Name: photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من قبل NSF جائزة الوظيفي #1944791.

<ol>
	<li>Welch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+single+cell+isolation+for+genomics+using+microraft+arrays.">Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).</li><li>Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. K., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+high-throughput+screening+of+small+mutant+libraries.">A microfluidic platform for high-throughput screening of small mutant libraries.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5234-5242 (2016).</li><li>Ishii, S., Tago, K., Senoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+and+isolation+for+microbiology+and+biotechnology:+Methods+and+applications.">Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1281-1292 (2010).</li><li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ichip+for+high-throughput+in+situ+cultivation+of+“uncultivable+microbial+species”.">Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of “uncultivable microbial species”.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Zhao, X., Zhong, J., Wei, C., Lin, C. W., Ding, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+viable+but+nonculturable+state+in+foodborne+pathogens.">Current perspectives on viable but nonculturable state in foodborne pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 580 (2017).</li><li>Wang, X., Gou, X., Chen, S., Yan, X., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+manipulation+tool+with+combined+microwell+array+and+optical+tweezers+for+cell+isolation+and+deposition.">Cell manipulation tool with combined microwell array and optical tweezers for cell isolation and deposition.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 23 (7), 075006 (2013).</li><li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Poonlapdecha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-conjugated+ferromagnetic+nanoparticles+with+lateral+flow+test+strip+assay+for+rapid+detection+of+Campylobacter+jejuni+in+poultry+samples.">Antibody-conjugated ferromagnetic nanoparticles with lateral flow test strip assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in poultry samples.</a> International Journal of Food Microbiology. 286, 6-14 (2018).</li><li>Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomagnetic+separation:+An+effective+pretreatment+technology+for+isolation+and+enrichment+in+food+microorganisms+detection.">Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).</li><li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+Single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+flow+cytometry:+The+role+of+microfabrication+methodologies,+performance+and+functional+specification.">Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification.</a> Technology. 06 (01), 1-23 (2018).</li><li>Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+and+microbial+engineering.">Microfluidics and microbial engineering.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 432-446 (2016).</li><li>Kehe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+screening+of+synthetic+microbial+communities.">Massively parallel screening of synthetic microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12804-12809 (2019).</li><li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+degradation+of+chain+and+step-polymerized+photodegradable+hydrogels.">Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels.</a> Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties.">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li><li>Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+demand+release+and+retrieval+of+bacteria+from+microwell+arrays+using+photodegradable+hydrogel+membranes.">On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).</li><li>Barua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+discovery+of+positive+and+negative+interactions+among+root+microbiome+bacteria+using+microwell+recovery+arrays.">Simultaneous discovery of positive and negative interactions among root microbiome bacteria using microwell recovery arrays.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 3361 (2021).</li><li>Fattahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+rapid+screening,+isolation,+and+genetic+characterization+of+bacteria+with+rare+phenotypes.">Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes.</a> Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+copatterning+strategies+using+azlactone-based+block+copolymers.">Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabricating+reactive+surfaces+with+brush-like+and+crosslinked+films+of+azlactone-functionalized+block+co-polymers.">Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562 (2018).</li><li>Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+tracking+of+microbial+community+development+within+a+microwell+array+platform.">Assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55701 (2017).</li><li>. DNeasy Blood &amp; Tissue Handbook - QIAGEN Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en</a> (2021)</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+Maleimide-Thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+modified+salt-out+method+for+DNA+extraction+from+whole+blood+lymphocytes:+A+simple+and+economical+method+for+gene+polymorphism.">Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism.</a> Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28 (2018).</li><li>Hansen, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+of+bacteria+in+microwell+arrays+reveals+the+importance+of+confinement+in+community+development.">Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development.</a> PLoS One. 11 (5), 0155080 (2016).</li><li>Halsted, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transparent+microwell+arrays+for+optical+monitoring+and+dissection+of+microbial+communities.">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).</li><li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Hydrogel+Interactions+in+Tissue+Engineering:+Mechanisms+and+Applications.">Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160 (2013).</li><li>Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+interactions+between+bacteria+and+hydrogels.">Mechanical interactions between bacteria and hydrogels.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10893 (2018).</li></ol>

وقد قدمت RRH وAJV براءة اختراع على هذه التكنولوجيا. ولا يعلن المؤلفون الباقون عن أي تضارب في المصالح.

