Name: photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door NSF CAREER Award #1944791.

<ol>
	<li>Welch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+single+cell+isolation+for+genomics+using+microraft+arrays.">Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).</li><li>Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. K., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+high-throughput+screening+of+small+mutant+libraries.">A microfluidic platform for high-throughput screening of small mutant libraries.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5234-5242 (2016).</li><li>Ishii, S., Tago, K., Senoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+and+isolation+for+microbiology+and+biotechnology:+Methods+and+applications.">Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1281-1292 (2010).</li><li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ichip+for+high-throughput+in+situ+cultivation+of+“uncultivable+microbial+species”.">Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of “uncultivable microbial species”.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Zhao, X., Zhong, J., Wei, C., Lin, C. W., Ding, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+viable+but+nonculturable+state+in+foodborne+pathogens.">Current perspectives on viable but nonculturable state in foodborne pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 580 (2017).</li><li>Wang, X., Gou, X., Chen, S., Yan, X., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+manipulation+tool+with+combined+microwell+array+and+optical+tweezers+for+cell+isolation+and+deposition.">Cell manipulation tool with combined microwell array and optical tweezers for cell isolation and deposition.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 23 (7), 075006 (2013).</li><li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Poonlapdecha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-conjugated+ferromagnetic+nanoparticles+with+lateral+flow+test+strip+assay+for+rapid+detection+of+Campylobacter+jejuni+in+poultry+samples.">Antibody-conjugated ferromagnetic nanoparticles with lateral flow test strip assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in poultry samples.</a> International Journal of Food Microbiology. 286, 6-14 (2018).</li><li>Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomagnetic+separation:+An+effective+pretreatment+technology+for+isolation+and+enrichment+in+food+microorganisms+detection.">Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).</li><li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+Single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+flow+cytometry:+The+role+of+microfabrication+methodologies,+performance+and+functional+specification.">Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification.</a> Technology. 06 (01), 1-23 (2018).</li><li>Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+and+microbial+engineering.">Microfluidics and microbial engineering.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 432-446 (2016).</li><li>Kehe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+screening+of+synthetic+microbial+communities.">Massively parallel screening of synthetic microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12804-12809 (2019).</li><li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+degradation+of+chain+and+step-polymerized+photodegradable+hydrogels.">Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels.</a> Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties.">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li><li>Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+demand+release+and+retrieval+of+bacteria+from+microwell+arrays+using+photodegradable+hydrogel+membranes.">On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).</li><li>Barua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+discovery+of+positive+and+negative+interactions+among+root+microbiome+bacteria+using+microwell+recovery+arrays.">Simultaneous discovery of positive and negative interactions among root microbiome bacteria using microwell recovery arrays.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 3361 (2021).</li><li>Fattahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+rapid+screening,+isolation,+and+genetic+characterization+of+bacteria+with+rare+phenotypes.">Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes.</a> Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+copatterning+strategies+using+azlactone-based+block+copolymers.">Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabricating+reactive+surfaces+with+brush-like+and+crosslinked+films+of+azlactone-functionalized+block+co-polymers.">Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562 (2018).</li><li>Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+tracking+of+microbial+community+development+within+a+microwell+array+platform.">Assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55701 (2017).</li><li>. DNeasy Blood &amp; Tissue Handbook - QIAGEN Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en</a> (2021)</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+Maleimide-Thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+modified+salt-out+method+for+DNA+extraction+from+whole+blood+lymphocytes:+A+simple+and+economical+method+for+gene+polymorphism.">Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism.</a> Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28 (2018).</li><li>Hansen, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+of+bacteria+in+microwell+arrays+reveals+the+importance+of+confinement+in+community+development.">Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development.</a> PLoS One. 11 (5), 0155080 (2016).</li><li>Halsted, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transparent+microwell+arrays+for+optical+monitoring+and+dissection+of+microbial+communities.">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).</li><li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Hydrogel+Interactions+in+Tissue+Engineering:+Mechanisms+and+Applications.">Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160 (2013).</li><li>Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+interactions+between+bacteria+and+hydrogels.">Mechanical interactions between bacteria and hydrogels.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10893 (2018).</li></ol>

RRH en AJV hebben patent aangevraagd op deze technologie. De overige auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dit manuscript demonstreert het gebruik van fotodegradeerbare hydrogels voor het screenen en isoleren van bacteriën. Het materiaal en de aanpak maken een cultuur met hoge doorvoer, controle over groeimedia en groeiomstandigheden en schone en nauwkeurige celextractie op een eenvoudige en kosteneffectieve manier mogelijk. Extractie vereist alleen een fluorescerende microscoop in combinatie met het patroonverlichtingsgereedschap en kan op een sequentiële manier worden gedaan om meerdere celdoelen te isoleren. Elke extractie duurt 5-10 minuten om uit te voeren en tot 30 gerichte kolonies zijn verwijderd uit een enkele hydrogel. Een belangrijk voordeel van de aanpak is het aanpassingsvermogen aan een verscheidenheid aan verschillende testformaten, zoals hier wordt aangetoond met screening van zowel bulkhydrogels als microwell-arrays. Het scheidingsproces in beide formaten is met succes gebruikt om bacteriën te isoleren die uniek groeigedrag vertonen voor downstream genotypering na kweek en microscopische observatie, een kritisch vermogen voor het verbinden van celgenotype met fenotype. Tot op heden hebben genomische karakteriseringen van bacteriën geëxtraheerd uit deze interfaces 16S amplicon sequencing opgenomen om multi-species collecties van bacteriën uit omgevingsmicrobiomen te identificeren die emergent groeigedrag genereren18, en voor whole-genome sequencing om met succes genetische mutaties te identificeren die zeldzame groeiprofielen veroorzaken in cellen die aanwezig zijn in mutantenbibliotheken19.
