Name: photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af NSF CAREER Award #1944791.

<ol>
	<li>Welch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+single+cell+isolation+for+genomics+using+microraft+arrays.">Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).</li><li>Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. K., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+high-throughput+screening+of+small+mutant+libraries.">A microfluidic platform for high-throughput screening of small mutant libraries.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5234-5242 (2016).</li><li>Ishii, S., Tago, K., Senoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+and+isolation+for+microbiology+and+biotechnology:+Methods+and+applications.">Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1281-1292 (2010).</li><li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ichip+for+high-throughput+in+situ+cultivation+of+“uncultivable+microbial+species”.">Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of “uncultivable microbial species”.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Zhao, X., Zhong, J., Wei, C., Lin, C. W., Ding, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+viable+but+nonculturable+state+in+foodborne+pathogens.">Current perspectives on viable but nonculturable state in foodborne pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 580 (2017).</li><li>Wang, X., Gou, X., Chen, S., Yan, X., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+manipulation+tool+with+combined+microwell+array+and+optical+tweezers+for+cell+isolation+and+deposition.">Cell manipulation tool with combined microwell array and optical tweezers for cell isolation and deposition.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 23 (7), 075006 (2013).</li><li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Poonlapdecha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-conjugated+ferromagnetic+nanoparticles+with+lateral+flow+test+strip+assay+for+rapid+detection+of+Campylobacter+jejuni+in+poultry+samples.">Antibody-conjugated ferromagnetic nanoparticles with lateral flow test strip assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in poultry samples.</a> International Journal of Food Microbiology. 286, 6-14 (2018).</li><li>Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomagnetic+separation:+An+effective+pretreatment+technology+for+isolation+and+enrichment+in+food+microorganisms+detection.">Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).</li><li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+Single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+flow+cytometry:+The+role+of+microfabrication+methodologies,+performance+and+functional+specification.">Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification.</a> Technology. 06 (01), 1-23 (2018).</li><li>Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+and+microbial+engineering.">Microfluidics and microbial engineering.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 432-446 (2016).</li><li>Kehe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+screening+of+synthetic+microbial+communities.">Massively parallel screening of synthetic microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12804-12809 (2019).</li><li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+degradation+of+chain+and+step-polymerized+photodegradable+hydrogels.">Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels.</a> Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties.">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li><li>Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+demand+release+and+retrieval+of+bacteria+from+microwell+arrays+using+photodegradable+hydrogel+membranes.">On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).</li><li>Barua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+discovery+of+positive+and+negative+interactions+among+root+microbiome+bacteria+using+microwell+recovery+arrays.">Simultaneous discovery of positive and negative interactions among root microbiome bacteria using microwell recovery arrays.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 3361 (2021).</li><li>Fattahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+rapid+screening,+isolation,+and+genetic+characterization+of+bacteria+with+rare+phenotypes.">Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes.</a> Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+copatterning+strategies+using+azlactone-based+block+copolymers.">Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabricating+reactive+surfaces+with+brush-like+and+crosslinked+films+of+azlactone-functionalized+block+co-polymers.">Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562 (2018).</li><li>Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+tracking+of+microbial+community+development+within+a+microwell+array+platform.">Assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55701 (2017).</li><li>. DNeasy Blood &amp; Tissue Handbook - QIAGEN Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en</a> (2021)</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+Maleimide-Thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+modified+salt-out+method+for+DNA+extraction+from+whole+blood+lymphocytes:+A+simple+and+economical+method+for+gene+polymorphism.">Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism.</a> Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28 (2018).</li><li>Hansen, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+of+bacteria+in+microwell+arrays+reveals+the+importance+of+confinement+in+community+development.">Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development.</a> PLoS One. 11 (5), 0155080 (2016).</li><li>Halsted, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transparent+microwell+arrays+for+optical+monitoring+and+dissection+of+microbial+communities.">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).</li><li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Hydrogel+Interactions+in+Tissue+Engineering:+Mechanisms+and+Applications.">Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160 (2013).</li><li>Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+interactions+between+bacteria+and+hydrogels.">Mechanical interactions between bacteria and hydrogels.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10893 (2018).</li></ol>

RRH og AJV har indgivet et patent på denne teknologi. De resterende forfattere erklærer ingen interessekonflikt.

Dette manuskript demonstrerer brugen af fotodegradable hydrogeler til bakteriescreening og isolation. Materialet og tilgangen muliggør kultur med høj gennemløb, kontrol over vækstmedier og vækstbetingelser og ren og præcis celleudvinding på en enkel og omkostningseffektiv måde. Ekstraktion kræver kun et fluorescerende mikroskop kombineret med det mønstrede belysningsværktøj og kan gøres på en sekventiel måde for at isolere flere cellemål. Hver ekstraktion tager 5-10 minutter at udføre, og op til 30 målrettede kolonier er blevet fjernet fra en enkelt hydrogel. En vigtig fordel ved tilgangen er dens tilpasningsevne til en række forskellige analyseformater, som det fremgår her med screening fra både bulk hydrogels og microwell arrays. Adskillelsesprocessen i begge formater er med succes blevet brugt til at isolere bakterier, der viser unik vækstadfærd for downstream genotyping efter kultur og mikroskopisk observation, en kritisk evne til at forbinde cellegenotype til fænotype. Til dato har genomiske karakteriseringer af bakterier udvundet fra disse grænseflader inkluderet 16S amplicon sekventering for at identificere multi-arter samlinger af bakterier fra miljømæssige mikrobiomer, der genererer emergent vækst adfærd18, og for hele genom sekventering til held identificere genetiske mutationer, der forårsager sjældne vækstprofiler i celler til stede i mutant biblioteker19.