توضح هذه المخطوطة استخدام الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي لفحص البكتيريا وعزلها. تمكن المواد والنهج ثقافة عالية الإنتاجية ، والسيطرة على وسائل الإعلام النمو وظروف النمو ، واستخراج الخلايا نظيفة ودقيقة بطريقة واضحة وفعالة من حيث التكلفة. استخراج يتطلب فقط المجهر الفلورسنت إلى جانب أداة الإضاءة منقوشة ويمكن القيام به بطريقة متتابعة لعزل أهداف الخلايا المتعددة. كل استخراج يستغرق 5-10 دقيقة لأداء، وتم إزالة ما يصل إلى 30 المستعمرات المستهدفة من هيدروجيل واحد. ومن المزايا الرئيسية للنهج قدرته على التكيف مع مجموعة متنوعة من أشكال المقايسة المختلفة، كما يتضح هنا مع الفحص من كل من الهيدروجيلات السائبة وصفائف microwell. وقد استخدمت عملية الفصل في كلا الشكلين بنجاح لعزل البكتيريا التي تظهر سلوك النمو الفريد للجنوة المصب بعد الثقافة والمراقبة المجهرية، وهي قدرة حاسمة لربط النمط الجيني الخلية إلى النمط الظاهري. حتى الآن ، وشملت التوصيفات الجينومية للبكتيريا المستخرجة من هذه الواجهات تسلسل 16S amplicon لتحديد مجموعات متعددة الأنواع من البكتيريا من الميكروبيوم البيئية التي تولد سلوك النمو الناشئ18، وتسلسل الجينوم الكامل لتحديد بنجاح الطفرات الوراثية التي تسبب ملامح النمو النادر في الخلايا الموجودة داخل المكتبات المتحولة19.
استخدام الهيدروجيلات السائبة لفحص الخلايا والعزل هو الشكل الأكثر مباشرة وبسيطة. تتشكل الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي السائبة بسرعة (25 دقيقة) بعد خلط السلائف على أغطية زجاجية شفافة لتغليف الخلايا في مصفوفة ثقافة الخلية ثلاثية الأبعاد التي يتم تصويرها بمجهر مضان قياسي مستقيم أو مقلوب. وبالتالي، فإن هذه الطريقة لديها القدرة على أن تكون تحويلية إلى مختبرات الأحياء المجهرية المشتركة التي ليس لديها موارد أو خبرة في التصنيع الدقيق. عيب في هذا الشكل هو أن الخلايا هي موجهة عشوائيا في جميع أنحاء هيدروجيل ثلاثي الأبعاد. لذلك، يمكن أن تظهر الخلايا خارج المستوى البؤري عند التصوير مع أهداف التكبير أعلى واستخراج يمكن أن يكون من الصعب إذا كانت مستعمرات الخلايا موجهة قريبة جدا من بعضها البعض أو إذا كان هناك تراكب عمودي من المستعمرات. إيداع هيدروجيل رقيقة (<13 ميكرومتر) كما هو موضح أمر بالغ الأهمية للتخفيف من هذا العيب. التعرض في أنماط الضوء عبر مكسورة (الشكل 4B) هو الأفضل هنا، وهذا النمط يؤدي إلى خلايا خالية من الهيدروجيل التي لديها الحد الأدنى من التعرض للأشعة فوق البنفسجية ويمكن استردادها بسهولة من خلال الطلاء.
في المقابل، يوفر تنسيق صفيف microwell واجهة أكثر تحكما، حيث يتم تقسيم خلايا البكتيريا إلى ميكروويلات منفصلة تعمل كمواقع ثقافة صغيرة أو ثقافات مشتركة17و18و26. يتم تصنيع البعد والملعب والكثافة الدقيقة بدقة باستخدام التقنيات الضوئية القياسية. بالمقارنة مع الهيدروجيلات السائبة ، يمكن استخراج البكتيريا من صفائف microwell بدرجة أعلى من التحديد وفرصة أقل للتلوث المتبادل ، حيث أن الخلايا موجودة فقط في مواقع محددة مسبقا ، وليس موزعة عشوائيا في جميع أنحاء الهيدروجيل. تركيز ونسب خلايا البكتيريا في محلول البذر يمكن أيضا أن تختلف للسيطرة على كمية وتكوين inoculum microwell من خلال عملية البذر التي تم وصفها في التقارير السابقة26، مما يعطي المستخدم المرونة في التصميم التجريبي للشاشة. العيب الرئيسي للفحص مع شكل صفيف microwell هو الوقت الإضافي والخبرة اللازمة ل microfabrication. وقدرت تكلفة تصنيع الحيوانات الدقيقة بحوالي 10 دولارات لكل صفيف، بما في ذلك تكاليف المواد ونفقات غرف التنظيف. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما تكون صفائف microwells مصنوعة من السيليكون ، مما قد يسبب صعوبات في التصوير لأن الركائز غير شفافة. وعلاوة على ذلك، فإن كمية عالية من الضوء المتناثر من سطح السيليكون يمكن أن تحد من التصوير داخل microwells ويمكن أن تقلل من دقة النمط أثناء التعرض الهيدروجيل مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية من أداة الإضاءة منقوشة (ينظر في الشكل 8A،B). وقد تم تلفيق microwells مماثلة على ركائز الكوارتز شفافة لمعالجة هذه الأنواع من القيود27; ومع ذلك ، فإن هذا تلفيق هو أكثر صعوبة بكثير. التعرض لأنماط الحلقة التي تضيء محيط البئر هو الأفضل هنا لتحرير الخلايا الحرة من الآبار مع تقليل التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