Het gebruik van bulkhydrogels voor celscreening en isolatie is het meest eenvoudige en eenvoudige formaat. Bulk fotoafbreekbare hydrogels vormen zich snel (25 min) na het mengen van de voorlopers over transparante glazen coverslips om cellen in te kapselen in een 3D-celkweekmatrix die wordt afgebeeld met een standaard rechtopstaande of omgekeerde fluorescentiemicroscoop. De methode heeft dus het potentieel om translationeel te zijn naar gemeenschappelijke microbiologische laboratoria die geen microfabricagebronnen of expertise hebben. Een nadeel van dit formaat is dat cellen willekeurig georiënteerd zijn over de driedimensionale hydrogel. Daarom kunnen cellen uit het brandpuntsvlak verschijnen bij beeldvorming met hogere vergrotingsdoelstellingen en extractie kan moeilijk zijn als celkolonies te dicht bij elkaar zijn georiënteerd of als er een verticale overlay van kolonies is. Het afzetten van een dunne hydrogel (<13 μm) zoals beschreven is van cruciaal belang om dit nadeel te verminderen. Blootstelling aan gebroken kruislichtpatronen (figuur 4B) heeft hier de voorkeur, omdat dit patroon resulteert in cellen vrij van de hydrogel die minimale blootstelling aan UV-licht hebben en gemakkelijk kunnen worden teruggewonnen door plating.
Daarentegen biedt het microwell array-formaat een beter gecontroleerde interface, omdat bacteriecellen worden verdeeld in discrete microwells die dienen als kleine cultuur of co-culturen sites17,18,26. Microwell dimensie, toonhoogte en dichtheid zijn nauwkeurig vervaardigd met behulp van standaard fotolithografische technieken. In vergelijking met bulkhydrogels kunnen bacteriën worden geëxtraheerd uit microwell-arrays met een hogere mate van specificiteit en een lagere kans op kruisbesmetting, omdat de cellen alleen aanwezig zijn op vooraf gedefinieerde locaties, niet willekeurig verspreid over de hydrogel. De concentratie en verhoudingen van bacteriecellen in de zaaioplossing kunnen ook worden gevarieerd om de hoeveelheid en samenstelling van het microwell-entmateriaal te regelen door middel van een zaaiproces dat is gekarakteriseerd in eerdere rapporten26, waardoor de gebruiker flexibiliteit krijgt in het experimentele ontwerp van het scherm. Het belangrijkste nadeel van screening met het microwell array-formaat is de extra tijd en expertise die nodig is voor microfabricage. De fabricage van microwells kostte naar schatting ~ $ 10 per array, inclusief materiaalkosten en cleanroomkosten. Bovendien worden microwells-arrays traditioneel gemaakt van silicium, wat beeldvormingsproblemen kan veroorzaken omdat de substraten niet transparant zijn. Bovendien kan een grote hoeveelheid lichtverstrooiing van het siliciumoppervlak de beeldvorming binnen de microwells beperken en de patroonresolutie tijdens blootstelling aan hydrogel verminderen met UV-licht van het patroonverlichtingsgereedschap (te zien in figuur 8A,B). Soortgelijke microwells zijn vervaardigd op transparante kwartssubstraten om dit soort beperkingen aan te pakken27; deze fabricage is echter aanzienlijk moeilijker. Blootstelling aan ringpatronen die de omtrek van de put verlichten, heeft hier de voorkeur om vrije cellen uit de putten vrij te maken en tegelijkertijd uv-blootstelling te minimaliseren.
Het meest voorkomende probleem dat in beide formaten optreedt, is het losmaken van de hydrogel van het onderliggende substraat tijdens het kweken als gevolg van hydrogelzwelling. Als dit een probleem is voor bulkhydrogels, moeten de aanwezigheid, dichtheid en uniformiteit van thiolgroepen in de chemische (MTPS) bevestigingslaag over het oppervlak van de basisglasafdekkingslip worden geverifieerd met behulp van een geschikte oppervlaktekarakteriseringstechniek (XPS, ATR-FTIR, AFM, enz.). Lage dichtheden van oppervlaktetholgroepen als gevolg van inefficiënte oppervlaktefunctionalisatie kunnen leiden tot een zwakke interactie tussen het substraat en de hydrogel. Als een laag niveau van oppervlaktetholatie optreedt, moet de stabiliteit van de MTPS-oplossing worden gecontroleerd. Bij de eerste reiniging van de glasplaat moet ervoor worden gezorgd dat er voorafgaand aan de MTPS-behandeling een schoon oppervlak ontstaat, en er moet voor worden gezorgd dat watervrij tolueen wordt gebruikt tijdens de MTPS-oppervlaktereactie (protocolsectie 4). In het geval van microwell-arrays worden oppervlakken niet ge thioleerd en hechten hydrogels zich in plaats daarvan door de gedeeltelijke vulling van de putten met de hydrogel, die de hydrogel verankert aan het siliciumsubstraat17. Als hydrogelloslating een probleem is in dit systeem, kunnen meer microwells of andere microschaalfuncties in de array worden geëtst om de hydrogel verder aan het substraat te verankeren om een sterkere hechting te bevorderen.
