Name: photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

这项研究得到了NSF职业奖#1944791的支持。

<ol>
	<li>Welch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+single+cell+isolation+for+genomics+using+microraft+arrays.">Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).</li><li>Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. K., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+high-throughput+screening+of+small+mutant+libraries.">A microfluidic platform for high-throughput screening of small mutant libraries.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5234-5242 (2016).</li><li>Ishii, S., Tago, K., Senoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+and+isolation+for+microbiology+and+biotechnology:+Methods+and+applications.">Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1281-1292 (2010).</li><li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ichip+for+high-throughput+in+situ+cultivation+of+“uncultivable+microbial+species”.">Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of “uncultivable microbial species”.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Zhao, X., Zhong, J., Wei, C., Lin, C. W., Ding, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+viable+but+nonculturable+state+in+foodborne+pathogens.">Current perspectives on viable but nonculturable state in foodborne pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 580 (2017).</li><li>Wang, X., Gou, X., Chen, S., Yan, X., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+manipulation+tool+with+combined+microwell+array+and+optical+tweezers+for+cell+isolation+and+deposition.">Cell manipulation tool with combined microwell array and optical tweezers for cell isolation and deposition.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 23 (7), 075006 (2013).</li><li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Poonlapdecha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-conjugated+ferromagnetic+nanoparticles+with+lateral+flow+test+strip+assay+for+rapid+detection+of+Campylobacter+jejuni+in+poultry+samples.">Antibody-conjugated ferromagnetic nanoparticles with lateral flow test strip assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in poultry samples.</a> International Journal of Food Microbiology. 286, 6-14 (2018).</li><li>Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomagnetic+separation:+An+effective+pretreatment+technology+for+isolation+and+enrichment+in+food+microorganisms+detection.">Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).</li><li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+Single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+flow+cytometry:+The+role+of+microfabrication+methodologies,+performance+and+functional+specification.">Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification.</a> Technology. 06 (01), 1-23 (2018).</li><li>Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+and+microbial+engineering.">Microfluidics and microbial engineering.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 432-446 (2016).</li><li>Kehe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+screening+of+synthetic+microbial+communities.">Massively parallel screening of synthetic microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12804-12809 (2019).</li><li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+degradation+of+chain+and+step-polymerized+photodegradable+hydrogels.">Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels.</a> Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties.">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li><li>Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+demand+release+and+retrieval+of+bacteria+from+microwell+arrays+using+photodegradable+hydrogel+membranes.">On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).</li><li>Barua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+discovery+of+positive+and+negative+interactions+among+root+microbiome+bacteria+using+microwell+recovery+arrays.">Simultaneous discovery of positive and negative interactions among root microbiome bacteria using microwell recovery arrays.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 3361 (2021).</li><li>Fattahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+rapid+screening,+isolation,+and+genetic+characterization+of+bacteria+with+rare+phenotypes.">Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes.</a> Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+copatterning+strategies+using+azlactone-based+block+copolymers.">Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabricating+reactive+surfaces+with+brush-like+and+crosslinked+films+of+azlactone-functionalized+block+co-polymers.">Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562 (2018).</li><li>Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+tracking+of+microbial+community+development+within+a+microwell+array+platform.">Assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55701 (2017).</li><li>. DNeasy Blood &amp; Tissue Handbook - QIAGEN Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en</a> (2021)</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+Maleimide-Thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+modified+salt-out+method+for+DNA+extraction+from+whole+blood+lymphocytes:+A+simple+and+economical+method+for+gene+polymorphism.">Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism.</a> Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28 (2018).</li><li>Hansen, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+of+bacteria+in+microwell+arrays+reveals+the+importance+of+confinement+in+community+development.">Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development.</a> PLoS One. 11 (5), 0155080 (2016).</li><li>Halsted, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transparent+microwell+arrays+for+optical+monitoring+and+dissection+of+microbial+communities.">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).</li><li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Hydrogel+Interactions+in+Tissue+Engineering:+Mechanisms+and+Applications.">Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160 (2013).</li><li>Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+interactions+between+bacteria+and+hydrogels.">Mechanical interactions between bacteria and hydrogels.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10893 (2018).</li></ol>