المشكلة الأكثر شيوعا التي تحدث في أي شكل من الأشكال هو انفصال الهيدروجيل من الركيزة الكامنة خلال الثقافة بسبب تورم الهيدروجيل. إذا كانت هذه مشكلة بالنسبة للهيدروجيلات السائبة، فيجب التحقق من وجود وكثافة وتوحيد مجموعات ثيول في طبقة المرفق الكيميائية (MTPS) عبر سطح غطاء الزجاج الأساسي باستخدام تقنية توصيف سطحي مناسبة (XPS و ATR-FTIR و AFM وما إلى ذلك). الكثافات المنخفضة لمجموعات ثيول السطحية بسبب عدم كفاءة التشغيل السطحي يمكن أن تؤدي إلى تفاعل ضعيف بين الركيزة والهيدروجيل. إذا حدث مستوى منخفض من التكثير السطحي، يجب التحقق من استقرار حل MTPS. يجب توخي الحذر عند التنظيف الأولي للشريحة الزجاجية لضمان سطح نظيف قبل معالجة MTPS ، ويجب توخي الحذر لضمان استخدام التولوين اللامائية أثناء تفاعل سطح MTPS (قسم البروتوكول 4). في حالة صفائف microwell ، لا يتم thiolated السطوح ، وhyedrogels نعلق بدلا من ذلك من خلال ملء جزئي للأبار مع الهيدروجيل ، الذي يرسو الهيدروجيل إلى ركيزة السيليكون17. إذا كان مفرزة الهيدروجيل مشكلة في هذا النظام ، يمكن حفر المزيد من microwells أو غيرها من الميزات الصغيرة في الصفيف لزيادة ترسيخ الهيدروجيل إلى الركيزة لتعزيز ارتباط أقوى.
وهناك قيود على هذه التقنية في أي شكل من الأشكال هو الاستقرار المحدود للهيدروجلز في وجود البكتيريا. وقد لوحظ أن بعض البكتيريا، مثل A. tumefaciens،يمكن أن تتحلل الهيدروجيل على مدى 5-7 أيام17،19، مما يحد من وقت التجربة. ويجري حاليا بحث آليات التحلل البكتيري؛ فمن المفترض أن مجموعات إستر موجودة من مونومرات diacrylate تخضع للتحلل المائي بوساطة البكتيريا و / أو التدهور الأنزيمي، كما لوحظ في النظم الأخرى17. تطوير كيمياء هيدروجيل أكثر استقرارا سوف تمتد الوقت الذي البكتيريا يمكن أن تبقى في الهيدروجيل وسوف تمتد الشاشة إلى الكائنات الحية الدقيقة مع معدلات نمو أبطأ. والقيود الثانية هي أن استعادة الخلايا واستخراجها يحدثان في بيئة مفتوحة، مما يؤدي إلى كميات استخراج عالية نسبيا (30-100 ميكرولتر)، والتي يمكن أن تكون عرضة للتلوث الخارجي. وبالتالي، يجب توخي الحذر لضمان وجود خلايا كافية من المستعمرات المستهدفة مع تقليل حجم محلول الاستخراج. للحصول على ما يكفي من الخلايا للطلاء والانتعاش أو لاستخراج مواد الحمض النووي، لوحظ أنه في الهيدروجيلات السائبة، يجب زراعة الخلايا لفترة كافية للوصول إلى أقطار مستعمرة لا تقل عن 10 ميكرومتر. لخفض حجم المطلوب لاستخراج الخلية، لوحظ أن استخدام حقنة microliter والأنابيب (الشكل 2) كان أكثر كفاءة من pipetting. سمح الأنابيب بانساق العزلات من نقطة الإطلاق بدقة أكبر ، مما يتطلب حجم حل أقل ويقلل من فرصة التلوث.
العمل في المستقبل ينطوي على فهم تأثير الخصائص الميكانيكية هيدروجيل على نمو الخلايا، كما يتم التحكم بشكل جيد السمات الميكانيكية لهذه الهيدروجيلات من خلال اختيار السلائف المونومر PEG المستندة المناسبة من مختلف الأوزان الجزيئية28،والتفاعلات الميكانيكية من المرجح أن تلعب دورا هاما في سلوك البكتيريا29. وبما أنه يمكن دمج مواد الهيدروجيل بسهولة في مجموعة متنوعة من الأنظمة والأجهزة المختلفة، فإن المزيد من التطوير يركز أيضا على دمج هذه المواد في أنظمة microfluidic. وهذا من شأنه أن يقلل من حل استخراج ل femtoliter إلى أحجام picoliter، مقارنة مع التقليدية 30-100 ميكرولتر المجلدات المطلوبة حاليا في شكل جمع مفتوحة. ومن شأن أحجام الحلول الأصغر أن تقلل إلى حد كبير من التلوث المحتمل وأن تحرك النهج نحو عزل الخلية الواحدة وتوصيفها.