Brug bulk hydrogels til celle screening og isolation er den mest ligetil og enkle format. Bulk fotodegradable hydrogels form hurtigt (25 min) efter blanding af prækursorer over gennemsigtige glas coverslips at indkapsle celler i en 3-D celle kultur matrix, der er afbildet med en standard opretstående eller omvendt fluorescens mikroskop. Metoden har således potentiale til at være translationel til fælles mikrobiologiske laboratorier, der ikke har mikrofabrikationsressourcer eller ekspertise. En ulempe ved dette format er, at celler er tilfældigt orienteret i hele den tredimensionelle hydrogel. Derfor kan celler vises ud af fokusplanet, når billeddannelse med højere forstørrelsesmål og ekstraktion kan være svært, hvis cellekolonier er orienteret for tæt på hinanden, eller hvis der er en lodret overlejring af kolonier. Deponering af en tynd hydrogel (<13 μm) som beskrevet er afgørende for at afbøde denne ulempe. Eksponering i brudte krydslysmønstre (Figur 4B) er at foretrække her, da dette mønster resulterer i celler fri for hydrogel, der har minimal eksponering for UV-lys og let kan genvindes gennem plating.
I modsætning hertil giver microwell array-formatet en mere velkontrolleret grænseflade, da bakterieceller opdeles i diskrete mikrowells, der tjener som små kultur- eller samkultursteder17,18,26. Microwell dimension, pitch, og densitet er præcist fremstillet ved hjælp af standard fotolitografiske teknikker. Sammenlignet med bulk hydrogels, bakterier kan udvindes fra microwell arrays med en højere grad af specificitet og lavere chance for krydskontaminering, da cellerne kun er til stede på foruddefinerede steder, ikke tilfældigt spredt i hele hydrogel. Koncentrationen og forholdet mellem bakterieceller i såningsopløsningen kan også varieres for at kontrollere mængden og sammensætningen af mikrobonindoculum gennem en såningsproces, der er karakteriseret i tidligere rapporter26, hvilket giver brugeren fleksibilitet i skærmens eksperimentelle design. Den primære ulempe ved screening med microwell array format er den ekstra tid og ekspertise, der kræves for mikrofabrikation. Fabrikation af mikrowells blev anslået til at koste ~ $ 10 per array, som omfatter materialeomkostninger og renrum udgifter. Derudover er mikrowells arrays traditionelt lavet af silicium, hvilket kan forårsage billedvanskeligheder, da substraterne er uigennemsigtige. Desuden kan en høj mængde lysspredning fra siliciumoverfladen begrænse billeddannelsen i mikrobrne og kan reducere mønsteropløsningen under hydrogeleksponering med UV-lys fra det mønstrede belysningsværktøj (set i figur 8A, B). Lignende mikrowells er fremstillet på gennemsigtige kvartssubstrater for at imødegå disse typer begrænsninger27; Denne fabrikation er imidlertid betydeligt vanskeligere. Eksponering for ringmønstre, der belyser brøndens omkreds, er at foretrække her for at frigive frie celler fra brøndene, samtidig med at UV-eksponering minimeres.
Det mest almindelige problem, der opstår i begge formater er løsrivelse af hydrogel fra det underliggende substrat under kultur på grund af hydrogel hævelse. Hvis dette er et problem for bulk hydrogels, tilstedeværelsen, tæthed og ensartethed af thiol grupper i den kemiske (MTPS) vedhæftede lag på tværs af overfladen af basen glas coverlip bør verificeres ved hjælp af en passende overflade karakterisering teknik (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Lave tætheder af overflade thiol grupper på grund af ineffektiv overfladefunktionalisering kan føre til en svag interaktion mellem substratet og hydrogel. Hvis der forekommer et lavt overflade thiolationsniveau, skal stabiliteten af MTPS-opløsningen kontrolleres. Der skal udvises forsigtighed ved den første rensning af glasrutschebanen for at sikre en ren overflade før MTPS-behandlingen, og der skal udvises forsigtighed for at sikre brugen af vandfri toluen under MTPS-overfladereaktionen (protokolafsnit 4). I tilfælde af mikrowell arrays er overflader ikke thiolerede, og hydrogels fastgøres i stedet gennem den delvise påfyldning af brøndene med hydrogelen, som forankrer hydrogelen til siliciumsubstratet17. Hvis hydrogel løsrivelse er et problem i dette system, flere mikrowells eller andre mikroskala funktioner kan ætses ind i array til yderligere forankre hydrogel til substratet for at fremme stærkere fastgørelse.