RRH和AJV已经为这项技术申请了专利。其余作者声明没有利益冲突。

本手稿展示了使用光降解水凝胶进行细菌筛选和分离。该材料和方法能够以直接且经济高效的方式实现高通量培养，控制生长培养基和生长条件，以及清洁和精确的细胞提取。提取只需要荧光显微镜与图案化照明工具相结合，并且可以按顺序完成以分离多个细胞靶标。每次提取需要5-10分钟才能完成，并且从单个水凝胶中除去多达30个靶向菌落。该方法的一个关键优点是其对各种不同测定形式的适应性，正如这里从散装水凝胶和微孔阵列中筛选所证明的那样。两种形式的分离过程已成功用于分离在培养和显微观察后表现出下游基因分型独特生长行为的细菌，这是将细胞基因型连接到表型的关键能力。迄今为止，从这些界面中提取的细菌的基因组表征包括16S扩增子测序，以鉴定来自环境微生物组的细菌的多物种集合，产生紧急生长行为18，以及全基因组测序以成功鉴定导致突变文库中存在的细胞中罕见生长谱的基因突变19。
使用散装水凝胶进行细胞筛选和分离是最直接和最简单的格式。在透明玻璃盖玻片上混合前体后，大量可光降解水凝胶迅速形成（25分钟），以将细胞封装在3-D细胞培养基质中，该基质用标准直立或倒置荧光显微镜成像。因此，该方法有可能转化为没有微加工资源或专业知识的常见微生物实验室。这种格式的缺点是细胞在整个三维水凝胶中随机定向。因此，当使用更高放大倍率物镜进行成像时，细胞可能会出现在焦平面之外，如果细胞集落彼此定向太近或存在垂直叠加的菌落，则提取可能很困难。如上所述沉积薄水凝胶（<13μm）对于减轻此缺点至关重要。在这里，在破碎的交叉光模式中曝光（图4B）是优选的，因为这种模式导致没有水凝胶的细胞对紫外线的暴露最小，并且可以通过电镀轻松恢复。
相比之下，微孔阵列格式提供了一个控制更好的接口，因为细菌细胞被分成离散的微孔，作为小培养或共培养位点17，18，26。微孔尺寸、间距和密度均使用标准光刻技术精确制造。与散装水凝胶相比，可以从微孔阵列中提取细菌，具有更高的特异性和更低的交叉污染机会，因为细胞仅存在于预定义的位置，而不是随机分散在整个水凝胶中。播种溶液中细菌细胞的浓度和比例也可以改变，以通过播种过程来控制微孔接种物的数量和组成，这在先前的报告26中已经有所表征，使用户在筛选的实验设计中具有灵活性。使用微孔阵列形式进行筛选的主要缺点是微细加工所需的额外时间和专业知识。据估计，每个阵列的微孔制造成本约为10美元，其中包括材料成本和洁净室费用。此外，微孔阵列传统上由硅制成，由于基板不透明，这可能会导致成像困难。此外，来自硅表面的大量光散射会限制微孔内的成像，并且在使用来自图案化照明工具的UV光照射水凝胶期间会降低图案分辨率（如图8A，B所示）。在透明石英衬底上已经制造了类似的微孔，以解决这些类型的局限性27;然而，这种制造要困难得多。在这里，暴露于照亮孔周边的环形图案是优选的，以便从孔中释放游离细胞，同时最大限度地减少紫外线照射。