عزل الخلايا ذات السلوكيات الفريدة من بيئة معقدة وغير متجانسة أمر أساسي للحصول على المعلومات الوراثية في علم الأحياء1. في علم الأحياء المجهرية ، واختيار وعزل الميكروبات النادرة أو الفريدة بعد المراقبة يصبح من المهم في العديد من التطبيقات التي تتطلب وجود صلة بين المعلومات الجينومية والمعلومات الظاهرية التي يمكن ملاحظتها. وتشمل هذه التطبيقات اختيار سلالات نادرة phenotypically من المكتبات متحولة2، واختيار الكائنات الحية الدقيقة حجر الزاوية من المجتمعات الميكروبية المعقدة3،4، واختيار البكتيريا النادرة ولكن المهم phenotypically من السكان isogenic. عزل الخلايا القابلة للحياة ولكن غير قابلة للتكثير (VBNC) من مجموعة البكتيريا هو مثال مهم على هذا الأخير، حيث غالبا ما تكون مخفية الخلايا مع النمط الظاهري VBNC في مجموعات البكتيريا في 1:102 إلى 1:105 نسب5،6. بسبب الصعوبات الواسعة النطاق في عزلة البكتيريا ، لا يزال الكثير غير معروف حول العديد من الكائنات الحية الدقيقة النادرة بشكل الظاهري. تؤكد هذه القيود على الحاجة إلى تقنيات عزل الخلايا لتحديد الخلية أو الخلايا المستهدفة من الخليط أولا ثم استردادها وعزلها للتحليل الجزيئي في المصب7.
بعض الطرق الأكثر شيوعا لعزل الخلايا تشمل تدفق قياس الخلايا والفلورسنت فرز الخلايا المنشطة (FACS)8، فصل المغناطيسي المناعي9،10، وmicrofluidics11. في حين أن هذه الأساليب العزل لها قيمة عالية، لديهم أيضا عيوب تحد من استخدامها. على سبيل المثال، يمكن أن توفر FACS العزل الميكروبي الروتيني على مستوى الخلية الواحدة لمتابعة التحليل الجينومي3 ولكن غالبا ما تكون محدودة بسبب توافرها وحسابها، فضلا عن قضايا التلوث المصب11. وقد حصلت النهج القائمة على microfluidic مثل قياس التدفق الدقيق للخلايا على الكثير من الاهتمام ، والذي ، مقارنة ب قياس التدفق الخلوي التقليدي ، يسمح بانخفاض كبير في حجم العينةالمطلوبة 12. ومع ذلك ، فإن فصل واسترجاع مجموعات فردية أو صغيرة من الخلايا من الأجهزة الدقيقة غالبا ما يكون مشكلة صعبة تتطلب عادة إعدادا أكثر تعقيدا وتصميم جهاز13. العديد من النهج القائمة على microfluidic تميز وراثيا الخلايا قبل أن يتم إدخالها ومراقبتها في جهاز14، والحد من عدد الأنواع الفريدة التي لوحظت عند أداء شاشة وظيفية. ونظرا لهذه القيود، يلزم المزيد من الابتكار في كل من الطرق والمواد العملية لفحص الخلايا وعزلها لاستخدامها على نطاق واسع في العديد من المختبرات.
تقدم هذه الورقة نهجا جديدا قائما على المواد لفحص البكتيريا وعزلها. تستخدم الطريقة الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي لتغليف الخلايا والثقافة والمراقبة المجهرية وإطلاق البكتيريا المستهدفة واستردادها عند الطلب مع أنماط الظاهرية الفريدة. تم تصميم Hydrogels لاحتواء حجم شبكة 10 نانومتر، حيث يحتوي كل وصلة عرضيةس-nitrobenzyl مجموعات15. المواد تغليف أو الفخاخ الخلايا للمراقبة مع تمكين نشر المواد الغذائية والنفايات من وإلى الخلايا للثقافة. تعريض المواد لنمط 365 نانومتر مصدر الأشعة فوق البنفسجية الضوء من خلال المجهر تستقيم تمكن التدهور المحلي للhytrogel من خلال photocleavage من س-nitrobenzyl مجموعات16،17. يؤدي التحلل إلى إطلاق انتقائي للخلايا للتعافي من أجل تحليل المصب، بما في ذلك التحليل الجينومي، وربما، البروتيوميك والنص. الإعداد التجريبي والبروتوكول بسيطة نسبيا، وغير مكلفة، وترجمية إلى مختبرات علم الأحياء المجهرية. فإنه يتطلب فقط تغليف الخلية من خلال تشكيل الهيدروجيل، ومراقبة الخلايا الملتقطة مع المجهر مشرق تستقيم والمضان، وإضاءة الخلايا ذات الأهمية مع مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية منقوشة لاسترجاعها.