En begrænsning af teknikken i begge formater er hydrogelernes begrænsede stabilitet i nærværelse af bakterier. Det er blevet bemærket, at nogle bakterier, såsom A. tumefaciens, kan nedbryde hydrogel i løbet af 5-7 dage17,19, hvilket begrænser eksperimentet tid. Den nuværende undersøgelse af mekanismerne for bakterieforringelse er i gang; det er en hypotese, at de estergrupper, der er til stede fra diaklolatmonomererne, udsættes for bakteriemedieret hydrolyse og/eller enzymatisk nedbrydning, som nævnt i andre systemer17. Udvikling af mere stabile hydrogelkemikalier vil forlænge den tid, bakterier kan forblive i hydrogel og vil udvide skærmen til mikroorganismer med langsommere vækstrater. En anden begrænsning er, at cellegenopretning og udvinding i begge formater forekommer i et åbent miljø, hvilket resulterer i relativt høje ekstraktionsmængder (30-100 μL), som kan være modtagelige for ekstern forurening. Således skal man sørge for at sikre, at der er nok celler til stede fra målkolonierne, samtidig med at ekstraktionsopløsningsvolumen minimeres. For at opnå nok celler til plating og nyttiggørelse eller til udvinding af DNA-materiale blev det observeret, at celler i bulkhydrogeler skal dyrkes længe nok til at nå kolonidiametre på mindst 10 μm. For at sænke den krævede volumen til celleudvinding blev det observeret, at det var mere effektivt at bruge en mikrolitersprøjte og slange (figur 2) end pipettering. Slangen gjorde det muligt at trække isolaterne mere præcist fra udløsningspunktet, hvilket krævede mindre opløsningsvolumen og sænkede risikoen for forurening.
Fremtidigt arbejde indebærer forståelse af effekten af hydrogel mekaniske egenskaber på cellevækst, som mekaniske træk ved disse hydrogels er godt kontrolleret af udvælgelsen af passende PEG-baserede monomer prækursorer af forskellige molekylvægte28, og mekaniske interaktioner sandsynligvis spiller en vigtig rolle i bakterier adfærd29. Da hydrogelmaterialerne let kan indarbejdes i en række forskellige systemer og enheder, er videreudviklingen også fokuseret på integration af dette materiale i mikrofluidiske systemer. Dette vil reducere udvindingsopløsningen til femtoliter til picolitermængder sammenlignet med traditionelle 30-100 μL-mængder, der i øjeblikket kræves i åbent indsamlingsformat. Mindre løsningsmængder vil i høj grad reducere potentiel forurening og flytte tilgangen til enkeltcellet isolation og karakterisering.

Isolering af celler med unik adfærd fra et komplekst og heterogent miljø er afgørende for at opnå genetisk information i biologi1. I mikrobiologi bliver udvælgelse og isolering af sjældne eller unikke mikrober efter observation vigtige i mange applikationer, der kræver en forbindelse mellem genomisk information og observerbar fænotypisk information. Disse anvendelser omfatter valg af fænotypisk sjældne stammer fra mutant biblioteker2,vælge keystone mikroorganismer fra komplekse mikrobielle samfund3,4, og vælge fænotypisk sjældne, men vigtige bakterier fra isogene populationer. Isolering af levedygtige, men ikke-culturable celler (VBNC) fra en bakteriepopulation er et vigtigt eksempel på sidstnævnte, hvor celler med VBNC-fænotypen ofte er skjult i bakteriepopulationer ved 1:102 til 1:105 nøgletal5,6. På grund af de udbredte vanskeligheder i bakterier isolation, meget er stadig ukendt om mange fænotypisk sjældne mikroorganismer. Disse begrænsninger understreger behovet for celleisolation teknikker til først at identificere målcellen eller cellerne fra en blanding og derefter hente og isolere dem til downstream molekylær analyse7.
Nogle af de mest almindeligt etablerede metoder til celleisolation omfatter flowcytometri og fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS)8, immunomagnetisk adskillelse9,10og mikrofluidics11. Mens disse isolationsmetoder har høj værdi, har de også ulemper, der begrænser deres anvendelse. F.eks. kan FACS give rutinemæssig mikrobiel isolation på enkeltcelleniveau til opfølgende genomisk analyse3, men er ofte begrænset af dets tilgængelighed og omkostninger samt downstream-forureningsproblemer11. Mikrofluidiske tilgange såsom mikrofluidisk flowcytometri har fået meget opmærksomhed, hvilket sammenlignet med konventionel flowcytometri giver mulighed for en betydelig reduktion i det krævede prøvevolumen12. Adskillelse og hentning af en individuel eller lille samling af celler fra mikrofluidiske enheder er dog ofte et udfordrende problem, der typisk kræver en mere kompleks opsætning og enhedsdesign13. Mange mikrofluidiske tilgange karakteriserer genetisk celler, før de indtastes og observeres i en enhed14, hvilket begrænser antallet af unikke arter, der observeres, når de udfører en funktionel skærm. I betragtning af disse begrænsninger er der behov for yderligere innovation af både metoder og materialer, der er praktiske til cellescreening og isolation, til udbredt brug i mange laboratorier.
