Name: photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch den NSF CAREER Award #1944791 unterstützt.

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	<li>Welch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+single+cell+isolation+for+genomics+using+microraft+arrays.">Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).</li><li>Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+Single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+flow+cytometry:+The+role+of+microfabrication+methodologies,+performance+and+functional+specification.">Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification.</a> Technology. 06 (01), 1-23 (2018).</li><li>Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -. 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T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+copatterning+strategies+using+azlactone-based+block+copolymers.">Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabricating+reactive+surfaces+with+brush-like+and+crosslinked+films+of+azlactone-functionalized+block+co-polymers.">Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562 (2018).</li><li>Timm, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+Maleimide-Thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+modified+salt-out+method+for+DNA+extraction+from+whole+blood+lymphocytes:+A+simple+and+economical+method+for+gene+polymorphism.">Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism.</a> Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28 (2018).</li><li>Hansen, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+of+bacteria+in+microwell+arrays+reveals+the+importance+of+confinement+in+community+development.">Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development.</a> PLoS One. 11 (5), 0155080 (2016).</li><li>Halsted, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transparent+microwell+arrays+for+optical+monitoring+and+dissection+of+microbial+communities.">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).</li><li>Zustiak, S. 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RRH und AJV haben diese Technologie zum Patent angemeldet. Die übrigen Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Dieses Manuskript demonstriert die Verwendung von photodegradierbaren Hydrogelen für das Screening und die Isolierung von Bakterien. Das Material und der Ansatz ermöglichen eine Hochdurchsatzkultur, die Kontrolle über Wachstumsmedien und Wachstumsbedingungen sowie eine saubere und präzise Zellextraktion auf einfache und kostengünstige Weise. Die Extraktion erfordert nur ein Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit dem gemusterten Beleuchtungswerkzeug und kann sequentiell durchgeführt werden, um mehrere Zellziele zu isolieren. Jede Extraktion dauert 5-10 Minuten, und bis zu 30 Zielkolonien wurden aus einem einzigen Hydrogel entfernt. Ein wesentlicher Vorteil des Ansatzes ist seine Anpassungsfähigkeit an eine Vielzahl unterschiedlicher Assay-Formate, wie hier mit dem Screening von Bulk-Hydrogelen und Microwell-Arrays demonstriert wird. Der Trennprozess in beiden Formaten wurde erfolgreich eingesetzt, um Bakterien zu isolieren, die ein einzigartiges Wachstumsverhalten für die nachgeschaltete Genotypisierung nach Kultur und mikroskopischer Beobachtung aufweisen, eine kritische Fähigkeit zur Verbindung des Zellgenostyps mit dem Phänotyp. Bis heute umfassten genomische Charakterisierungen von Bakterien, die aus diesen Grenzflächen extrahiert wurden, die 16S-Amplikon-Sequenzierung, um Multi-Spezies-Sammlungen von Bakterien aus Umweltmikrobiomen zu identifizieren, die emergentes Wachstumsverhalten erzeugen18, und für die Sequenzierung des gesamten Genoms, um genetische Mutationen erfolgreich zu identifizieren, die seltene Wachstumsprofile in Zellen verursachen, die in Mutantenbibliotheken vorhanden sind19.
Die Verwendung von Bulk-Hydrogelen für das Screening und die Isolierung von Zellen ist das einfachste und einfachste Format. Photoabbaubare Bulk-Hydrogele bilden sich schnell (25 min), nachdem die Vorläufer über transparente Glasabdeckungen gemischt wurden, um Zellen in einer 3D-Zellkulturmatrix zu verkapseln, die mit einem standardaufgebauten oder inversen Fluoreszenzmikroskop abgebildet wird. Daher hat die Methode das Potenzial, in gängige mikrobiologische Labors translational zu sein, die nicht über Mikrofabrikationsressourcen oder Fachwissen verfügen. Ein Nachteil dieses Formats ist, dass die Zellen im gesamten dreidimensionalen Hydrogel zufällig orientiert sind. Daher können Zellen bei der Bildgebung mit höheren Vergrößerungszielen aus der Fokusebene heraus erscheinen und die Extraktion kann schwierig sein, wenn Zellkolonien zu nahe beieinander ausgerichtet sind oder wenn es eine vertikale Überlagerung von Kolonien gibt. Die Abscheidung eines dünnen Hydrogels (<13 μm) wie beschrieben ist entscheidend, um diesen Nachteil zu mildern. Die Belichtung in gebrochenen Kreuzlichtmustern (Abbildung 4B) ist hier vorzuziehen, da dieses Muster zu Zellen führt, die frei von Hydrogel sind, die nur minimal UV-Licht ausgesetzt sind und durch Beschichtung leicht wiederhergestellt werden können.