ومن المزايا الرئيسية لهذا النهج القائم على المواد في الفحص قدرته على التكيف مع أشكال الفحص المختلفة. في شكله الأساسي ، يمكن استخدام المواد للفحص عن طريق تغليف مجموعة خلايا غير متجانسة في الهيدروجيلات السائبة. ثم يتم ملاحظة الخلايا للنمط الظاهري المطلوب ، ويتم إزالة الخلايا الفردية ذات الاهتمام لتوصيف الجينوم. في أشكال أكثر تفصيلا، يمكن أيضا دمج المواد في أجهزة مختبر على رقاقة لتوفير إطلاق الخلايا دقيقة واسترجاعها من المناطق المطلوبة من الجهاز. ويرد وصف كلا الشكلين هنا، وكلاهما مكن الحديثة رواية الفحص الميكروبي واختيار التطبيقات17،18،19. ويتضح هذا الأسلوب هنا مع نموذج الكائنات الحية السلبية غرام(الإشريكية القولونية، Tumefaciens Agrobacterium) ونموذج كائن إيجابي غرام(عصيات subtilis)وقد تم تمديدها بسهولة إلى مجموعة متنوعة من البكتيريا الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>175617-25G</td>
			<td>&#62; 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox detergent powder</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>1104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Certified ACS Granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave SK300C</td>
			<td>Yamato Scientific</td>
			<td>18016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 1A1135</td>
			<td>Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td>1A1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield upright microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C614-500</td>
			<td>For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>0188-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: -30-60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: &#60; 32 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli ATCC 25922</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R19020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium microscope slides plain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td>Contains inhibitor, 30 wt% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incu-Shaker Mini</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>E5-0014-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 7-hydrate</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Avantor Performance Materials, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen, compressed</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)</td>
			<td>NOF America Corporation</td>
			<td>PTE-100SH</td>
			<td>Sunbright-PTE-100SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>K813-500ML</td>
			<td>Store between 15 &#176;C&#8211;30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon400</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>DSI-D-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>25 x 75 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>BioXtra, &#62; 98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505-250G</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#62; 99.0% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel thickness gage</td>
			<td>Precision Brand Products</td>
			<td>77739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-1L</td>
			<td>Anhydrous, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td>For microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FS-110H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation

حاول علماء الأحياء منذ فترة طويلة فهم العلاقة بين النمط الظاهري والنمط الجيني. لفهم أفضل لهذا الاتصال، من الأهمية بمكان تطوير تقنيات عملية تربط فحص الخلايا المجهرية مع عزل الخلايا بنقاء عال للتحليل الجيني في المصب. هنا، يتم وصف استخدام الهيدروجيلات البولي القابلة للتحلل الضوئي (الإيثيلين غليكول) لفحص وعزل البكتيريا ذات الأنماط الظاهرية للنمو الفريدة من مجموعات الخلايا غير المتجانسة. وتعتمد هذه الطريقة على تغليف الخلايا أو حاصرتها بالهيدروجيل، تليها الثقافة، والفحص المجهري، ثم استخدام أداة نقش ضوئي عالية الدقة للسيطرة الصدغية على تدهور الهيدروجيل وإطلاق خلايا مختارة في حل للاسترجاع. تطبيق أنماط ضوء مختلفة يسمح للسيطرة على مورفولوجيا الخلية المستخرجة، ويمكن استخدام أنماط مثل الحلقات أو الصلبان لاسترداد الخلايا مع الحد الأدنى من التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية للتخفيف من تلف الحمض النووي إلى العزلات. وعلاوة على ذلك، توفر أداة النقش الخفيف جرعة خفيفة قابلة للتعديل لتحقيق مختلف معدلات التدهور وإطلاق الخلايا. فهو يسمح بالتدهور بدقة عالية، مما يتيح استرجاع الخلايا بدقة مكانية على نطاق ميكرون. هنا ، يتم عرض استخدام هذه المواد لفحص واسترداد البكتيريا من كل من الهيدروجيل السائبة والأجهزة المصنعة مختبر على رقاقة. هذه الطريقة غير مكلفة وبسيطة ، ويمكن استخدامها للتطبيقات الشائعة والناشئة في علم الأحياء المجهرية ، بما في ذلك عزل السلالات البكتيرية مع ملامح نمو نادرة من المكتبات المتحولة وعزل الاتحادات البكتيرية مع الأنماط الظاهرية الناشئة لتوصيف الجينوم.

Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

يتم الإبلاغ عن استخدام الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي لعزل الخلايا البكتيرية باستخدام أداة عالية الدقة للتربيت الخفيف. يتم مراجعة الإجراءات التجريبية الأساسية والنتائج ومزايا العملية. وتتيح هذه الطريقة العزل السريع وغير المكلف للبكتيريا المستهدفة التي تظهر وظائف نادرة أو فريدة من نوعها من المجتمعات أو السكان غير المتجانسين.

واجهات هيدروجيل قابلة للتحلل الضوئي لفحص البكتيريا واختيارها وعزلها

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

تم تصميم هذا البروتوكول لعزل الخلايا بسرعة من واجهات الفحص لتوصيف الجينوم وهذه القدرة كبيرة لأنها يمكن أن تجمع بين ميزات الخلايا التي يمكن ملاحظتها بشكل كبير مع المعلومات الجينومية. يمكن عزل الخلايا البكتيرية المستهدفة من واجهات الفحص مع وضع مكاني عال بطريقة بسيطة من الناحية التشغيلية باستخدام هذه التقنية. ويمكن تنفيذ الهيدروجيلات في واجهات الفحص الأخرى.ويمكن دمج مادة الهيدروجيل بسهولة في قنوات microfluidic لاسترجاع الخلايا عند الطلب من الأجهزة الدقيقة. ابدأ بتطعيم المخزن المؤقت للربط المتداخل بكثافة الخلية المطلوبة. إعداد حل السلائف هيدروجيل في أنبوب 0.5 ملليلتر من الطرد المركزي الدقيق عن طريق إضافة 12.5 ميكرولتر من العازلة عبر ربط و 5.6 ميكرولتر من محلول DIACRYLATE PEG ONB.وأخيرا، إضافة 6.9 ميكرولتر من الساعد PEG ثيول الحل إلى الخليط. لتغليف الخلية في محلول السلائف هيدروجيل، ضع الأغطية قاعدة ثيولايد على طبق بيتري نظيفة ووضع اثنين من الفواصل على الجانبين المتعارضين من coverslip. إصلاح الفواصل على coverlip قاعدة عن طريق تسجيل الفواصل إلى طبق بيتري.بعد إضافة الحجم المطلوب من محلول السلائف على شريحة زجاجية بيرفلوروالكيلاتيد غير تفاعلية ، ضع الشريحة على غطاء القاعدة واترك تشكيل الهيدروجيل يكتمل في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. بمجرد اكتمال الهلام ، قم بإزالة الشريحة الزجاجية البيرفلوروالكيلات بلطف. ضع الركيزة في طبق بيتري 60 في 15 ملليمتر الذي يحتوي على وسائط ATGN تكملها المضادات الحيوية.البذور 700 ميكرولتر من تعليق الخلايا البكتيرية مع OD 600 من 0.1 على ركيزة صفيف microwell وجعل محلول السلائف هيدروجيل كما هو موضح سابقا باستخدام 12.5 ميكرولتر من الفوسفات المخزنة ATGN المالحة من درجة الحموضة ثمانية. ماصة 12.5 ميكرولتر من محلول السلائف على شريحة زجاجية غير تفاعلية perfluoroalkylated ووضع اثنين من الفواصل الصلب 38 ميكرومتر على الجانبين المتعارضين من الركيزة صفيف microwell تلقيح مع الخلايا. ثم عكس الشريحة الزجاجية perfluoroalkylated مع قطرة حل السلائف ووضع قطرة في منتصف الركيزة microwell.عندما يتم تشكيل الهيدروجيل بعد حضانة لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة الشريحة الزجاجية برفق من ركيزة microwell ووضع الركيزة في طبق بيتري يحتوي على وسائط ATGN تكملها المضادات الحيوية. ضع العينة في حامل PDMS وأضف الوسائط المحددة أعلى العينة لمنع جفاف العينة وتوفير حل الناقل للخلايا الصادرة. بعد إحضار مرآة المعايرة في موضعها، قم بضبط تركيز المجهر للحصول على صورة حادة للمستعمرات داخل صفيف الهيدروجيل أو ميكروويل وتفقد لتحديد المستعمرات أو الآبار ذات الاهتمام.هنا، قم بتصميم أنماط الضوء بينما تظهر طريقة عرض الكاميرا المستعمرات داخل العينة لاختبار أنماط مختلفة لاستخراج الخلايا وحفظ النمط المحدد. ثم حدد قسم التحكم في الجلسة، ثم أضف التسلسل المحفوظ أسفل علامة التبويب التي تحمل اسم منتج أداة الإضاءة المنقوشة. اختر الخيار لتحفيز النمط لعرض موقع التعرض المطلوب وضبطه.بعد ذلك، قم بضبط شدة الضوء إلى 60٪ ووقت التعرض إلى 40 ثانية تحت علامة التبويب التحكم LED وابدأ عملية التعريض الضوئي. رصد تدهور هيدروجيل في الوقت الحقيقي ووضع برايتفيلد لضمان الإفراج عن الخلية. لجمع الخلية الصادرة، قم بتغيير فلتر المجهر من برايتفيلد إلى TRITC لتصور المنطقة المكشوفة للعينة بالعين المجردة.