无论哪种形式，最常见的问题都是由于水凝胶膨胀，在培养过程中水凝胶从底层底物上脱落。如果这是散装水凝胶的问题，则应使用适当的表面表征技术（XPS，ATR-FTIR，AFM等）验证基团在基材玻璃盖玻片表面上的化学（MTPS）附着层中硫醇基团的存在，密度和均匀性。由于表面功能化效率低下而导致的表面硫醇基团密度低，可导致底物与水凝胶之间的弱相互作用。如果发生低水平的表面硫化，应检查MTPS溶液的稳定性。在初始清洁载玻片时应小心，以确保在MTPS处理之前表面清洁，并应注意确保在MTPS表面反应期间使用无水甲苯（协议第4节）。在微孔阵列的情况下，表面不被硫醇化，水凝胶而是通过水凝胶的部分填充附着在孔中，水凝胶将水凝胶锚定在硅衬底17上。如果水凝胶分离是该系统中的一个问题，则可以将更多的微孔或其他微尺度特征蚀刻到阵列中，以进一步将水凝胶锚定在基板上，以促进更强的附着力。
无论哪种形式，该技术的局限性都是水凝胶在细菌存在下的有限稳定性。已经注意到，一些细菌，如A. tumefaciens，可以在5-7天17，19的过程中降解水凝胶，这限制了实验时间。目前正在对细菌降解机制进行调查;假设来自二丙烯酸酯单体的酯基团受到细菌介导的水解和/或酶降解的影响，如其它系统17中所述。开发更稳定的水凝胶化学物质将延长细菌可以留在水凝胶中的时间，并将筛选扩展到生长速度较慢的微生物。第二个限制是，在这两种格式中，细胞回收和提取都发生在开放环境中，导致相对较高的提取量（30-100μL），这可能容易受到外部污染。因此，必须注意确保从靶菌落中存在足够的细胞，同时最大限度地减少提取溶液体积。为了获得足够的细胞用于电镀和回收或提取DNA材料，观察到在散装水凝胶中，细胞必须培养足够长的时间以达到至少10μm的集落直径。为了降低细胞提取所需的体积，观察到使用微升注射器和管子（图2）比移液更有效。管道允许更准确地从释放点抽取分离物，需要更少的溶液体积并降低污染的机会。
未来的工作涉及了解水凝胶力学性质对细胞生长的影响，因为通过选择适当的基于PEG的各种分子量的单体前体28，这些水凝胶的机械特征得到了很好的控制，并且机械相互作用可能在细菌行为中发挥重要作用29。由于水凝胶材料可以很容易地掺入各种不同的系统和设备中，因此进一步的发展也集中在将这种材料集成到微流体系统中。这将减少飞升的提取溶液到皮升的体积，而目前开放收集格式需要传统的30-100μL体积。较小的溶液体积将大大减少潜在的污染，并使方法转向单细胞分离和表征。