Een beperking van de techniek in beide formaten is de beperkte stabiliteit van de hydrogels in aanwezigheid van bacteriën. Er is opgemerkt dat sommige bacteriën, zoals A. tumefaciens, de hydrogel in de loop van 5-7 dagen17,19kunnen afbreken, wat de experimenteertijd beperkt. Het huidige onderzoek naar de mechanismen van bacteriële afbraak is aan de gang; er wordt verondersteld dat de estergroepen die aanwezig zijn uit de diacrylaatmonomeren onderhevig zijn aan door bacteriën gemedieerde hydrolyse en/of enzymatische afbraak, zoals opgemerkt in andere systemen17. Het ontwikkelen van stabielere hydrogelchemie zal de tijd verlengen dat bacteriën in de hydrogel kunnen blijven en zal het scherm uitbreiden naar micro-organismen met langzamere groeisnelheden. Een tweede beperking is dat in beide formaten celterugwinning en -extractie plaatsvinden in een open omgeving, wat resulteert in relatief hoge extractievolumes (30-100 μL), die gevoelig kunnen zijn voor verontreiniging van buitenaf. Er moet dus voor worden gezorgd dat er voldoende cellen aanwezig zijn uit de doelkolonies, terwijl het volume van de extractieoplossing wordt geminimaliseerd. Om voldoende cellen te verkrijgen voor plating en herstel of voor extractie van DNA-materiaal, werd waargenomen dat in bulkhydrogels cellen lang genoeg moeten worden gekweekt om koloniediameters van ten minste 10 μm te bereiken. Om het vereiste volume voor celextractie te verlagen, werd waargenomen dat het gebruik van een microliterspuit en -slang (figuur 2) efficiënter was dan pipetteren. Met de buizen konden de isolaten nauwkeuriger van het afgiftepunt worden getrokken, waardoor minder oplossingsvolume nodig was en de kans op verontreiniging werd verlaagd.
Toekomstig werk omvat het begrijpen van het effect van hydrogel mechanische eigenschappen op celgroei, aangezien mechanische kenmerken van deze hydrogels goed worden gecontroleerd door de selectie van geschikte PEG-gebaseerde monomeerprecursoren van verschillende molecuulgewichten28, en mechanische interacties spelen waarschijnlijk een belangrijke rol in het gedrag van bacteriën29. Omdat de hydrogelmaterialen gemakkelijk kunnen worden opgenomen in een verscheidenheid aan verschillende systemen en apparaten, is de verdere ontwikkeling ook gericht op de integratie van dit materiaal in microfluïdische systemen. Dit zou de extractieoplossing reduceren tot femtoliter tot picoliter volumes, vergeleken met traditionele 30-100 μL volumes die momenteel nodig zijn in het open collectieformaat. Kleinere oplossingsvolumes zouden de potentiële besmetting aanzienlijk verminderen en de benadering van eencellige isolatie en karakterisering verplaatsen.

Isolatie van cellen met uniek gedrag uit een complexe en heterogene omgeving is fundamenteel voor het verkrijgen van genetische informatie in de biologie1. In de microbiologie wordt de selectie en isolatie van zeldzame of unieke microben na observatie belangrijk in veel toepassingen die een verband vereisen tussen genomische informatie en waarneembare fenotypische informatie. Deze toepassingen omvatten het selecteren van fenotypisch zeldzame stammen uit mutantenbibliotheken2,het selecteren van keystone-micro-organismen uit complexe microbiële gemeenschappen3,4en het selecteren van fenotypisch zeldzame maar belangrijke bacteriën uit isogene populaties. Isolatie van levensvatbare maar niet-cultureerbare cellen (VBNC) van een bacteriepopulatie is een belangrijk voorbeeld van de laatste, waarbij cellen met het VBNC-fenotype vaak verborgen zijn in bacteriepopulaties bij 1:102 tot 1:105 verhoudingen5,6. Vanwege de wijdverspreide problemen bij het isoleren van bacteriën, blijft veel onbekend over veel fenotypisch zeldzame micro-organismen. Deze beperkingen benadrukken de noodzaak van celisolatietechnieken om eerst de doelcel of cellen uit een mengsel te identificeren en ze vervolgens op te halen en te isoleren voor downstream moleculaire analyse7.
Enkele van de meest voorkomende methoden voor celisolatie zijn flowcytometrie en fluorescerende geactiveerde celsortering(FACS) 8,immunomagnetische scheiding9,10en microfluïdica11. Hoewel deze isolatiemethoden een hoge waarde hebben, hebben ze ook nadelen die het gebruik ervan beperken. FACS kan bijvoorbeeld routinematige microbiële isolatie op het niveau van één cel bieden voor follow-up genomische analyse3, maar wordt vaak beperkt door de beschikbaarheid en kosten, evenals stroomafwaartse besmettingsproblemen11. Microfluïdische benaderingen zoals microfluïdische flowcytometrie hebben veel aandacht gekregen, wat, in vergelijking met conventionele flowcytometrie, een aanzienlijke vermindering van het vereiste monstervolume mogelijk maakt12. Het scheiden en ophalen van een individuele of kleine verzameling cellen van microfluïdische apparaten is echter vaak een uitdagend probleem dat meestal een complexere installatie en apparaatontwerp vereist13. Veel microfluïdische benaderingen karakteriseren cellen genetisch voordat ze worden ingevoerd en waargenomen in een apparaat14, waardoor het aantal unieke soorten dat wordt waargenomen bij het uitvoeren van een functioneel scherm wordt beperkt. Gezien deze beperkingen is verdere innovatie van zowel methoden als materialen die praktisch zijn voor celscreening en isolatie vereist voor wijdverbreid gebruik in veel laboratoria.