Im Gegensatz dazu bietet das Microwell-Array-Format eine besser kontrollierte Schnittstelle, da Bakterienzellen in diskrete Mikrotöpfe unterteilt sind, die als kleine Kultur- oder Co-Kulturstellen dienen17,18,26. Mikrotiterplattenabmessung, Steigung und Dichte werden mit photolithographischen Standardtechniken präzise hergestellt. Im Vergleich zu Bulk-Hydrogelen können Bakterien aus Microwell-Arrays mit einem höheren Spezifitätsgrad und einer geringeren Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination extrahiert werden, da die Zellen nur an vordefinierten Stellen vorhanden sind und nicht zufällig im gesamten Hydrogel verteilt sind. Die Konzentration und die Verhältnisse der Bakterienzellen in der Aussaatlösung können auch variiert werden, um die Menge und Zusammensetzung des Mikrotrinnenokulums durch einen Aussaatprozess zu kontrollieren, der in früheren Berichten26charakterisiert wurde, was dem Benutzer Flexibilität bei der experimentellen Gestaltung des Bildschirms verleiht. Der Hauptnachteil des Screenings mit dem Microwell-Array-Format ist die zusätzliche Zeit und das Fachwissen, die für die Mikrofabrikation erforderlich sind. Die Herstellung von Mikrobohrungen wurde auf ~ $ 10 pro Array geschätzt, einschließlich Materialkosten und Reinraumkosten. Darüber hinaus werden Microwells-Arrays traditionell aus Silizium hergestellt, was zu Bildgebungsschwierigkeiten führen kann, da die Substrate nicht transparent sind. Darüber hinaus kann eine hohe Lichtstreuung von der Siliziumoberfläche die Bildgebung innerhalb der Mikroträume einschränken und die Musterauflösung während der Hydrogelbelichtung mit UV-Licht aus dem gemusterten Beleuchtungswerkzeug verringern (siehe Abbildung 8A,B). Ähnliche Mikrobohrungen wurden auf transparenten Quarzsubstraten hergestellt, um diese Art von Einschränkungen zu beheben27; diese Herstellung ist jedoch wesentlich schwieriger. Die Exposition gegenüber Ringmustern, die den Umfang des Brunnens beleuchten, ist hier vorzuziehen, um freie Zellen aus den Vertiefungen freizusetzen und gleichzeitig die UV-Exposition zu minimieren.
Das häufigste Problem, das in beiden Formaten auftritt, ist die Ablösung des Hydrogels vom darunter liegenden Substrat während der Kultur aufgrund der Hydrogelquellung. Wenn dies ein Problem für Bulk-Hydrogele ist, sollte das Vorhandensein, die Dichte und die Gleichmäßigkeit von Thiolgruppen in der chemischen (MTPS) Anheftungsschicht über die Oberfläche des Basisglas-Deckglases mit einer geeigneten Oberflächencharakterisierungstechnik (XPS, ATR-FTIR, AFM usw.) überprüft werden. Geringe Dichten von Oberflächenthioolgruppen aufgrund einer ineffizienten Oberflächenfunktionalisierung können zu einer schwachen Wechselwirkung zwischen dem Substrat und dem Hydrogel führen. Wenn eine geringe Oberflächenthiolierung auftritt, sollte die Stabilität der MTPS-Lösung überprüft werden. Bei der Erstreinigung des Glasobjektträgers sollte darauf geachtet werden, dass vor der MTPS-Behandlung eine saubere Oberfläche gewährleistet ist, und es sollte darauf geachtet werden, dass während der MTPS-Oberflächenreaktion wasserfreies Toluol verwendet wird (Protokollabschnitt 4). Bei Microwell-Arrays werden Oberflächen nicht thioliert, und Hydrogele heften sich stattdessen durch die teilweise Füllung der Vertiefungen mit dem Hydrogel an, das das Hydrogel am Siliziumsubstrat17verankert. Wenn die Hydrogelablösung in diesem System ein Problem darstellt, können mehr Mikrobohrungen oder andere mikroskalige Merkmale in das Array geätzt werden, um das Hydrogel weiter auf dem Substrat zu verankern, um eine stärkere Anhaftung zu fördern.