Dette papir præsenterer en ny, materialebaseret tilgang til bakteriescreening og isolation. Metoden bruger fotodegradable hydrogels til celleindkapsling, kultur, mikroskopisk observation og on-demand frigivelse og genopretning af målrettede bakterier med unikke fænotyper. Hydrogels er designet til at indeholde 10 nm maskestørrelse, hvor hver crosslink indeholder o-nitrobenzyl grupper15. Materialet indkapsler eller fælder celler til observation, samtidig med at diffusion af næringsstoffer og affaldsprodukter til og fra celler til kultur. Ved at udsætte materialet for en mønstret 365 nm UV-lyskilde gennem et opretstående mikroskop kan hydrogelen nedbrydes gennem fotocleavage af o-nitrobenzylgrupper16,17. Nedbrydning udløser selektiv frigivelse af celler til nyttiggørelse til downstream-analyse, herunder genomisk og potentielt proteomisk og transskriptom analyse. Den eksperimentelle opsætning og protokol er relativt enkel, billig og translationel til mikrobiologiske laboratorier. Det kræver kun celleindkapsling gennem hydrogel dannelse, observation af tilfangetagne celler med en opretstående brightfield og fluorescens mikroskop, og belysning af celler af interesse med en mønstret UV-lyskilde til hentning.
En vigtig fordel ved denne materialebaserede tilgang til screening er dens tilpasningsevne til forskellige screeningsformater. I sit mest grundlæggende format kan materialet bruges til screening ved at indkapsle en heterogen cellesamling i bulk hydrogels. Celler observeres derefter for den ønskede fænotype, og individuelle celler af interesse fjernes til genomisk karakterisering. I mere udførlige formater kan materialet også integreres i lab-on-a-chip-enheder for at give præcis celleudløsning og hentning fra ønskede områder af enheden. Begge formater er beskrevet her, og begge har aktiveret de seneste nye mikrobielle screening og udvælgelse applikationer17,18,19. Metoden er demonstreret her med model Gram-negative organismer (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) og en model Gram-positiv organisme (Bacillus subtilis) og er let blevet udvidet til en række andre bakterier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>175617-25G</td>
			<td>&#62; 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox detergent powder</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>1104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Certified ACS Granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave SK300C</td>
			<td>Yamato Scientific</td>
			<td>18016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 1A1135</td>
			<td>Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td>1A1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield upright microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C614-500</td>
			<td>For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>0188-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: -30-60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: &#60; 32 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli ATCC 25922</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R19020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium microscope slides plain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td>Contains inhibitor, 30 wt% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incu-Shaker Mini</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>E5-0014-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 7-hydrate</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Avantor Performance Materials, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen, compressed</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)</td>
			<td>NOF America Corporation</td>
			<td>PTE-100SH</td>
			<td>Sunbright-PTE-100SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>K813-500ML</td>
			<td>Store between 15 &#176;C&#8211;30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon400</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>DSI-D-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>25 x 75 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>BioXtra, &#62; 98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505-250G</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#62; 99.0% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel thickness gage</td>
			<td>Precision Brand Products</td>
			<td>77739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-1L</td>
			<td>Anhydrous, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td>For microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FS-110H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation

Biologer har længe forsøgt at forstå forholdet mellem fænotype og genotype. For bedre at forstå denne forbindelse er det afgørende at udvikle praktiske teknologier, der parerer mikroskopisk cellescreening med celleisolation ved høj renhed til downstream genetisk analyse. Her beskrives brugen af fotodegradable poly(ethylenglycol) hydrogeler til screening og isolering af bakterier med unikke vækstfænotyper fra heterogene cellepopulationer. Metoden er afhængig af indkapsling eller indkapsling af celler med hydrogel, efterfulgt af kultur, mikroskopisk screening, derefter brug af et lysmønstreværktøj i høj opløsning til spatiotemporal kontrol af hydrogelforringelse og frigivelse af udvalgte celler til en løsning til hentning. Anvendelse af forskellige lysmønstre giver mulighed for kontrol over morfologien i den ekstraherede celle, og mønstre som ringe eller kors kan bruges til at hente celler med minimal direkte UV-lyseksponering for at afbøde DNA-skader på isolaterne. Desuden leverer lysmønstreværktøjet en justerbar lysdosis for at opnå forskellige nedbrydnings- og cellefrigivelseshastigheder. Det giver mulighed for nedbrydning ved høj opløsning, muliggør cellehentning med rumlig præcision i mikronskala. Her demonstreres brugen af dette materiale til at screene og hente bakterier fra både bulk hydrogels og mikrofabricated lab-on-a-chip-enheder. Metoden er billig, enkel og kan bruges til almindelige og nye anvendelser i mikrobiologi, herunder isolering af bakteriestammer med sjældne vækstprofiler fra mutantbiblioteker og isolering af bakterielle konsortier med emergente fænotyper til genomiske karakteriseringer.

