Vår dissekeringsmetod tillåter exakt isolering av ventrikulära neurogen nisch, och är därför väl lämpad för att studera den molekylära mikromiljön av denna nisch. Den största fördelen med denna dissekeringsmetod är att den är exakt, effektiv och orsakar minimal vävnadsperturbation samtidigt som den fortfarande är kompatibel med masspektrometri för proteomanalys. I detta protokoll extraherar vi ventrikelns neurogena nisch från en mushjärna, men denna metod kan också tillämpas på andra arter och i olika hälsotillstånd och sjukdomar.
Tekniken kan kräva viss träning. särskilt med skalpell skär när man exponerar och extraherar ventrikulära neurogen nisch. Efter att ha avlivat en 8 till 10 veckor gammal C57 svart/6 manlig mus, extrahera hjärnan genom manuell dissekering och placera den i en odlingsfat som innehåller iskall dissekeringsmedium.
Använd en skalpell, ta bort luktlampan genom att göra ett rakt koronalsnitt mellan luktlampan och cortexens inre pol. Ta sedan bort cortex främre pol genom att göra ett koronalsnitt, vilket säkerställer att de laterala ventriklarna är synliga i koronalplanet. Öppna sedan, med hjälp av sax, båda de laterala ventriklarna från toppen, med början med sagitalsektionen från den kortikala ytan till ventrikulär lumen.
Förläng detta snitt på ett C-format sätt efter ventrikulär flexion. Anslut sedan de kaudala ändarna av vänster och höger sagittal snitt, med en extra koronalskärning. Ta sedan bort cortex och corpus callosum som täcker de mediala ventrikulära väggarna.
Om vävnaden är fäst vid de mediala ventrikulära väggarna, gör ytterligare nedskärningar eller lyft cortex och corpus callosum med sax för att lossa vävnaden. Sedan, med hjälp av tång, ta bort cortex och corpus callosum som täcker de laterala ventriklarna. Använd tång, sprid försiktigt ventrikulära väggar och ta bort choroidplexus.
Sätt sedan hjärnan på en glasrutschbana och placera rutschkanan ovanpå torr is för att frysa hjärnan med ventrikulära väggar i den öppna konfigurationen. Innan du delar ut, se till att hjärnan är fäst vid kryostatfästeplattan vid bakhjärnan med ett inbäddningsmedium för frusna vävnader. Dessutom, se till att inget inbäddningsmedium kommer i kontakt med förhjärnan, särskilt vid ventriklarna.
Skär sedan 50 till 100 mikrometer tjocka koronalsektioner i hjärnan till slutet av den laterala ventrikeln och montera sektionerna på glasrutschbanorna. Placera glasglasbilderna på torris under ett dissekeringsmikroskop. Lyft skivorna från torrisen i 15 till 30 sekunder för att uppnå en kort, ofullständig upptining, vilket gör striatumets kompakta myelin observerbar som täta vita prickar.
Sedan, med hjälp av en förkyld skalpell, separera subependymalzonen från den intilliggande striatum och överför den som en hel bit eller uppdelad i två till fyra delar i ett mikrocentrifugerör med den trubbiga kanten av den kylda skalpellen. Gör sedan samma sak för den mediala ventrikulära zonen. Myelin-associerade, glykoprotein-positiva inre kapslar av striatum identifierades i helamount prover, men sällan i cryo-avsnitt-dissekering prover via immunohistochemistry.
Striatal förorening i helamount prover bekräftades genom berikning av myelin proteiner i subependymal zonen, jämfört med somato-sensoriska cortex prover. Däremot visade jämförelser av dessa myelin markör proteiner i cryo-avsnitt-dissekering prover visade inga betydande skillnader i subependymal zonen och somato-sensoriska cortex prover. När man jämför masspektrometri resultat mellan cryo-section-dissekering och laser capture microdissection, laser capture microdissection gav ungefär hälften så många kvantifierade proteiner, även om vävnad insamlingstiden var ungefär dubbelt så lång.
Principkomponentanalys visar att det finns större variation bland prover som samlats in med laserfångstmikrodissection, avbildad som rutor, än bland dem som samlats in med kryo-sektion-dissekering, avbildade som cirklar. En 2D anteckning anrikning test mellan cryo-avsnitt-dissekering och laser fånga microdissection för subependymal och mediala ependymal zoner visade liknande berikning i både metoder och regioner för proteiner som är associerade med extracellular utrymmet. Cryo-section-dissekering ger en mer robust identifiering och kvantifiering av neurogenes i subependymal zon-associerade extracellulära matris proteiner.
När det gäller tenascin-C visade endast cryo-section-dissekering berikning i subependymal zonen jämfört med den mediala ependymala zonen. Se till att hjärnsektionerna på rutschkanorna inte blir helt tinade. På det hela taget är det bra att öva stegen i dissekeringsförfarandet för ett konsekvent resultat.
Dissekeringsmetoden kan också användas med andra proteinanalysmetoder som lätt kan upptäcka mycket låga rikliga proteiner, såsom tillväxtfaktorer och cytokiner. Denna mikrodissection metod tillät oss att identifiera en ny neurogenesis regulator, och vi tror att det kommer att tillåta andra att identifiera andra regulatorer av neurogenes i olika sammanhang.