Dit artikel presenteert een nieuwe, op materialen gebaseerde benadering voor het screenen en isoleren van bacteriën. De methode maakt gebruik van fotodegradeerbare hydrogels voor celinkapseling, kweek, microscopische observatie en on-demand afgifte en herstel van gerichte bacteriën met unieke fenotypen. Hydrogels zijn ontworpen om een maaswijdte van 10 nm te bevatten, waarbij elke crosslink o-nitrobenzylgroepen15bevat. Het materiaal kapselt cellen in of vangt ze op voor observatie en maakt de diffusie van voedingsstoffen en afvalproducten van en naar cellen voor kweek mogelijk. Door het materiaal bloot te stellen aan een 365 nm UV-lichtbron met een patroon door een rechtopstaande microscoop, kan de hydrogel lokaal worden afgebroken door fotocleavage van o-nitrobenzylgroepen16,17. Afbraak leidt tot de selectieve afgifte van cellen voor herstel voor downstream-analyse, inclusief genomische en mogelijk proteomische en transcriptomische analyse. De experimentele opzet en het protocol zijn relatief eenvoudig, goedkoop en translationeel naar microbiologische laboratoria. Het vereist alleen celinkapseling door hydrogelvorming, observatie van gevangen cellen met een rechtopstaande brightfield- en fluorescentiemicroscoop en de verlichting van interessante cellen met een uv-lichtbron met patroon om op te halen.
Een belangrijk voordeel van deze op materialen gebaseerde benadering van screening is het aanpassingsvermogen aan verschillende screeningformaten. In het meest basale formaat kan het materiaal worden gebruikt voor screening door een heterogene celverzameling in bulkhydrogels in te kapselen. Cellen worden vervolgens geobserveerd voor het gewenste fenotype en individuele cellen van belang worden verwijderd voor genomische karakterisering. In meer uitgebreide formaten kan het materiaal ook worden geïntegreerd in lab-on-a-chip-apparaten om nauwkeurige celafgifte en -herstel uit de gewenste delen van het apparaat te bieden. Beide formaten worden hier beschreven en beide hebben recente nieuwe microbiële screening- en selectietoepassingen mogelijk gemaakt17,18,19. De methode wordt hier gedemonstreerd met model Gram-negatieve organismen (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) en een model Gram-positief organisme (Bacillus subtilis) en is gemakkelijk uitgebreid naar een verscheidenheid aan andere bacteriën.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>175617-25G</td>
			<td>&#62; 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox detergent powder</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>1104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Certified ACS Granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave SK300C</td>
			<td>Yamato Scientific</td>
			<td>18016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 1A1135</td>
			<td>Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td>1A1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield upright microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C614-500</td>
			<td>For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>0188-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: -30-60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: &#60; 32 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli ATCC 25922</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R19020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium microscope slides plain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td>Contains inhibitor, 30 wt% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incu-Shaker Mini</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>E5-0014-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 7-hydrate</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Avantor Performance Materials, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen, compressed</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)</td>
			<td>NOF America Corporation</td>
			<td>PTE-100SH</td>
			<td>Sunbright-PTE-100SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>K813-500ML</td>
			<td>Store between 15 &#176;C&#8211;30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon400</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>DSI-D-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>25 x 75 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>BioXtra, &#62; 98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505-250G</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#62; 99.0% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel thickness gage</td>
			<td>Precision Brand Products</td>
			<td>77739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-1L</td>
			<td>Anhydrous, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td>For microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FS-110H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation

Biologen hebben lang geprobeerd de relatie tussen fenotype en genotype te begrijpen. Om dit verband beter te begrijpen, is het cruciaal om praktische technologieën te ontwikkelen die microscopische celscreening koppelen aan celisolatie met een hoge zuiverheid voor downstream genetische analyse. Hier wordt het gebruik van fotoafbreekbare poly(ethyleenglycol)hydrogels voor screening en isolatie van bacteriën met unieke groeifenotypen uit heterogene celpopulaties beschreven. De methode is gebaseerd op het inkapselen of insluiten van cellen met de hydrogel, gevolgd door cultuur, microscopische screening en vervolgens het gebruik van een hoge resolutie lichtpatroontool voor spatiotemporale controle van hydrogelafbraak en afgifte van geselecteerde cellen in een oplossing voor ophalen. Het toepassen van verschillende lichtpatronen zorgt voor controle over de morfologie van de geëxtraheerde cel, en patronen zoals ringen of kruisen kunnen worden gebruikt om cellen met minimale directe blootstelling aan UV-licht op te halen om DNA-schade aan de isolaten te beperken. Bovendien levert de lichtpatroontool een instelbare lichtdosis om verschillende degradatie- en celafgiftesnelheden te bereiken. Het maakt degradatie bij hoge resolutie mogelijk, waardoor celopvraging met ruimtelijke precisie op micronschaal mogelijk is. Hier wordt het gebruik van dit materiaal om bacteriën te screenen en op te halen uit zowel bulkhydrogels als microgefabriceerde lab-on-a-chip-apparaten gedemonstreerd. De methode is goedkoop, eenvoudig en kan worden gebruikt voor veel voorkomende en opkomende toepassingen in de microbiologie, waaronder isolatie van bacteriestammen met zeldzame groeiprofielen uit mutantenbibliotheken en isolatie van bacteriële consortia met emergente fenotypes voor genomische karakteriseringen.