Eine Einschränkung der Technik in beiden Formaten ist die begrenzte Stabilität der Hydrogele in Gegenwart von Bakterien. Es wurde festgestellt, dass einige Bakterien, wie A. tumefaciens, das Hydrogel im Laufe von 5-7 Tagen17,19abbauenkönnen,was die Experimentzeit begrenzt. Aktuelle Untersuchungen der Mechanismen des bakteriellen Abbaus sind im Gange; Es wird angenommen, dass die aus den Diacrylatmonomeren vorhandenen Estergruppen einer bakterienvermittelten Hydrolyse und/oder einem enzymatischen Abbau unterliegen, wie in anderen Systemenfestgestellt 17. Die Entwicklung stabilerer Hydrogel-Chemikalien verlängert die Zeit, in der Bakterien im Hydrogel verbleiben können, und dehnt den Screen auf Mikroorganismen mit langsameren Wachstumsraten aus. Eine zweite Einschränkung besteht darin, dass bei beiden Formaten die Zellrückgewinnung und -extraktion in einer offenen Umgebung erfolgt, was zu relativ hohen Extraktionsvolumina (30-100 μL) führt, die anfällig für Kontaminationen von außen sein können. Daher muss darauf geachtet werden, dass genügend Zellen aus den Zielkolonien vorhanden sind und gleichzeitig das Extraktionslösungsvolumen minimiert wird. Um genügend Zellen für die Plattierung und Wiederherstellung oder für die Extraktion von DNA-Material zu erhalten, wurde beobachtet, dass in Bulk-Hydrogelen Zellen lange genug kultiviert werden müssen, um Koloniedurchmesser von mindestens 10 μm zu erreichen. Um das erforderliche Volumen für die Zellextraktion zu senken, wurde beobachtet, dass die Verwendung einer Mikroliterspritze und eines Schlauches (Abbildung 2) effizienter war als das Pipettieren. Der Schlauch ermöglichte es, die Isolate genauer vom Freisetzungspunkt zu ziehen, was weniger Lösungsvolumen erforderte und die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination verringerte.
Zukünftige Arbeiten beinhalten das Verständnis der Wirkung der mechanischen Eigenschaften von Hydrogel auf das Zellwachstum, da die mechanischen Eigenschaften dieser Hydrogele durch die Auswahl geeigneter PEG-basierter Monomervorläufer mit verschiedenen Molekulargewichten gut kontrolliert werden28, und mechanische Wechselwirkungen spielen wahrscheinlich eine wichtige Rolle im Bakterienverhalten29. Da die Hydrogelmaterialien problemlos in eine Vielzahl unterschiedlicher Systeme und Geräte eingebunden werden können, konzentriert sich die Weiterentwicklung auch auf die Integration dieses Materials in mikrofluidische Systeme. Dies würde die Extraktionslösung zu Femtoliter- bis Picoliter-Volumina im Vergleich zu herkömmlichen 30-100 μL-Volumina reduzieren, die derzeit im offenen Sammlungsformat benötigt werden. Kleinere Lösungsvolumina würden die potenzielle Kontamination erheblich reduzieren und den Ansatz in Richtung Einzelzellisolierung und -charakterisierung vorantreiben.