For at undersøge UV-lyss evne til at udløse kontrolleret hydrogelforringelse for celleudslip blev hydrogeler først indkapslet over thiolerede coverlips uden bakterier til stede. Hver hydrogel blev udsat for tre replikerede cirkel mønstre af lys ved forskellige intensiteter og eksponering gange. Den procent gel nedbrydning blev beregnet efter UV-lys eksponering ved hver lysintensitet, og eksponeringstiden blev derefter kvantificeret ved kobling vedhæng thiol grupper med en fluorescein-5-maelimide farvestof til fluorescens imaging19,24. Et repræsentativt eksempel på, hvordan disse to parametre påvirker hydrogelforringelsen, er vist i figur 3. Som indlysende giver mønstret lys fra det mønstrede belysningsværktøj rumlig tidsmæssig kontrol af hydrogelforringelse ved en opløsning, der kun kan muliggøre frigivelse af et lille antal celler.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig03.jpg"> Figur 3: Kontrol over hydrogelforringelse. UV-lysdosis og deraf følgende hydrogelforringelseshastighed kan indstilles via det mønstrede belysningsværktøj. (Indsat) To forskellige lysintensiteter blev valgt til mønstret hydrogel nedbrydning. Efter 365 nm UV-lyseksponering blev hydrogeler mærket med fluorescein-5-maleimid til fluorescensbilleddannelse. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Til celleudtrækning blev der anvendt forskellige lysmønstre til at undersøge celleudslip (Figur 4). Her blev Agrobacteriumbakterier celler indkapslet i bulk hydrogels over thiolerede glas coverslips, derefter dyrkes i mikroskala kolonier. Hydrogels blev derefter inspiceret i brightfield mikroskopi, og målrettede mikrokolonier blev udsat for forskellige UV-lysmønstre. Det blev observeret, at forskellige eksponeringsmønstre påvirkede morfologien i de frigivne celler. Dette er potentielt gavnligt for forskellige applikationer. For eksempel, udsætter en ring mønster omkring målet koloni resulterer i frigivelsen af hele kolonien stadig indkapslet i en beskyttende PEG hydrogel og uden direkte UV-lys eksponering (Figur 4A), som kan bevare celler og give let downstream rensning. Ved at udsætte en del af eller hele kolonien for UV-lys kan celler derimod ekstraheres enten som aggregerede celleklynger (Figur 4B) eller som frie, individuelle celler (Figur 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig04.jpg"> Figur 4: Kontrol over morfologien af de ekstraherede celler. (A) Brug af et ringmønster til at frigøre hele cellekolonien, beskyttet i en PEG-matrix. (B) Brug af et brudt krydsmønster til cellefrigivelse i aggregater. (C) Brug af et krydsmønster til at frigøre enkelte celler. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Fattahi et al.19 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Kritisk i indkapslingsprotokollen er både cellesåningstætheden og tykkelsen af hydrogelen, da begge disse parametre kan påvirke antallet af celler, der er indarbejdet i hydrogel til observation. For at demonstrere blev A. tumefaciens celler prøver indkapslet i hydrogels af to forskellige tykkelser ved hjælp af tynde afstandsstykker (12,7 μm) eller tykke afstandsstykker (40 μm) kultiveret, og afbildet efter de etablerede protokoller. Tyndere hydrogeler resulterede i en mikrokolonitæthed på 90 kolonier/mm2 i hele hydrogelen, hvor der blev observeret minimalkolonioverlapning (Figur 5A). I modsætning hertil resulterede hydrogeltykkelser på over 12,7 μm i dannelsen af overlappende kolonier i lodret retning (figur 5B), hvilket kan resultere i udvinding af flere kolonier. Overlappende kolonier kan forårsage krydskontaminering under udvinding på grund af lysmønsterets todimensionelle karakter. For eksempel kan en topkoloni målrettes, mens en underliggende koloni også ekstraheres med den (Figur 5C). Derfor anbefales det at bruge 12,7 μm afstandspladser til hydrogelpræparat.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig05.jpg"> Figur 5: Hydrogeltykkelsen påvirker ekstraktionsrenhed. (A) Ved at udnytte afstandsstykke med en tykkelse på 12,7 μm til hydrogeldannelse dannes kolonier inden for et 10x brændplan. (B) Overlejring af kolonier kan observeres ved 10x forstørrelse, hvis der anvendes afstandsstykkere med større tykkelser end 12,7 μm. (C) Krydskontaminering kan forekomme med en overlejring af kolonier under celleudslip: (i) et ringmønster bruges til at frigive en målrettet cellekoloni, (ii) den målrettede cellekoloni bliver løsrevet fra hydrogelen, og (iii) en anden, underliggende koloni observeres under lyseksponeringen under den målrettede koloni. Denne koloni er også fjernet, hvilket resulterer i krydskontaminering. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