Om het vermogen van UV-licht te onderzoeken om gecontroleerde hydrogeldegradatie voor celafgifte te veroorzaken, werden hydrogels eerst ingekapseld over thi geïsoleerde coverslips zonder dat er bacteriën aanwezig waren. Elke hydrogel werd blootgesteld aan drie replicerende cirkelpatronen van licht met verschillende intensiteiten en belichtingstijden. Het percentage geldegradatie werd berekend na blootstelling aan UV-licht bij elke lichtintensiteit en de blootstellingstijd werd vervolgens gekwantificeerd door hangertholgroepen te koppelen aan een fluoresceïne-5-maelimidekleurstof voor fluorescentiebeeldvorming19,24. Een representatief voorbeeld van hoe deze twee parameters de afbraak van hydrogel beïnvloeden, is te zien in figuur 3. Zoals duidelijk is, biedt patroonlicht dat wordt geleverd door de patroonverlichtingstool ruimtelijk-temporele controle van hydrogeldegradatie met een resolutie die de afgifte van slechts een klein aantal cellen mogelijk maakt.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig03.jpg"> Figuur 3: Controle op de afbraak van hydrogel. Uv-lichtdosis en resulterende hydrogelafbraaksnelheid zijn afstembaar via de patroonverlichtingstool. (Inzet) Er werden twee verschillende lichtintensiteiten gekozen voor hydrogeldegradatie met patroon. Na blootstelling aan 365 nm UV-licht werden hydrogels gelabeld met fluoresceïne-5-maleimide voor fluorescentiebeeldvorming. Overgenomen (aangepast) met toestemming van Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Voor celextractie werden verschillende lichtpatronen gebruikt om de celafgifte te onderzoeken(figuur 4). Hier werden Agrobacterium-bacteriecellen ingekapseld in bulkhydrogels over thi geïsoleerde glazen coverslips en vervolgens gekweekt in kolonies op microschaal. Hydrogels werden vervolgens geïnspecteerd in brightfield-microscopie en gerichte microkolonies werden blootgesteld aan gevarieerde UV-lichtpatronen. Er werd waargenomen dat verschillende blootstellingspatronen de morfologie van de vrijgekomen cellen beïnvloedden. Dit is potentieel gunstig voor verschillende toepassingen. Het blootleggen van een ringpatroon rond de doelkolonie resulteert bijvoorbeeld in het vrijkomen van de hele kolonie die nog steeds is ingekapseld in een beschermende PEG-hydrogel en zonder directe blootstelling aan UV-licht(Figuur 4A),die cellen kan behouden en een gemakkelijke stroomafwaartse zuivering kan bieden. Door daarentegen een deel of de hele kolonie bloot te stellen aan UV-licht, kunnen cellen worden geëxtraheerd als geaggregeerde celclusters (figuur 4B) of als vrije, individuele cellen (figuur 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig04.jpg"> Figuur 4: Controle over de morfologie van de geëxtraheerde cellen. (A) Gebruik van een ringpatroon om de hele celkolonie vrij te geven, beschermd in een PEG-matrix. (B) Gebruik van een gebroken kruispatroon voor celafgifte in aggregaten. (C) Gebruik van een kruispatroon om individuele cellen vrij te maken. Overgenomen (aangepast) met toestemming van Fattahi et al.19 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Cruciaal in het inkapselingsprotocol is zowel de celzaaidichtheid als de dikte van de hydrogel, omdat beide parameters het aantal cellen kunnen beïnvloeden dat ter observatie in de hydrogel is opgenomen. Om dit aan te tonen, werden A. tumefaciens-cellenmonsters ingekapseld in hydrogels van twee verschillende diktes met behulp van dunne afstandhouders (12,7 μm) of dikke afstandhouders (40 μm) gekweekt en afgebeeld volgens de vastgestelde protocollen. Dunnere hydrogels resulteerden in een microkoloniedichtheid van 90 kolonies/mm2 in de hydrogel, waarbij minimale kolonieoverlapping werd waargenomen(figuur 5A). Hydrogeldiktes groter dan 12,7 μm resulteerden daarentegen in de vorming van overlappende kolonies in verticale richting(figuur 5B),wat kan resulteren in de extractie van meerdere kolonies. Overlappende kolonies kunnen kruisbesmetting veroorzaken tijdens de extractie vanwege de tweedimensionale aard van het lichtpatroon. Zo kan een topkolonie worden geviseerd, terwijl er ook een onderliggende kolonie mee wordt geëxtraheerd(figuur 5C). Daarom wordt het gebruik van afstandhouders van 12,7 μm aanbevolen voor hydrogelbereiding.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig05.jpg"> Figuur 5: De dikte van de hydrogel beïnvloedt de extractiezuiverheid. Doorgebruik te maken van afstandhouders met een dikte van 12,7 μm voor hydrogelvorming, worden kolonies gevormd binnen één 10x brandpuntsvlak. (B) Overlay van kolonies kan worden waargenomen bij 10x vergroting als afstandhouders met grotere diktes dan 12,7 μm worden gebruikt. (C) Kruisbesmetting kan optreden met een overlay van kolonies tijdens het vrijkomen van cellen: (i) een ringpatroon wordt gebruikt om een gerichte celkolonie vrij te geven, (ii) de beoogde celkolonie wordt losgemaakt van de hydrogel en (iii) een tweede, onderliggende kolonie wordt waargenomen tijdens de blootstelling aan licht onder de beoogde kolonie. Ook deze kolonie wordt verwijderd, met kruisbesmetting tot gevolg. Overgenomen (aangepast) met toestemming van Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Gezien de potentiële schade aan bacteriën met UV-licht, werd het effect van gevarieerde UV-lichtmicropatronen op de levensvatbaarheid van cellen verder bestudeerd met behulp van model, Gram-positieve bacteriën (B. subtilis) en model, Gram-negatieve bacteriën (E. coli). Elk werd ingekapseld in bulkhydrogels en gekweekt in kolonies