Die Isolierung von Zellen mit einzigartigem Verhalten aus einer komplexen und heterogenen Umgebung ist grundlegend für die Gewinnung genetischer Informationen in der Biologie1. In der Mikrobiologie wird die Selektion und Isolierung seltener oder einzigartiger Mikroben nach Beobachtung in vielen Anwendungen wichtig, die eine Verbindung zwischen genomischen Informationen und beobachtbaren phänotypischen Informationen erfordern. Zu diesen Anwendungen gehören die Auswahl phänotypisch seltener Stämme aus Mutantenbibliotheken2, die Auswahl von Keystone-Mikroorganismen aus komplexen mikrobiellen Gemeinschaften3,4und die Auswahl phänotypisch seltener, aber wichtiger Bakterien aus isogenen Populationen. Die Isolierung lebensfähiger, aber nicht kulturierbarer Zellen (VBNC) aus einer Bakterienpopulation ist ein wichtiges Beispiel für letztere, bei der Zellen mit dem VBNC-Phänotyp häufig in Bakterienpopulationen im Verhältnis 1:102 bis 1:105 5 versteckt sind5,6. Aufgrund der weit verbreiteten Schwierigkeiten bei der Bakterienisolierung bleibt über viele phänotypisch seltene Mikroorganismen vieles unbekannt. Diese Einschränkungen unterstreichen die Notwendigkeit von Zellisolationstechniken, um zuerst die Zielzelle(n) aus einer Mischung zu identifizieren und sie dann für die nachgeschaltete molekulare Analyse abzurufen und zu isolieren7.
Einige der am häufigsten etablierten Methoden der Zellisolierung umfassen durchflusszytometrie und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)8,immunmagnetische Trennung9,10und Mikrofluidik11. Während diese Isolationsmethoden einen hohen Wert haben, haben sie auch Nachteile, die ihre Verwendung einschränken. Zum Beispiel kann FACS eine routinemäßige mikrobielle Isolierung auf Einzelzellebene für die nachfolgende genomische Analyse3 bieten, ist aber oft durch seine Verfügbarkeit und Kosten sowie durch nachgelagerteKontaminationsprobleme begrenzt 11. Mikrofluidische Ansätze wie die mikrofluidische Durchflusszytometrie haben viel Aufmerksamkeit erregt, was im Vergleich zur herkömmlichen Durchflusszytometrie eine signifikante Reduzierung des erforderlichen Probenvolumens ermöglicht12. Die Trennung und das Abrufen einzelner oder kleiner Zellsammlungen aus mikrofluidischen Geräten ist jedoch oft ein herausforderndes Problem, das typischerweise eine komplexere Einrichtung und ein komplexeres Gerätedesign erfordert13. Viele mikrofluidische Ansätze charakterisieren Zellen genetisch, bevor sie in eine Vorrichtung14eingegeben und beobachtet werden, wodurch die Anzahl der einzigartigen Spezies, die bei der Durchführung eines funktionellen Screenings beobachtet werden, begrenzt wird. Angesichts dieser Einschränkungen ist eine weitere Innovation sowohl von Methoden als auch von Materialien, die für das Screening und die Isolierung von Zellen praktikabel sind, für den breiten Einsatz in vielen Labors erforderlich.
Dieser Beitrag stellt einen neuen, materialbasierten Ansatz für das Screening und die Isolierung von Bakterien vor. Die Methode verwendet photoabbaubare Hydrogele für die Zellverkapselung, Kultur, mikroskopische Beobachtung und On-Demand-Freisetzung und -Wiederherstellung von Zielbakterien mit einzigartigen Phänotypen. Hydrogele sind so konzipiert, dass sie eine Maschenweite von 10 nm enthalten, wobei jede Vernetzung o-Nitrobenzylgruppen15enthält. Das Material verkapselt oder fängt Zellen zur Beobachtung ein und ermöglicht gleichzeitig die Diffusion von Nährstoffen und Abfallprodukten zu und von Zellen für die Kultur. Die Exposition des Materials gegenüber einer gemusterten 365 nm UV-Lichtquelle durch ein aufrechtes Mikroskop ermöglicht den lokalen Abbau des Hydrogels durch Photokleave der o-Nitrobenzylgruppen16, 17. Der Abbau löst die selektive Freisetzung von Zellen zur Erholung für die nachgelagerte Analyse aus, einschließlich genomischer und möglicherweise proteomischer und transkriptomischer Analysen. Der Versuchsaufbau und das Protokoll sind relativ einfach, kostengünstig und in mikrobiologische Labore translational. Es erfordert nur die Zellverkapselung durch Hydrogelbildung, die Beobachtung von gefangenen Zellen mit einem aufrechten Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskop und die Beleuchtung von Zellen von Interesse mit einer strukturierten UV-Lichtquelle zum Abrufen.