从复杂和异质的环境中分离具有独特行为的细胞是获得生物学遗传信息的基础1。在微生物学中，观察后稀有或独特微生物的选择和分离在许多需要基因组信息和可观察表型信息之间连接的应用中变得非常重要。这些应用包括从突变文库2中选择表型罕见的菌株，从复杂的微生物群落3，4中选择关键微生物，以及从等基因群体中选择表型罕见但重要的细菌。从细菌群体中分离出可存活但不可培养的细胞（VBNC）是后者的一个重要例子，其中具有VBNC表型的细胞通常以1：102至1：105的比例隐藏在细菌群体中5，6。由于细菌分离的广泛困难，许多表型罕见的微生物仍然未知。这些局限性强调了细胞分离技术的必要性，即首先从混合物中鉴定出一个或多个目标细胞，然后检索并分离它们以进行下游分子分析7。
一些最常用的细胞分离方法包括流式细胞术和荧光活化细胞分选（FACS）8，免疫磁性分离9，10和微流体11。虽然这些隔离方法具有很高的价值，但它们也有限制其使用的缺点。例如，FACS可以在单细胞水平上为后续基因组分析提供常规微生物分离3，但通常受到其可用性和费用以及下游污染问题的限制11。基于微流体的方法，如微流体流式细胞术已经引起了很多关注，与传统的流式细胞术相比，它允许显着减少所需的样品体积12。然而，从微流体装置中分离和检索单个或少量细胞集合通常是一个具有挑战性的问题，通常需要更复杂的设置和装置设计13。许多基于微流体的方法在细胞被输入和观察之前在装置14中对细胞进行遗传表征，限制了在进行功能筛选时观察到的独特物种的数量。鉴于这些局限性，许多实验室需要进一步创新对细胞筛选和分离具有实用性的方法和材料。
本文提出了一种新的、基于材料的细菌筛选和分离方法。该方法使用可光降解的水凝胶进行细胞封装，培养，显微镜观察以及按需释放和回收具有独特表型的目标细菌。水凝胶被设计为包含10nm的目尺寸，其中每个交联含有15个o-硝基苄基。该材料封装或捕获细胞以进行观察，同时使营养物质和废物能够扩散到细胞中或从细胞中扩散以进行培养。通过正置显微镜将材料暴露于图案化的365nm紫外光源下，可以通过邻硝基苄基团16，17的光清除使水凝胶的局部降解。降解触发细胞的选择性释放，用于下游分析的回收，包括基因组学，以及潜在的蛋白质组学和转录组学分析。实验设置和方案相对简单，便宜，并且可以转化为微生物学实验室。它只需要通过水凝胶形成进行细胞封装，用直立的明场和荧光显微镜观察捕获的细胞，以及用图案化的UV光源照射感兴趣的细胞以进行检索。
这种基于材料的筛选方法的一个关键优点是它对不同筛选格式的适应性。在其最基本的格式中，该材料可以通过将异质细胞集合封装在散装水凝胶中来用于筛选。然后观察细胞的所需表型，并去除感兴趣的单个细胞以进行基因组表征。在更复杂的格式中，材料还可以集成到芯片实验室设备中，以提供精确的细胞释放和从设备所需区域的检索。这里描述了这两种格式，并且都使最近的新型微生物筛选和选择应用成为可能17，18，19。该方法在这里用模式革兰氏阴性生物（大肠杆菌，根瘤菌）和革兰氏阳性生物（枯草芽孢杆菌）来证明，并且很容易扩展到各种其他细菌。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>175617-25G</td>
			<td>&#62; 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox detergent powder</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>1104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Certified ACS Granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave SK300C</td>
			<td>Yamato Scientific</td>
			<td>18016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 1A1135</td>
			<td>Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td>1A1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield upright microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C614-500</td>
			<td>For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>0188-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: -30-60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: &#60; 32 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli ATCC 25922</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R19020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium microscope slides plain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td>Contains inhibitor, 30 wt% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incu-Shaker Mini</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>E5-0014-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 7-hydrate</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Avantor Performance Materials, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen, compressed</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)</td>
			<td>NOF America Corporation</td>
			<td>PTE-100SH</td>
			<td>Sunbright-PTE-100SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>K813-500ML</td>
			<td>Store between 15 &#176;C&#8211;30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon400</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>DSI-D-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>25 x 75 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>BioXtra, &#62; 98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505-250G</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#62; 99.0% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel thickness gage</td>
			<td>Precision Brand Products</td>
			<td>77739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-1L</td>
			<td>Anhydrous, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td>For microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FS-110H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation

生物学家长期以来一直试图了解表型和基因型之间的关系。为了更好地理解这种联系，开发实用技术至关重要，该技术将微观细胞筛选与高纯度的细胞分离相结合，以进行下游遗传分析。在这里，描述了使用可光降解的聚（乙二醇）水凝胶来筛选和分离来自异质细胞群的具有独特生长表型的细菌。该方法依赖于用水凝胶封装或包埋细胞，然后进行培养，显微镜筛选，然后使用高分辨率光图案化工具进行时空控制水凝胶降解并将所选细胞释放到溶液中进行检索。应用不同的光模式可以控制提取细胞的形态，并且环或交叉等模式可用于以最小的直接紫外线照射检索细胞，以减轻DNA对分离株的损伤。此外，光图案化工具提供可调节的光剂量，以实现各种降解和细胞释放速率。它允许以高分辨率降解，从而能够以微米级的空间精度进行细胞检索。在这里，演示了使用这种材料来筛选和检索来自散装水凝胶和微加工芯片实验室设备的细菌。该方法价格低廉，简单，可用于微生物学中的常见和新兴应用，包括从突变文库中分离具有罕见生长谱的细菌菌株，以及分离具有新兴表型的细菌联盟以进行基因组表征。

为了研究紫外光触发受控水凝胶降解以释放细胞的能力，首先将水凝胶封装在没有细菌存在的硫化盖玻片上。每个水凝胶暴露在不同强度和曝光时间的三种复制圆形模式的光下。在紫外光照射后计算凝胶降解百分比，在每种光强度下，然后通过将侧链硫醇基团与荧光素-5-maelimide染料偶联用于荧光成像来量化暴露时间19，24。这两个参数如何影响水凝胶降解的代表性示例如图3所示。显而易见，图案化照明工具提供的图案光以仅能够释放少量细胞的分辨率提供对水凝胶降解的时空控制。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig03.jpg"> 图3：控制水凝胶降解。 紫外光剂量和由此产生的水凝胶降解速率可通过图案化照明工具进行调节。（插图）选择两种不同的光强度进行图案化水凝胶降解。在365nm紫外光照射后，用荧光素-5-马来酰亚胺标记水凝胶进行荧光成像。转载（改编）经Fattahi等人许可19 版权所有 2020 美国化学学会。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
对于细胞提取，使用不同的光模式来研究细胞释放（图4）。在这里， 将农杆菌 细菌细胞封装在硫醇化玻璃盖玻片上的散装水凝胶中，然后培养成微尺度菌落。然后在明场显微镜下检查水凝胶，并将目标微克隆暴露于不同的紫外光模式。观察到不同的暴露模式影响了释放细胞的形态。这对各种应用都有潜在的好处。例如，暴露目标菌落周围的环形图案会导致整个菌落的释放仍然封装在保护性PEG水凝胶中，并且没有直接的紫外线照射（图4A），这可以保存细胞并提供易于下游纯化。相反，通过将部分或全部菌落暴露在紫外光下，细胞可以作为聚集的细胞簇（图4B）或游离的单个细胞（图4C）提取。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig04.jpg"> 图4：控制提取细胞的形态（A）使用环形图案释放整个细胞集落，保护在PEG基质中。（B） 使用破碎的交叉模式在聚集体中释放细胞。（C） 使用交叉图案释放单个细胞。经Fattahi等人许可转载（改编）19 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
