espectrometría de masas entre la disección crioseccional y la microdisección de captura láser, la microdisección de captura láser produjo aproximadamente la mitad de proteínas cuantificadas, aunque el tiempo de recolección de tejidos fue aproximadamente el doble de largo.
El análisis de componentes principales revela que existe una mayor variabilidad entre las muestras recolectadas con microdisección de captura láser, representadas como cuadrados, que entre las recolectadas con disección crio-sección, representadas como círculos. Una prueba de enriquecimiento de anotación 2D entre la disección crioseccional y la microdisección de captura láser para las zonas ependimarias subependimarias y mediales reveló un enriquecimiento similar en ambos métodos y regiones para proteínas asociadas con el espacio extracelular. La criodisección-disección proporciona una identificación y cuantificación más robusta de la neurogénesis en proteínas de la matriz extracelular asociadas a la zona subependimaria.
En el caso de la tenascina-C, sólo la crio-sección-disección mostró enriquecimiento en la zona subependimaria en comparación con la zona ependimaria medial. Asegúrese de que las secciones cerebrales en las diapositivas no se descongelen por completo. En general, es bueno practicar los pasos en el procedimiento de disección para obtener un resultado consistente.
El método de disección también se puede utilizar con otros métodos de análisis de proteínas que pueden detectar fácilmente proteínas muy abundantes, como factores de crecimiento y citoquinas. Este método de microdisección nos permitió identificar un nuevo regulador de la neurogénesis, y creemos que permitirá a otros identificar otros reguladores de la neurogénesis en diversos contextos.