Ein wesentlicher Vorteil dieses materialbasierten Screening-Ansatzes ist seine Anpassungsfähigkeit an verschiedene Screening-Formate. In seinem einfachsten Format kann das Material zum Screening verwendet werden, indem eine heterogene Zellsammlung in Bulk-Hydrogelen eingekapselt wird. Zellen werden dann für den gewünschten Phänotyp beobachtet und einzelne Zellen von Interesse werden zur genomischen Charakterisierung entfernt. In aufwendigeren Formaten kann das Material auch in Lab-on-a-Chip-Geräte integriert werden, um eine präzise Zellfreigabe und -entnahme aus den gewünschten Bereichen des Geräts zu ermöglichen. Beide Formate werden hier beschrieben, und beide haben kürzlich neuartige mikrobielle Screening- und Selektionsanwendungenermöglicht 17,18,19. Die Methode wird hier mit Modell-Gram-negativen Organismen (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) und einem Modell-Gram-positiven Organismus (Bacillus subtilis) demonstriert und wurde leicht auf eine Vielzahl anderer Bakterien ausgedehnt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>175617-25G</td>
			<td>&#62; 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox detergent powder</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>1104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Certified ACS Granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave SK300C</td>
			<td>Yamato Scientific</td>
			<td>18016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 1A1135</td>
			<td>Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td>1A1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield upright microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C614-500</td>
			<td>For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>0188-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: -30-60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: &#60; 32 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli ATCC 25922</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R19020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium microscope slides plain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td>Contains inhibitor, 30 wt% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incu-Shaker Mini</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>E5-0014-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 7-hydrate</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Avantor Performance Materials, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen, compressed</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)</td>
			<td>NOF America Corporation</td>
			<td>PTE-100SH</td>
			<td>Sunbright-PTE-100SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>K813-500ML</td>
			<td>Store between 15 &#176;C&#8211;30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon400</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>DSI-D-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>25 x 75 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>BioXtra, &#62; 98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505-250G</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#62; 99.0% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel thickness gage</td>
			<td>Precision Brand Products</td>
			<td>77739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-1L</td>
			<td>Anhydrous, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td>For microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FS-110H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation

Biologen haben lange versucht, die Beziehung zwischen Phänotyp und Genotyp zu verstehen. Um diesen Zusammenhang besser zu verstehen, ist es entscheidend, praktische Technologien zu entwickeln, die mikroskopisches Zellscreening mit zellisolierter Hochreparation für die nachgelagerte genetische Analyse koppeln. Hier wird die Verwendung von photoabbaubaren Poly(ethylenglykol)hydrogelen zum Screening und zur Isolierung von Bakterien mit einzigartigen Wachstumsphänotypen aus heterogenen Zellpopulationen beschrieben. Die Methode beruht auf der Verkapselung oder dem Einfangen von Zellen mit dem Hydrogel, gefolgt von Kultur, mikroskopischem Screening, dann Verwendung eines hochauflösenden Lichtstrukturierungswerkzeugs zur raumzeitlichen Kontrolle des Hydrogelabbaus und Freisetzung ausgewählter Zellen in eine Lösung zur Rückgewinnung. Die Anwendung verschiedener Lichtmuster ermöglicht die Kontrolle über die Morphologie der extrahierten Zelle, und Muster wie Ringe oder Kreuze können verwendet werden, um Zellen mit minimaler direkter UV-Lichtexposition abzurufen, um DNA-Schäden an den Isolaten zu mildern. Darüber hinaus liefert das Lichtstrukturierungswerkzeug eine einstellbare Lichtdosis, um verschiedene Abbau- und Zellfreisetzungsraten zu erreichen. Es ermöglicht eine Degradation mit hoher Auflösung und ermöglicht den Zellabruf mit räumlicher Präzision im Mikrometerbereich. Hier wird die Verwendung dieses Materials zum Screening und Abrufen von Bakterien sowohl aus Bulk-Hydrogelen als auch aus mikrofabrizierten Lab-on-a-Chip-Geräten demonstriert. Die Methode ist kostengünstig, einfach und kann für häufige und aufkommende Anwendungen in der Mikrobiologie verwendet werden, einschließlich der Isolierung von Bakterienstämmen mit seltenen Wachstumsprofilen aus Mutantenbibliotheken und der Isolierung von Bakterienkonsortien mit emergenten Phänotypen für genomische Charakterisierungen.