封装方案中的关键是细胞接种密度和水凝胶的厚度，因为这两个参数都会影响掺入水凝胶中用于观察的细胞数量。为了证明，使用培养的薄垫片（12.7μm）或厚垫片（40μm）将 A. tumefaciens 细胞样品封装到两种不同厚度的水凝胶中，并按照既定方案成像。更薄的水凝胶导致整个水凝胶的微克隆密度为90个/ mm2， 其中观察到最小的菌落重叠（图5A）。相反，大于12.7μm的水凝胶厚度导致在垂直方向上形成重叠的菌落（图5B），这可能导致提取多个菌落。由于光图案的二维性质，重叠的菌落在提取过程中会导致交叉污染。例如，可以靶向顶部菌落，同时也可以用它提取底层菌落（图5C）。因此，建议使用12.7μm垫片进行水凝胶制备。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig05.jpg"> 图5：水凝胶厚度影响提取纯度。 （A）通过利用厚度为12.7μm的垫片形成水凝胶，菌落在一个10倍的焦平面内形成。（B） 如果使用厚度大于12.7μm的垫片，则可以在10倍放大倍率下观察到菌落的覆盖。（C）在细胞释放过程中，菌落的叠加可能发生交叉污染：（i）使用环形模式释放靶向细胞集落，（ii）靶向细胞集落与水凝胶分离，以及（iii）在靶向集落下方的光照照期间观察到第二个潜在的集落。该菌落也被移除，导致交叉污染。转载（改编）经Fattahi等人许可19版权所有 2020 美国化学学会。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
鉴于紫外光对细菌的潜在损害，使用模型，革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌）和模型，革兰氏阴性菌（大肠杆菌）进一步研究了各种紫外光微模式对细胞活力的影响。将每种水凝胶封装在散装水凝胶中，并根据标准方案培养成微尺度菌落，验证它们与水凝胶的相容性。然后将相同大小（26±1μm直径）的目标微克隆暴露于恒定的光剂量（168 mJ / mm2），以圆形模式的形式将整个微克隆暴露于紫外线或交叉模式，仅降解水凝胶边缘以最大限度地减少对细胞的光暴露。然后回收细胞并接种以量化从每个集落中回收的CFU / mL。未发现细胞恢复水平的显着差异（图6A）。为了进一步研究提取细胞的纯度，从 大肠杆菌 样品中提取DNA并使用紫外可见分光光度计进行分析。对于这两种模式，DNA质量水平都在A260/ A280 范围内，介于1.8和2.0之间（图6B），这是基因组测序的理想范围25。这表明，在所述条件下用于释放的UV模式对从大量水凝胶中回收的活细胞数量或提取后的基因组DNA质量的影响最小。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig06.jpg"> 图6：不同光照模式对从大量水凝胶中释放的细菌的细胞活力和DNA质量的影响（A）使用交叉模式和圆形模式提取后大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的细胞恢复水平。对于该实验，从具有相同直径（26μm±1μm）的球形菌落中进行提取，以确保每个菌落释放的细胞数量是等效的。然后将提取的溶液电镀以计算从每种模式获得的CFU / mL。统计分析显示，从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的交叉和圆形模式中获得的CFU / mL无显着差异（两种菌株的P值>0.05，n = 6）。（B） 使用交叉和圆形模式对分离的大肠杆菌细胞的DNA质量进行分光光度法定量。在这里，统计分析没有显示所用模式的DNA质量显着差异（P值>0.05，n = 6）（C）暴露于交叉和圆形图案的具有相同直径的菌落的明场图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