op microschaal volgens standaardprotocollen, waarbij hun compatibiliteit met de hydrogel werd geverifieerd. Gerichte microkolonies van equivalente grootte (26 ± diameter van 1 μm) werden vervolgens blootgesteld aan een constante lichtdosis (168 mJ / mm2), hetzij in de vorm van cirkelpatronen die hele microkolonies blootstellen aan UV-licht of kruispatronen die alleen hydrogelranden afbreken om blootstelling aan licht aan cellen te minimaliseren. Cellen werden vervolgens teruggevonden en verguld om de CFU / ml te kwantificeren die van elke kolonie werd teruggevonden. Er werd geen significant verschil in celherstelniveau gevonden(figuur 6A). Om de zuiverheid van de geëxtraheerde cellen verder te onderzoeken, werd DNA geëxtraheerd uit E. coli-monsters en geanalyseerd met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer. Voor beide patronen vallen DNA-kwaliteitsniveaus binnen een A260/ A280-bereik tussen 1,8 en 2,0 (figuur 6B), wat in het ideale bereik ligt voor genomische sequencing25. Dit toont aan dat de UV-patronen die worden gebruikt voor afgifte onder de beschreven omstandigheden een minimaal effect hebben op de hoeveelheid levensvatbare cellen die worden teruggewonnen uit de bulkhydrogels of op de genomische DNA-kwaliteit na extractie.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig06.jpg"> Figuur 6: Impact van verschillende lichtblootstellingspatronen op de levensvatbaarheid van cellen en de DNA-kwaliteit van bacteriën die vrijkomen uit bulkhydrogels. (A) Celherstelniveaus voor zowel E. coli als B. subtilis na extractie met behulp van kruispatronen en cirkelpatronen. Voor dit experiment werd extractie uitgevoerd uit bolvormige kolonies met dezelfde diameter (26 μm ± 1 μm) om ervoor te zorgen dat het aantal vrijgegeven cellen uit elke kolonie gelijkwaardig was. De geëxtraheerde oplossingen werden vervolgens verguld om de CFU / ml te berekenen die uit elk patroon werd verkregen. Statistische analyse toonde geen significant verschil in CFU/ml verkregen uit kruis- en cirkelpatronen voor zowel E. coli als B. subtilis (P-waarde > 0,05, n= 6 voor beide stammen). BSpectrofotometrische kwantificering van de DNA-kwaliteit voor geïsoleerde E. coli-cellen met behulp van kruis- en cirkelpatronen. Hier toonde statistische analyse geen significant verschil in DNA-kwaliteit voor de gebruikte patronen (P-waarde > 0,05, n = 6) (C) Brightfield-afbeeldingen van kolonies met gelijke diameters blootgesteld aan kruis- en cirkelpatronen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Microwell-arrays bieden een alternatieve, lab-on-a-chip screeninginterface die meer gecontroleerde screeningfuncties biedt in vergelijking met bulkhydrogels. Microwell-arrays maken het bijvoorbeeld mogelijk om bacteriën te zaaien in afzonderlijke kweekplaatsen waar het aantal cellen in het entmateriaal kan worden gecontroleerd. Geometrische kenmerken van microwells zoals diepte en diameter worden ook geregeld door middel van standaard microfabricagemethoden. Met deze voordelen zijn microwells nuttig geweest voor het bestuderen van bacteriegroei onder ruimtelijke opsluiting26, en meest recent voor de ontdekking van symbiotische en antagonistische interacties tussen verschillende bacteriesoorten wanneer ze samen opgesloten zijn op microschaal18. Cellulaire extractie uit putten voor genomische analyse zoals 16S amplicon sequencing is van cruciaal belang voor deze toepassingen. Met behulp van hetzelfde hydrogelmateriaal kan UV-licht worden blootgesteld aan een put die interessante cellen bevat, hetzij als cirkel- ofringpatronen. Dit laatste zorgt alleen voor hydrogelafbraak aan de rand van de microwell om directe bestraling van cellen te voorkomen. Om dit aan te tonen, werden A. tumefaciens-cellen die mCherry tot expressie brachten in putten gezaaid, de hydrogel werd vervolgens aan de microwell-array bevestigd. Cellen werden gekweekt en vervolgens bestraald met cirkel- of ringpatronen. Het membraan werd vervolgens gekleurd met fluoresceïne-5-maleimidekleurstof. Tweekleurige fluorescentiebeelden onthulden dat zowel het membraan als de cellen in de putten worden verwijderd voor beide bestralingspatronen17. In tegenstelling tot het bulk hydrogel-formaat, is celextractie hier alleen waargenomen in de vorm van celclusters18.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig07.jpg"> Figuur 7: Representatieve confocale microscopiebeelden die de impact van lichtpatronen op celisolatie van microwell-arrays laten zien. (A) Microwells met een diameter van 40 μm die bacteriën (rood) bevatten na zaaien en kweken. (B) Belichting van licht met behulp van cirkel- en ringpatronen (blauw). (C) Verminderde rode fluorescentie toont aan dat cellen worden geëxtraheerd uit bestraalde putten. (D) Tweekleurig fluorescentiebeeld van membranen en bacteriën na bestraling, wat wijst op verwijdering van zowel de hydrogel (groen) als bacteriën (rood) uit doelputten. (E) Z-stack, tweekleurig fluorescentiebeeld van doelputten. De rode lijn in (D) geeft het xz-vlak aan dat is afgebeeld in (E) en de groene lijn in (E) geeft het xy-vlak aan dat is afgebeeld in (D). Monsters in afbeeldingen (C-E) werden gewassen voor verwijdering van vrijgegeven cellen, vervolgens gefixeerd en afgebeeld. Schaalbalk = 40 μm. Overgenomen (aangepast) met toestemming van van der Vlies et al.17. Copyright 2019 Amerikaanse chemische soceity. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Om de levensvatbaarheid van bacteriëncellen en DNA-kwaliteit na extractie in dit formaat te kwantificeren, werden B. subtilis- en E. coli-cellen gezaaid, gekweekt en vervolgens vrijgegeven uit microwell-arrays met behulp van cirkel- en ringpatronen(Figuur 8A,B). Vrijgegeven cellen werden vervolgens op ATGN-agarplaten geplateerd en de DNA-kwaliteit van de geëxtraheerde cellen werd gekwantificeerd. Om ervoor te zorgen dat er tijdens elke extractie een consistent aantal cellen aanwezig was, werden microwells met vergelijkbare fluorescerende intensiteiten (~ 6000 A.U.) en daarom een vergelijkbaar aantal cellen gericht op afgifte. Het aantal levensvatbare cellen geëxtraheerd met behulp van een cirkelpatroon verschilde niet significant van het aantal levensvatbare cellen geëxtraheerd met behulp van een ringpatroon voor beide bacteriën (Figuur 8C). Ook verschilden de DNA-kwaliteitsniveaus niet significant tussen de cirkel- en ringpatronen voor beide bacteriën(figuur 8D). Vandaar dat, vergelijkbaar met bevindingen in bulkhydrogels, de toepassing van UV-licht met de intensiteit en duur die hier zijn gespecificeerd, een verwaarloosbare invloed had op de levensvatbaarheid en DNA-kwaliteit van cellen die uit de microwell-arrays werden geëxtraheerd. Deze bevindingen tonen aan dat levensvatbare bacteriecellen selectief uit microwells kunnen worden gehaald met minimale schade voor downstream-analyse.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig08.jpg"> Figuur 8: Impact van verschillende lichtblootstellingspatronen op de levensvatbaarheid van cellen en de DNA-kwaliteit van bacteriën die vrijkomen uit microwell-arrays. (A,B) Voor zowel E. coli als B. subtiliswerden cirkelpatronen en ringpatronen gebruikt voor celextractie uit microwells van 10 μm. Cirkelpatroon met een diameter van 10 μm en ringpatroon met een binnendiameter van 10 μm en buitendiameter van 20 μm werden in dit experiment gebruikt voor celextractie. Microwells met dezelfde diameters werden gebruikt om ervoor te zorgen dat het aantal vrijgekomen cellen van elke microwell hetzelfde was. (C) De geëxtraheerde oplossingen werden vervolgens verguld om de kve/ml te berekenen die uit elk blootstellingspatroon werd verkregen. Statistische analyse toonde geen significant verschil in CFU/ml verkregen uit cirkel- en ringpatroon voor zowel E. coli als B. subtilis (P-waarde > 0,05, n = 6 voor beide stammen). (D) Spectrofotometrie werd gebruikt om de DNA-kwaliteit van zowel E. coli- als B. subtilis-cellen te meten met behulp van cirkel- en ringpatronen. Hier toonde statistische analyse geen significant verschil in de DNA-kwaliteit voor de gebruikte patronen (P-waarde > 0,05, n = 6 voor beide stammen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Ontwerp en fabricage van microwell arrays. (A) Standaard microfabricagetechnieken werden toegepast om microwell arrays op silicium wafers te fabriceren. (B) Elk substraat bestond uit 7 x 7 arrays van putten met een diameter van 10 μm met een diepte van 20 μm en een pitch van 30 μm. (C) Elke array bestond uit 225 microwells. Dit cijfer is gewijzigd van Barua et al.18. Copyright 2021 Frontiers Media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Het gebruik van fotoafbreekbare hydrogels om bacteriële cellen te isoleren door gebruik te maken van een lichtpatiteringstool met hoge resolutie wordt gerapporteerd. Essentiële experimentele procedures, resultaten en voordelen van het proces worden beoordeeld. De methode maakt een snelle en goedkope isolatie mogelijk van gerichte bacteriën met zeldzame of unieke functies uit heterogene gemeenschappen of populaties.

Fotoafbreekbare hydrogelinterfaces voor screening, selectie en isolatie van bacteriën

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Dit protocol is ontworpen om cellen snel te isoleren van screeninginterfaces voor genomische karakterisering en deze mogelijkheid is belangrijk omdat het macroscopisch waarneembare celkenmerken kan combineren met genomische informatie. De beoogde bacteriële cellen uit de screeningsinterfaces kunnen met behulp van deze techniek op een operationeel eenvoudige manier met een hoge ruimtelijke positie worden geïsoleerd. De hydrogels kunnen worden geïmplementeerd in andere screeninginterfaces.Het hydrogelmateriaal kan gemakkelijk worden opgenomen in microfluïdische kanalen voor het on-demand ophalen van cellen uit microfluïdische apparaten. Begin met het inenten van de cross-linking buffer met de gewenste celdichtheid. Bereid de hydrogelprecursoroplossing in een microcentrifugebuis van 0,5 milliliter door 12,5 microliter van de cross-linking buffer en 5,6 microliter PEG ONB-diacrylaatoplossing toe te voegen.En voeg ten slotte 6,9 microliter PEG-thioloplossing op de onderarm toe aan het mengsel. Voor celinkapseling in de hydrogelvoorloperoplossing plaatst u de thiolated base coverslips op een schone petrischaal en plaatst u twee afstandhouders op de twee tegenover elkaar liggende zijden van de coverslip. Bevestig de afstandhouders op de bodemdeksel door de afstandhouders op de petrischaal te plakken.Na het toevoegen van het gewenste volume van de precursoroplossing op een niet-reactieve geperfluoralkyleerde glasplaat, plaatst u de dia op de basisdeksels en laat u de hydrogelvorming gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur voltooien. Zodra de gelation is voltooid, verwijdert u voorzichtig de geperfluoralkyleerde glasplaat. Plaats het substraat in de petrischaal van 60 bij 15 millimeter met ATGN-media aangevuld met antibioticum.Zaad 700 microliter bacteriële celsuspensies