Um die Fähigkeit von UV-Licht zu untersuchen, einen kontrollierten Hydrogelabbau für die Zellfreisetzung auszulösen, wurden Hydrogele zunächst über thiolierte Deckgläser verkapselt, ohne dass Bakterien vorhanden waren. Jedes Hydrogel wurde drei replizierten Kreismustern des Lichts bei unterschiedlichen Intensitäten und Belichtungszeiten ausgesetzt. Der prozentuale Gelabbau wurde nach UV-Lichtexposition bei jeder Lichtintensität berechnet, und die Expositionszeit wurde dann quantifiziert, indem hängende Thiolgruppen mit einem Fluorescein-5-maelimid-Farbstoff für die Fluoreszenzbildgebung19,24, Ein repräsentatives Beispiel dafür, wie diese beiden Parameter den Hydrogelabbau beeinflussen, ist in Abbildung 3 dargestellt. Wie offensichtlich, bietet das gemusterte Licht, das vom Musterbeleuchtungswerkzeug bereitgestellt wird, eine räumlich-zeitliche Kontrolle des Hydrogelabbaus mit einer Auflösung, die die Freisetzung nur einer kleinen Anzahl von Zellen ermöglichen kann.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig03.jpg"> Abbildung 3: Kontrolle des Hydrogelabbaus. Die UV-Lichtdosis und die daraus resultierende Hydrogelabbaurate sind über das gemusterte Beleuchtungswerkzeug abstimmbar. (Einschub) Für den strukturierten Hydrogelabbau wurden zwei verschiedene Lichtintensitäten gewählt. Nach 365 nm UV-Lichtexposition wurden Hydrogele mit Fluorescein-5-Maleimid für die Fluoreszenzbildgebung markiert. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung von Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Für die Zellextraktion wurden verschiedene Lichtmuster verwendet, um die Zellfreisetzung zu untersuchen (Abbildung 4). Hier wurden Agrobacterium-Bakterienzellen in Bulk-Hydrogele über thiolierten Glasdeckgläsern eingekapselt und dann zu mikroskaligen Kolonien kultiviert. Hydrogele wurden dann in der Hellfeldmikroskopie inspiziert, und gezielte Mikrokolonien wurden verschiedenen UV-Lichtmustern ausgesetzt. Es wurde beobachtet, dass unterschiedliche Expositionsmuster die Morphologie der freigesetzten Zellen beeinflussten. Dies ist potenziell vorteilhaft für verschiedene Anwendungen. Zum Beispiel führt die Freilegung eines Ringmusters um die Zielkolonie zur Freisetzung der gesamten Kolonie, die immer noch in einem schützenden PEG-Hydrogel und ohne direkte UV-Lichtexposition eingekapselt ist (Abbildung 4A), was Zellen konservieren und eine einfache nachgeschaltete Reinigung ermöglichen kann. Im Gegensatz dazu können Zellen durch die Teilweise- oder gesamte Exposition der Kolonie gegenüber UV-Licht entweder als aggregierte Zellcluster (Abbildung 4B) oder als freie, einzelne Zellen (Abbildung 4C) extrahiert werden.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig04.jpg"> Abbildung 4: Kontrolle über die Morphologie der extrahierten Zellen. (A) Verwendung eines Ringmusters zur Freisetzung der gesamten Zellkolonie, geschützt in einer PEG-Matrix. (B) Verwendung eines gebrochenen Kreuzmusters für die Zellfreisetzung in Aggregaten. (C) Verwendung eines Kreuzmusters zur Freisetzung einzelner Zellen. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung von Fattahi et al.19 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Entscheidend für das Verkapselungsprotokoll ist sowohl die Zellsaatdichte als auch die Dicke des Hydrogels, da beide Parameter die Anzahl der im Hydrogel zur Beobachtung enthaltenen Zellen beeinflussen können. Zur Demonstration wurden A. tumefaciens-Zellproben in Hydrogele zweier unterschiedlicher Dicke mit dünnen Abstandshaltern (12,7 μm) oder dicken Abstandshaltern (40 μm) verkapselt und nach den etablierten Protokollen abgebildet. Dünnere Hydrogele führten zu einer Mikrokoloniedichte von 90 Kolonien/mm2 im gesamten Hydrogel, wobei eine minimale Kolonieüberlappung beobachtet wurde (Abbildung 5A). Im Gegensatz dazu führten Hydrogeldicken von mehr als 12,7 μm zur Bildung überlappender Kolonien in vertikaler Richtung (Abbildung 5B), was zur Extraktion mehrerer Kolonien führen kann. Überlappende Kolonien können während der Extraktion aufgrund der zweidimensionalen Natur des Lichtmusters zu einer Kreuzkontamination führen. Beispielsweise kann eine Top-Kolonie anvisiert werden, während eine darunter liegende Kolonie ebenfalls mit ihr extrahiert wird (Abbildung 5C). Daher wird die Verwendung von 12,7 μm Abstandhaltern für die Hydrogelpräparation empfohlen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig05.jpg"> Abbildung 5: Die Hydrogeldicke beeinflusst die Extraktionsreinheit. (A) Durch die Verwendung von Abstandshaltern mit einer Dicke von 12,7 μm für die Hydrogelbildung werden Kolonien innerhalb einer 10-fachen Fokusebene gebildet. (B) Überlagerungen von Kolonien können bei 10-facher Vergrößerung beobachtet werden, wenn Abstandhalter mit größeren Dicken als 12,7 μm verwendet werden. (C)Kreuzkontamination kann mit einer Überlagerung von Kolonien während der Zellfreisetzung auftreten: (i) ein Ringmuster wird verwendet, um eine Zielzellkolonie freizusetzen, (ii) die Zielzellkolonie löst sich vom Hydrogel und (iii) eine zweite, darunter liegende Kolonie wird während der Lichtexposition unter der Zielkolonie beobachtet. Diese Kolonie wird ebenfalls entfernt, was zu einer Kreuzkontamination führt. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung von Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Angesichts der möglichen Schädigung von Bakterien mit UV-Licht wurde die Wirkung verschiedener UV-Licht-Mikromuster auf die Zelllebensfähigkeit anhand von Modell, Gram-positiven Bakterien (B. subtilis) und Modell, Gram-negativen Bakterien (E. coli) weiter untersucht. Jedes wurde in Bulk-Hydrogelen eingekapselt und nach Standardprotokollen in mikroskalige Kolonien kultiviert, um ihre Kompatibilität mit dem Hydrogel zu überprüfen. Gezielte Mikrokolonien äquivalenter Größe (26 ± 1 μm Durchmesser) wurden dann einer konstanten Lichtdosis (168 mJ/mm2)ausgesetzt, entweder in Form von Kreismustern, die ganze Mikrokolonien UV-Licht aussetzen, oder Kreuzmustern, die nur Hydrogelkanten abbauen, um die Lichtexposition der Zellen zu minimieren. Die Zellen wurden dann geborgen und plattiert, um die aus jeder Kolonie gewonnene KBE / ml zu quantifizieren. Es wurde kein signifikanter Unterschied im Zellwiederherstellungsniveau gefunden (Abbildung 6A). Um die Reinheit der extrahierten Zellen weiter zu untersuchen, wurde DNA aus E. coli-Proben extrahiert und mit einem UV-Vis-Spektralphotometer analysiert. Für beide Muster liegen die DNA-Qualitätsniveaus in einem A260/ A280-Bereich zwischen 1,8 und 2,0 (Abbildung 6B), der im idealen Bereich für die genomische Sequenzierung25 liegt. Dies zeigt, dass die UV-Muster, die für die Freisetzung unter den beschriebenen Bedingungen verwendet werden, nur minimale Auswirkungen auf die Quantität lebensfähiger Zellen haben, die aus den Bulk-Hydrogelen gewonnen werden, oder auf die genomische DNA-Qualität nach der Extraktion.