微孔阵列提供了一种替代的芯片实验室筛选界面，与散装水凝胶相比，可提供更可控的筛选功能。例如，微孔阵列可以将细菌接种到可以控制接种物中细胞数量的离散培养位点。微孔的几何特征，如井深和直径，也通过标准的微细加工方法进行控制。有了这些好处，微孔可用于研究细菌在空间限制下26的生长，最近用于发现不同细菌物种在微尺度上限制在一起时的共生和拮抗相互作用18。从孔中提取细胞进行基因组分析，如16S扩增子测序，对于这些应用至关重要。使用相同的水凝胶材料，紫外线可以暴露在含有感兴趣细胞的孔上，无论是圆形还是环形图案。 后者确保仅在微孔周边进行水凝胶降解，以防止细胞的直接照射。为了证明这一点，将表达mCherry 的A. tumefaciens 细胞接种到孔中，然后将水凝胶连接到微孔阵列上。培养细胞，然后用圆形或环形图案照射细胞。然后用荧光素-5-马来酰亚胺染料染色膜。双色荧光图像显示，膜和孔内的细胞都被移除以进行两种照射模式17。与体水凝胶形式不同，这里的细胞提取仅以细胞簇18的形状观察到。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig07.jpg"> 图7：具有代表性的共聚焦显微镜图像，显示光模式对微孔阵列细胞分离的影响。（A） 在播种和培养后直径为40μm的含有细菌（红色）的微孔。（B） 使用圆形和环形图案（蓝色）进行光照。（C）减少的红色荧光表明细胞是从辐照孔中提取的。（D） 照射后膜和细菌的双色荧光图像，表明从靶井中去除水凝胶（绿色）和细菌（红色）。（E）Z-堆叠，目标孔的双色荧光图像。（D）中的红线表示在（E）中成像的xz平面，（E）中的绿线表示在（D）中成像的xy平面。将图像中的样品（C-E）洗涤以去除释放的细胞，然后固定并成像。比例尺 = 40 μm。转载（改编）经范德弗利斯等人许可17.版权所有 2019 美国化学公司。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
为了量化以这种格式提取后的细菌细胞活力和DNA质量，接种枯草芽孢杆菌和大肠杆菌细胞，然后使用圆形和环形图案从微孔阵列中释放（图8A，B）。然后将释放的细胞接种在ATGN琼脂平板上，并定量提取细胞的DNA质量。为了确保在每次提取过程中存在一致数量的细胞，具有相似荧光强度（〜6000 A.U.）的微孔因此被靶向释放。使用圆形图案提取的活细胞数量与使用环形图案提取的任一细菌的活细胞数量没有显着差异（图8C）。此外，两种细菌的圆圈和环形图案之间的DNA质量水平没有显着差异（图8D）。因此，与散装水凝胶中的发现类似，在这里指定的强度和持续时间下施加紫外光对从微孔阵列中提取的细胞的活力和DNA质量的影响可以忽略不计。这些发现表明，可以从微孔中选择性地检索活细菌细胞，而对下游分析的损害最小。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig08.jpg"> 图8：不同光照模式对微孔阵列释放的细菌的细胞活力和DNA质量的影响。 （A，B）对于 大肠杆菌 和 枯草芽孢杆菌，圆图和环形图用于从10μm微孔中提取细胞。本实验使用直径为10μm的圆形图案和内径为10μm，外径为20μm的环形图案进行细胞提取。使用具有相同直径的微孔来确保每个微孔释放的细胞数量相同。（C）然后将提取的溶液电镀以计算从每种暴露模式获得的CFU / mL。统计分析显示 ，大肠杆菌 和 枯草 芽孢杆菌从圆形和环形图中获得的CFU/mL无显著差异（两种菌株的P值>0.05，n = 6）。（D） 分光光度法用于测量 大肠杆菌 和 枯草芽孢 杆菌细胞的DNA质量，使用圆形和环形图。在这里，统计分析没有显示所用模式的DNA质量有任何显着差异（两种菌株的P值>0.05，n = 6）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充图1：微孔阵列的设计和制造。（A）标准微加工技术被应用于在硅晶圆上制造微孔阵列。（B）每个基板由7 x 7个直径为10μm的井阵列组成，深度为20μm，间距为30μm。（C）每个阵列由225个微孔组成。这个数字是从Barua等人18修改而来的。版权所有 2021 前沿媒体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