بمجرد أن تقع المنطقة المكشوفة ، ضع نهاية الأنبوب على البقعة المشععة ، ثم قم بتغيير فلتر المجهر مرة أخرى إلى Brightfield لمراقبة استرجاع الخلايا في الوقت الفعلي. استخدم المحاقن المرفقة بالطرف الآخر من الأنبوب لسحب 200 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على الخلايا المفرج عنها بعناية ونقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي عيار 1.5 ملليمتر لتحليل الحمض النووي أو الطلاء. تم استخدام أنماط مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية الدقيقة لاستخراج الخلايا من الهيدروجيلات السائبة ، مما أثر على مورفولوجيا الخلايا الصادرة.أدى التعرض للأشعة فوق البنفسجية في نمط حلقة في الإفراج عن مستعمرة كاملة مغلفة في هيدروجيل PEG واقية. في المقابل، من خلال تعريض جزء أو كل المستعمرة للأشعة فوق البنفسجية، يمكن استخراج الخلايا إما كتجمعات خلايا مجمعة أو كخلايا فردية حرة. كثافة بذر الخلية وسماكة الهيدروجيل مهمة لتغليف الخلية.أدت الهيدروجيلات الأرق إلى مستعمرات صغيرة مع الحد الأدنى من تداخل المستعمرة ، في حين أن الهيدروجيلات ذات السمك المتزايد أدت إلى تداخل المستعمرات ، مما قد يؤدي إلى استخراج مستعمرات متعددة. يمكن أن يسبب تداخل المستعمرات تلوثا متقاطعا أثناء الاستخراج بسبب الطبيعة ثنائية الأبعاد لنمط الضوء. عندما تم استهداف مستعمرة كبيرة، تم استخراج المستعمرة الأساسية أيضا معها.كما تم تقييم تأثير الأنماط الدقيقة المتنوعة للأشعة فوق البنفسجية على صلاحية الخلية. عندما تعرضت المستعمرات الدقيقة لجرعات خاضعة للرقابة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية في نمط دائري أو عبر، لم يتأثر استعادة الخلايا ونقاء الحمض النووي. تم استرجاع الخلايا بنجاح من صفائف microwell باستخدام هذا النهج ، وهو ما كان واضحا من صور المجهر الكونفوجكال التمثيلية ، حيث عند التشعيع في النمط الدائري والحلقي ، تمت إزالة الخلايا في النمط المعني.بعد الاستخراج من صفائف microwell ، تم تقييم صلاحية الخلية وكمية الحمض النووي. ولم تؤثر أنماط التعرض على عدد الخلايا القابلة للتطبيق ولا على جودة الحمض النووي، مما يشير إلى أنه يمكن استرجاع خلايا البكتيريا القابلة للحياة بشكل انتقائي من الخلايا الدقيقة بأقل قدر من الضرر، ويمكن عزل حمضها النووي بنقاء عال لتحليل الجينوم في المصب. تحقق دائما من أن الهيدروجيل قد تشكل قبل إزالة غطاء البيرفلوروالكيلاتيد.مطلوب الدقة والرعاية لوضع الفواصل لترسب الهيدروجيل واستخدام الأنابيب لاستخراج الخلايا.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية ليتيح فصل آثار Mechanotransduction الإشارات

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D هيدروجيل السقالات لالمفصلي خلية غضروفية الثقافة والجيل الغضروف

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

بناء وحدات صفائح هيدروجيل لتحجيم الكلي Micropatterned 3D الخلوية العمارة

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

رقاقة سلالة التدرج لتحفيز السلوكيات الخلوي في الخلية لادن المائية

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

تطبيقات للواح الاضاءه المتوافقة مع اللوحة المفتوحة المصدر

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

إعداد وتوصيف الحبر الحيوي الهجين الحيوي 3D القائم على الجرافين للهندسة العصبية الطرفية

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

تمكن صفائف الهيدروجيل من زيادة الإنتاجية لفحص تأثيرات مكونات المصفوفة والعلاجات في نماذج الأورام 3D

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

عزل ناقلات العلاج الجيني من الجيل التالي من خلال الهندسة والترميز الشريطي وفحص متغيرات قفيصة الفيروس المرتبط بالغدي (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...