I betragtning af den potentielle skade på bakterier med UV-lys blev virkningen af varierede UV-lysmikropatterner på celle levedygtigheden yderligere undersøgt ved hjælp af model, Gram-positive bakterier (B. subtilis) og model, Gram-negative bakterier (E. coli). Hver blev indkapslet i bulk hydrogels og dyrkes i mikroskala kolonier i henhold til standard protokoller, kontrollere deres kompatibilitet med hydrogel. Målrettede mikrokolonier af tilsvarende størrelser (26 ± 1 μm diameter) blev derefter udsat for en konstant lysdosis (168 mJ/mm2), enten i form af cirkelmønstre, der udsætter hele mikrokolonier for UV-lys eller krydsmønstre, der kun nedbryder hydrogelkanter for at minimere lyseksponeringen for celler. Celler blev derefter genvundet og belagt til at kvantificere CFU / mL genvundet fra hver koloni. Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel i cellegendannelsesniveauet (figur 6A). For yderligere at undersøge renheden af de ekstraherede celler blev DNA udvundet fra E. coli-prøver og analyseret ved hjælp af et UV-Vis spektrofotometer. For begge mønstre falder DNA-kvalitetsniveauet inden for et A260/A280-interval mellem 1,8 og 2,0 (Figur 6B), som ligger i det ideelle interval til genomisk sekventering25. Dette viser, at de UV-mønstre, der anvendes til frigivelse under de beskrevne betingelser, har minimal effekt på mængden af levedygtige celler, der genvindes fra bulkhydrogelerne, eller på genomisk DNA-kvalitet efter udvinding.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig06.jpg"> Figur 6: Virkningen af forskellige lyseksponeringsmønstre på celle levedygtighed og DNA-kvalitet af bakterier frigivet fra bulk hydrogels. (A) Cellegendannelse niveauer for både E. coli og B. subtilis efter ekstraktion ved hjælp af krydsmønstre og cirkel mønstre. Til dette forsøg blev der foretaget ekstraktion fra sfæriske kolonier med samme diameter (26 μm ± 1 μm) for at sikre, at antallet af frigivne celler fra hver koloni var ækvivalent. De udvundne opløsninger blev derefter forgyldt til at beregne CFU / mL erhvervet fra hvert mønster. Statistisk analyse viste ingen signifikant forskel i CFU/mL fra tværs- og cirkelmønstre for både E. coli og B. subtilis (P-værdi > 0,05, n= 6 for begge stammer). (B) Spektrofotometrisk kvantificering af DNA-kvalitet for isolerede E. coli-celler ved hjælp af tværs- og cirkelmønstre. Her viste statistisk analyse ikke en signifikant forskel i DNA-kvalitet for de anvendte mønstre (P-værdi > 0,05, n = 6) (C) Brightfield billeder af kolonier med samme diametre udsat for tværs og cirkel mønstre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Microwell arrays giver en alternativ, lab-on-a-chip screening interface, der tilbyder mere kontrollerede screening funktioner i forhold til bulk hydrogels. For eksempel muliggør mikrowell arrays såning af bakterier i diskrete kultursteder, hvor antallet af celler i inoculum kan styres. Geometriske træk ved mikrowells såsom godt dybde og diameter styres også gennem standard mikrofabrikation metoder. Med disse fordele har mikrowells været nyttige til at studere bakterievækst under rumlig indespærring26, og senest til opdagelsen af symbiotiske og antagonistiske interaktioner mellem forskellige bakteriearter, når de er begrænset sammen påmikroskalaen 18. Cellulær ekstraktion fra brønde til genomisk analyse såsom 16S amplicon sekventering er afgørende for disse applikationer. Ved hjælp af det samme hydrogelmateriale kan UV-lys eksponeres over en brønd indeholdende celler af interesse, enten som cirkel- eller ringmønstre. Sidstnævnte sikrer kun hydrogelforringelse ved mikrorumskanten for at forhindre direkte bestråling af celler. For at demonstrere dette blev A. tumefaciens celler, der udtrykte mCherry, sået i brønde, hydrogelen blev derefter fastgjort til mikrowellsystemet. Celler blev kultiveret og derefter bestrålet med enten cirkel eller ring mønstre. Membranen blev derefter plettet med fluorescein-5-maleimid farvestof. Tofarvede fluorescensbilleder afslørede, at både membranen og cellerne i brøndene fjernes for begge bestrålingsmønstre17. I modsætning til bulk hydrogel format, celle ekstraktion her er kun blevet observeret i form af celle klynger18.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig07.jpg"> Figur 7: Repræsentative konfokale mikroskopibilleder, der viser lysmønsterpåvirkning på celleisolation fra mikrorumspaneler. (A) Mikronæbler med en diameter på 40 μm indeholdende bakterier (rød) efter såning og kultur. (B) Lyseksponering ved hjælp af cirkel- og ringmønstre (blå). (C) Nedsat rød fluorescens viser at cellerne udvindes af bestrålede brønde. (D) Tofarvet fluorescensbillede af membraner og bakterier efter bestråling, hvilket indikerer fjernelse af både hydrogel (grøn) og bakterier (rød) fra målbjerne. (E) Z-stack, to-farve fluorescens billede af mål brønde. Den røde linje i (D) angiver det xz-plan, der er afbildet i (E), og den grønne linje i (E) angiver det xy-plan, der er afbildet i (D). Prøver i billeder (C-E) blev vasket til fjernelse af frigivne celler, derefter fast og afbildet. Skalalinje = 40 μm. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra van der Vlies et al.17. Copyright 2019 American Chemical Soceity. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For at kvantificere bakterier celle levedygtighed og DNA-kvalitet efter ekstraktion i dette format, B. subtilis og E. coli celler blev seedet, kultiveret, og derefter frigivet fra microwell arrays ved hjælp af cirkel og ring mønstre (Figur 8A, B). Frigivne celler blev derefter belagt på ATGN agarplader, og DNA-kvaliteten af de ekstraherede celler blev kvantificeret. For at sikre, at der var et ensartet antal celler til stede under hver ekstraktion, blev mikrowells med lignende fluorescerende intensiteter (~ 6000 a.U.) og derfor et lignende antal celler målrettet til frigivelse. Antallet af levedygtige celler, der blev udvundet ved hjælp af et cirkelmønster, var ikke signifikant forskelligt fra antallet af levedygtige celler, der blev udvundet ved hjælp af ringmønster for enten bakterier (Figur 8C). Dna-kvalitetsniveauerne var heller ikke signifikant forskellige mellem cirklen og ringmønstrene for begge bakterier (Figur 8D). Svarende til fund i bulk hydrogels, anvendelsen af UV-lys på intensiteten og varigheden angivet her havde en ubetydelig indvirkning på levedygtigheden og DNA-kvaliteten af celler udvundet fra microwell arrays. Disse resultater viser, at levedygtige bakterieceller selektivt kan hentes fra mikrowells med minimal skade til downstream-analyse.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig08.jpg"> Figur 8: Virkningen af forskellige lyseksponeringsmønstre på celle levedygtighed og DNA-kvalitet af bakterier frigivet fra microwell arrays. (A,B) For både E. coli og B. subtilisblev cirkelmønstre og ringmønstre anvendt til celleudvinding fra 10 μm mikrowells. Cirkelmønster med en diameter på 10 μm og ringmønster med en indvendig diameter på 10 μm og ydre diameter på 20 μm blev anvendt i dette forsøg til celleudvinding. Mikrowells med de samme diametre blev brugt til at sikre, at antallet af frigivne celler fra hver mikrorum var det samme. (C) De udvundne opløsninger blev derefter forgyldt til beregning af den CFU/mL, der var erhvervet ud fra hvert eksponeringsmønster. Statistisk analyse viste ingen signifikant forskel i CFU/mL fra cirkel- og ringmønster for både E. coli og B. subtilis (P-værdi > 0,05, n = 6 for begge stammer). (D) Spektrofotometri blev anvendt til at måle DNA-kvaliteten af både E. coli og B. subtilis celler ved hjælp af cirkel- og ringmønstre. Her viste statistisk analyse ingen signifikant forskel i DNA-kvaliteten for de anvendte mønstre (P-værdi > 0,05, n = 6 for begge stammer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende figur 1: Design og fabrikation af mikrowell arrays. (A) Standard mikrofabrikationsteknikker blev anvendt til fremstilling af mikrowell arrays på silicium wafers. (B) Hvert substrat bestod af 7 x 7 arrays med en diameter på 10μm med en dybde på 20 μm og 30 μm pitch. (C) Hvert array bestod af 225 mikrowells. Dette tal er blevet ændret fra Barua et al.18. Copyright 2021 Frontiers Media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Brugen af fotodegradable hydrogels til at isolere bakterieceller ved at udnytte et lyspatteringsværktøj i høj opløsning rapporteres. Væsentlige eksperimentelle procedurer, resultater og fordele ved processen gennemgås. Metoden muliggør hurtig og billig isolering af målrettede bakterier, der viser sjældne eller unikke funktioner fra heterogene samfund eller befolkninger.

Fotodegradable Hydrogel-grænseflader til bakteriescreening, udvælgelse og isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Denne protokol er designet til hurtigt at isolere celler fra screening grænseflader til genomisk karakterisering og denne evne er betydelig, fordi det kan kombinere makroskopisk observerbare celle funktioner med genomisk information. De målrettede bakterieceller fra screeningsgrænsefladerne kan isoleres med høj rumlig position på en operationelt enkel måde ved hjælp af denne teknik. Hydrogelerne kan implementeres i andre screeningsgrænseflader.Hydrogelmaterialet kan let indarbejdes i mikrofluidiske kanaler til on-demand hentning af celler fra mikrofluidiske enheder. Begynd med at pode krydsbindingsbufferen med den ønskede celletæthed. Hydrogelprækursoropløsningen forberedes i et 0,5 milliliter mikrocentrifugerør ved at tilsætte 12,5 mikroliter af krydsbindingsbufferen og 5,6 mikroliter peg ONB-diakrylatopløsning.Og endelig tilsættes 6,9 mikroliter af underarm PEG thiolopløsning til blandingen. For celleindkapsling i hydrogel prækursor opløsning, placere thiolated base coverslips på en ren Petri parabol og placere to afstandsstykke på de to modsatte sider af coverlip. Fix afstandsstykket på bunddækslerne ved at tape afstandsstykket til Petriskålen.Efter at have tilføjet den ønskede volumen af forløberopløsningen på en ikke-reaktiv perfluoralkyleret glasrutschebane, skal du placere diaset på bunddækslen og lade hydrogeldannelsen fuldføre ved stuetemperatur i 25 minutter. Når geleringen er færdig, skal du forsigtigt fjerne den perfluoralkylerede glasrutschebane. Placer substratet i 60 med 15 millimeter Petriskål indeholdende ATGN medier suppleret med antibiotika.Frø 700 mikroliter af bakteriecelleophæng med OD 600 af 0,1 over mikrowell array substratet og gør hydrogel prækursor løsning som påvist tidligere ved hjælp af 12,5 mikroliter af fosfat buffered saltvand ATGN af pH otte. Pipette 12,5 mikroliter af prækursoropløsningen på en ikke-reaktiv perfluoralkyleret glasrutschebane og placere to 38 mikrometer stål spacers på to modsatte sider af mikrowell array substrat podet med celler. Vend derefter den perfluoralkylerede glasrutschebane med forløberopløsningsdråben og læg en dråbe midt i mikrowellsubstratet.Når hydrogelen dannes efter en inkubation på 25 minutter ved stuetemperatur, skal du forsigtigt fjerne