据报道，使用光降解水凝胶通过高分辨率光拍工具分离细菌细胞。回顾了该过程的基本实验程序，结果和优点。该方法可以快速、廉价地分离出来自异质群落或种群的具有罕见或独特功能的靶向细菌。

用于细菌筛选、选择和分离的可光降解水凝胶接口

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

该协议旨在从筛选界面中快速分离细胞以进行基因组表征，并且此功能非常重要，因为它可以将宏观可观察的细胞特征与基因组信息相结合。使用该技术，可以以操作简单的方式分离来自筛选界面的靶向细菌细胞，具有高空间位置。水凝胶可以在其他筛选接口中实现。水凝胶材料可以很容易地掺入微流体通道中，以便从微流体装置中按需检索细胞。首先接种具有所需细胞密度的交联缓冲液。通过加入12.5微升交联缓冲液和5.6微升PEG ONB二丙烯酸酯溶液，在0.5毫升微量离心管中制备水凝胶前体溶液。最后，向混合物中加入6.9微升前臂PEG硫醇溶液。对于水凝胶前体溶液中的细胞封装，将硫醇化的基础盖玻片放在干净的培养皿上，并在盖玻片的两个相对侧放置两个垫片。通过将垫片贴在培养皿上，将垫片固定在底盖上。在非反应性全氟烷基化载玻片上加入所需体积的前体溶液后，将载玻片放在基盖玻片上，并允许水凝胶在室温下完成25分钟。凝胶化完成后，轻轻除去全氟烷基化的载玻片。将底物置于含有补充有抗生素的ATGN培养基的60×15毫米培养皿中。在微孔阵列底物上播种700微升具有0.1 OD 600的细菌细胞悬浮液，并使用pH 8的12.5微升磷酸盐缓冲盐水ATGN使水凝胶前体溶液如前所述。在非反应性全氟烷基化载玻片上移取12.5微升的前体溶液，并将两个38微米的钢垫片放在微孔阵列基板的两个相对侧，用细胞接种。然后用前体溶液液滴倒置全氟烷基化的载玻片，并将液滴置于微孔基板的中间。当水凝胶在室温下孵育25分钟后形成时，轻轻地从微孔底物中取出载玻片，并将底物置于含有补充有抗生素的ATGN培养基的培养皿中。将样品放入PDMS支架中，并将定义的培养基添加到样品顶部，以防止样品脱水，并为释放的细胞提供载体溶液。将校准镜就位后，调整显微镜焦点以获得水凝胶或微孔阵列内菌落的清晰图像，并检查以识别感兴趣的菌落或孔。在这里，设计光模式，同时相机视图显示样品内的菌落，以测试不同的细胞提取模式并保存定义的模式。然后选择会话控制部分，在标题为图案照明工具产品名称的选项卡下添加保存的序列。选择用于刺激图案的选项以查看和调整所需的曝光位置。接下来，在LED控制选项卡下将光强度调整为60%，将曝光时间调整为40秒，然后开始曝光过程。实时监测水凝胶降解和明场模式，以确保细胞释放。要收集释放的细胞，请将显微镜滤光片从明场更改为TRITC，以肉眼可视化样品的暴露区域。找到暴露区域后，将管子的末端放在照射的点上，然后将显微镜滤光片更换回明场以实时监测细胞检索。使用连接到管子另一端的注射器小心地抽出含有释放细胞的200微升溶液，并将溶液转移到1.5毫米离心管中进行DNA分析或电镀。使用不同的紫外光微模式从大量水凝胶中提取细胞，这影响了释放细胞的形态。环形图案的紫外线暴露导致整个菌落释放，封装在保护性PEG水凝胶中。相反，通过将部分或全部菌落暴露在紫外线下，细胞可以作为聚集的细胞簇或游离的单个细胞被提取。水凝胶的细胞接种密度和厚度对于细胞封装很重要。较薄的水凝胶产生具有最小菌落重叠的微菌落，而厚度增加的水凝胶导致重叠的菌落，这可能导致多个菌落的提取。由于光图案的二维性质，重叠的菌落在提取过程中会导致交叉污染。当一个顶级殖民地成为目标时，底层殖民地也被提取出来。还评估了各种紫外光微模式对细胞活力的影响。当微菌落暴露于受控剂量的圆形或交叉模式的紫外线时，细胞恢复和DNA纯度不受影响。使用这种方法成功地从微孔阵列中检索细胞，这从代表性的共聚焦显微镜图像中可以明显看出，其中在圆形和环形图案中照射时，细胞以各自的图案被移除。从微孔阵列中提取后，评估细胞活力和DNA数量。暴露模式既不影响活细胞计数，也不影响DNA质量，表明可以从微孔中选择性地检索活细菌细胞，损害最小，并且它们的DNA可以高纯度分离用于下游基因组分析。在除去全氟烷基化的盖玻片之前，请务必检查水凝胶是否已经形成。放置用于水凝胶沉积的垫片和使用管道提取细胞需要精确和小心。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

去耦力学传递线索的影响制备羟基聚丙烯酰胺水凝胶的

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

科研

生物工程

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D水凝胶支架的关节软骨细胞培养及软骨生成

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

构建模块化水凝胶片的微模式化宏观缩放3D细胞结构

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

在单元格拉丹水凝胶中刺激细胞行为的应变梯度芯片

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

生物活性蛋白或多肽在水凝胶上的应用

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

肾皮质细胞外基质衍生水凝胶的制备

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

开源微孔板兼容照明面板的应用

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

用于外周神经工程的石墨烯基3D生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

水凝胶阵列可提高 3D 肿瘤模型中基质成分和治疗药物筛选效果的通量

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

通过工程、条形码和筛选腺相关病毒 （AAV） 衣壳变体分离下一代基因治疗载体

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...