met OD 600 van 0,1 over het microwell array substraat en maak de hydrogel precursor oplossing zoals eerder aangetoond met behulp van 12,5 microliter fosfaat gebufferde zoutoplossing ATGN van pH acht. Pipetteer 12,5 microliter van de precursoroplossing op een niet-reactieve geperfluoralkyleerde glasplaat en plaats twee stalen afstandhouders van 38 micrometer aan twee tegenover elkaar liggende zijden van het met cellen ingeënte microwell array-substraat. Keer vervolgens de geperfluoralkyleerde glasplaat om met de druppel precursoroplossing en plaats een druppel in het midden van het microwell-substraat.Wanneer de hydrogel wordt gevormd na een incubatie van 25 minuten bij kamertemperatuur, verwijdert u voorzichtig de glasplaat van het microwell-substraat en plaatst u het substraat in een petrischaal met ATGN-media aangevuld met antibioticum. Plaats het monster in een PDMS-houder en voeg de gedefinieerde media bovenop het monster toe om uitdroging van het monster te voorkomen en een drageroplossing voor vrijgekomen cellen te bieden. Nadat u de kalibratiespiegel op zijn plaats hebt gebracht, past u de microscoopfocus aan om een scherp beeld te krijgen van de kolonies in de hydrogel- of microwell-array en inspecteert u om kolonies of putten van belang te identificeren.Ontwerp hier de lichtpatronen terwijl de cameraweergave de kolonies in het monster toont om verschillende patronen voor celextractie te testen en het gedefinieerde patroon op te slaan. Selecteer vervolgens het gedeelte sessiebeheer en voeg de opgeslagen reeks toe onder het tabblad met de titel met de productnaam van het verlichtingsgereedschap met patroon. Kies de optie om het patroon te stimuleren om de gewenste belichtingslocatie te bekijken en aan te passen.Pas vervolgens de lichtintensiteit aan op 60% en de belichtingstijd op 40 seconden onder het tabblad LED-bediening en start het belichtingsproces. Bewaak de hydrogeldegradatie in realtime en Brightfield-modus om de celafgifte te garanderen. Om de vrijgekomen cel te verzamelen, verandert u het microscoopfilter van Brightfield naar TRITC om het blootgestelde gebied van het monster met het blote oog te visualiseren.Zodra het blootgestelde gebied zich bevindt, plaatst u het uiteinde van de buis op de bestraalde plek en verandert u het microscoopfilter terug naar Brightfield om het ophalen van cellen in realtime te volgen. Gebruik de spuit die aan het andere uiteinde van de slang is bevestigd om voorzichtig 200 microliter oplossing met de vrijgekomen cellen op te zuigen en breng de oplossing over in een centrifugebuis van 1,5 millimeter voor DNA-analyse of plating. Verschillende UV-licht micropatronen werden gebruikt voor celextractie uit bulk hydrogels, die de morfologie van de vrijgekomen cellen beïnvloedden.De UV-blootstelling in een ringpatroon resulteerde in het vrijkomen van de hele kolonie ingekapseld in een beschermende PEG-hydrogel. Door daarentegen een deel of de hele kolonie bloot te stellen aan UV-licht, kunnen cellen worden geëxtraheerd als geaggregeerde celclusters of als vrije individuele cellen. De celzaaidichtheid en dikte van de hydrogel zijn belangrijk voor celinkapseling.De dunnere hydrogels resulteerden in microkolonies met minimale kolonieoverlapping, terwijl de hydrogels met verhoogde dikte resulteerden in overlappende kolonies, wat kon resulteren in de extractie van meerdere kolonies. Overlappende kolonies kunnen kruisbesmetting veroorzaken tijdens de extractie vanwege de tweedimensionale aard van het lichtpatroon. Wanneer een topkolonie het doelwit was, werd de onderliggende kolonie er ook mee geëxtraheerd.Het effect van gevarieerde UV-lichtmicropatronen op de levensvatbaarheid van cellen werd ook beoordeeld. Wanneer microkolonies werden blootgesteld aan gecontroleerde doses UV-licht in een cirkelvormig of kruispatroon, werden celherstel en DNA-zuiverheid niet beïnvloed. De cellen werden met succes opgehaald uit microwell-arrays met behulp van deze benadering, wat bleek uit de representatieve confocale microscopiebeelden, waar bij bestraling in het cirkel- en ringpatroon de cellen in het respectieve patroon werden verwijderd.Na extractie uit microwell arrays werden de levensvatbaarheid van de cel en de DNA-hoeveelheid beoordeeld. De blootstellingspatronen beïnvloedden noch het aantal levensvatbare cellen, noch de DNA-kwaliteit, wat aangeeft dat levensvatbare bacteriecellen selectief uit microwells konden worden gehaald met minimale schade, en hun DNA kon met hoge zuiverheid worden geïsoleerd voor downstream genomische analyse. Controleer altijd of de hydrogel zich heeft gevormd voordat u de geperfluoralkyleerde coverslip verwijdert.Precisie en zorg zijn vereist voor het plaatsen van de afstandhouders voor hydrogelafzetting en het gebruik van de buizen voor extractie van cellen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Fabriceren van een nier Cortex extracellulaire Matrix afkomstige Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Toepassingen voor open source Microplate-compatibele verlichtings panelen

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Voorbereiding en karakterisering van op grafeen gebaseerde 3D biohybride hydrogel bioink voor perifere neuro-engineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

Isolatie van gentherapievectoren van de volgende generatie door middel van engineering, barcoding en screening van adeno-geassocieerde virus (AAV) capsid-varianten

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...