glasglittet fra mikrorumssubstratet og placere substratet i en petriskål, der indeholder ATGN-medier suppleret med antibiotikum. Placer prøven i en PDMS-holder, og tilføj det definerede medie oven på prøven for at forhindre prøvedehydrering og levere en bæreløsning til frigivne celler. Når kalibreringsspejlet er på plads, skal du justere mikroskopfokus for at få et skarpt billede af kolonierne i hydrogel- eller mikrowellsystemet og inspicere for at identificere kolonier eller brønde af interesse.Her skal du designe lysmønstrene, mens kameravisningen viser kolonierne inde i prøven for at teste forskellige mønstre til celleudtrækning og gemme det definerede mønster. Vælg derefter afsnittet sessionskontrol, tilføj den gemte sekvens under fanen med titlen med det mønstrede belysningsværktøjsproduktnavn. Vælg indstillingen for at stimulere mønsteret for at få vist og justere den ønskede eksponeringsplacering.Derefter justeres lysintensiteten til 60% og eksponeringstiden til 40 sekunder under LED-kontrolfanen og starter eksponeringsprocessen. Overvåg hydrogelforringelsen i realtid og Brightfield-tilstand for at sikre celleudslip. Hvis du vil indsamle den frigivne celle, skal du ændre mikroskopfilteret fra Brightfield til TRITC for at visualisere det eksponerede område af prøven med det blotte øje.Når det udsatte område er placeret, skal du placere enden af slangen på det bestrålede sted og derefter ændre mikroskopfilteret tilbage til Brightfield for at overvåge cellehentning i realtid. Brug sprøjten, der er fastgjort til den anden ende af slangen, til forsigtigt at trække 200 mikroliter opløsning, der indeholder de frigivne celler, tilbage, og overfør opløsningen til et 1,5 millimeter centrifugerør til DNA-analyse eller plating. Forskellige UV-lys mikro mønstre blev brugt til celleudtrækning fra bulk hydrogels, som påvirkede morfologi af de frigivne celler.UV-eksponeringen i et ringmønster resulterede i frigivelsen af hele kolonien indkapslet i en beskyttende PEG hydrogel. I modsætning hertil, ved at udsætte en del af eller hele kolonien til UV-lys, celler kunne udvindes enten som aggregerede celle klynger eller som frie individuelle celler. Celle såning tæthed og tykkelse af hydrogel er vigtige for celle indkapsling.De tyndere hydrogeler resulterede i mikrokolonier med minimal koloni overlapning, mens hydrogels med øget tykkelse resulterede i overlappende kolonier, hvilket kan resultere i udvinding af flere kolonier. Overlappende kolonier kan forårsage krydskontaminering under udvinding på grund af lysmønsterets todimensionelle karakter. Når en topkoloni blev målrettet, den underliggende koloni blev også udvundet med det.Virkningen af varierede UV-lysmikromønstre på celleens levedygtighed blev også vurderet. Når mikrokolonier blev udsat for kontrollerede doser AF UV-lys i enten et cirkulært eller krydsmønster, blev cellegendannelse og DNA-renhed ikke påvirket. Cellerne blev med succes hentet fra mikrowell arrays ved hjælp af denne tilgang, hvilket fremgik af de repræsentative konfokale mikroskopibilleder, hvor cellerne ved bestråling i cirkulære og ringmønster blev fjernet i det respektive mønster.Efter udvinding fra mikrowell arrays blev celle levedygtigheden og DNA-mængden vurderet. Eksponeringsmønstrene påvirkede hverken det levedygtige celletal eller DNA-kvaliteten, hvilket indikerer, at levedygtige bakterieceller selektivt kunne hentes fra mikrowells med minimal skade, og deres DNA kunne isoleres ved høj renhed til downstream genomisk analyse. Kontroller altid, at hydrogelen er dannet, før du fjerner den perfluoralkylerede coverlip.Præcision og pleje er nødvendig for at placere afstandsrum til hydrogelaflejring og bruge slangerne til udvinding af celler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Fremstilling af Hydroxy-PAAM hvdroqeler for afkobling virkningerne af Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel stillads til Artikulære chondrocyt Kultur og brusk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Konstruktion af Modular Hydrogel Leverandørbrugsanvisning på mikromønstrede Macro-skaleret 3D Cellular Arkitektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradient stamme Chip nemlig stimulere cellulære opførsel i celle-belæsset Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mønster bioaktive proteiner eller peptider på Hydrogel ved hjælp af fotokemi for biologiske applikationer

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Opdigte en nyre Cortex ekstracellulære Matrix-afledte Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Applikationer til Open Source-Mikroplade kompatible belysnings paneler

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Forberedelse og karakterisering af grafenbaseret 3D biohybrid hydrogel bioink til perifer neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Hydrogelarrays muliggør øget gennemstrømning til screeningseffekter af matrixkomponenter og terapi i 3D-tumormodeller

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

Isolering af næste generations genterapivektorer gennem teknik, stregkodning og screening af adeno-associeret virus (AAV) capsidvarianter

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...