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig06.jpg"> Abbildung 6: Einfluss unterschiedlicher Lichtexpositionsmuster auf die Zelllebensfähigkeit und DNA-Qualität von Bakterien, die aus Bulk-Hydrogelen freigesetzt werden. (A) Zellwiederherstellungswerte für E. coli und B. subtilis nach Extraktion unter Verwendung von Kreuzmustern und Kreismustern. Für dieses Experiment wurde eine Extraktion aus kugelförmigen Kolonien mit dem gleichen Durchmesser (26 μm ± 1 μm) durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Anzahl der freigesetzten Zellen aus jeder Kolonie gleichwertig war. Die extrahierten Lösungen wurden dann plattiert, um die aus jedem Muster gewonnene KBE/ ml zu berechnen. Die statistische Analyse zeigte keinen signifikanten Unterschied in der KBE/ml, die aus Kreuz- und Kreismustern sowohl für E. coli als auch für B. subtilis erhalten wurde (P-Wert > 0,05, n= 6 für beide Stämme). (B) Spektralphotometrische Quantifizierung der DNA-Qualität für isolierte E. coli-Zellen unter Verwendung von Kreuz- und Kreismustern. Hier zeigte die statistische Analyse keinen signifikanten Unterschied in der DNA-Qualität für die verwendeten Muster (P-Wert > 0,05, n = 6) (C) Hellfeldbilder von Kolonien mit gleichen Durchmessern, die Kreuz- und Kreismustern ausgesetzt waren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Microwell-Arrays bieten eine alternative Lab-on-a-Chip-Screening-Schnittstelle, die im Vergleich zu Bulk-Hydrogelen kontrolliertere Screening-Funktionen bietet. Zum Beispiel ermöglichen Microwell-Arrays die Aussaat von Bakterien in diskrete Kulturstellen, an denen die Anzahl der Zellen im Inokulum kontrolliert werden kann. Geometrische Merkmale von Mikrobohrungen wie Bohrlochtiefe und -durchmesser werden ebenfalls durch Standard-Mikrofabrikationsmethoden gesteuert. Mit diesen Vorteilen waren Mikrobohrungen nützlich für die Untersuchung des Bakterienwachstums unter räumlichem Einschluss26und zuletzt für die Entdeckung symbiotischer und antagonistischer Interaktionen zwischen verschiedenen Bakterienarten, wenn sie zusammen auf der Mikroskala18eingeschlossen sind. Die zelluläre Extraktion aus Vertiefungen für die genomische Analyse wie die 16S-Amplikonsequenzierung ist für diese Anwendungen von entscheidender Bedeutung. Mit dem gleichen Hydrogel-Material kann UV-Licht über einem Brunnen belichtet werden, der Zellen von Interesse enthält, entweder als Kreis- oderRingmuster. Letzteres sorgt für den Hydrogelabbau nur am Mikrotiterraumumfang, um eine direkte Bestrahlung der Zellen zu verhindern. Um dies zu demonstrieren, wurden A. tumefaciens-Zellen, die mCherry exprimieren, in Vertiefungen ausgesät, das Hydrogel wurde dann an das Mikrotiterchen-Array gebunden. Zellen wurden kultiviert und dann entweder mit Kreis- oder Ringmustern bestrahlt. Die Membran wurde dann mit Fluorescein-5-Maleimid-Farbstoff angefärbt. Zweifarbige Fluoreszenzbilder zeigten, dass sowohl die Membran als auch die Zellen innerhalb der Vertiefungen für beide Bestrahlungsmuster entfernt werden17. Im Gegensatz zum Bulk-Hydrogel-Format wurde die Zellextraktion hier nur in Form von Zellclusternbeobachtet 18.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig07.jpg"> Abbildung 7: Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder, die den Einfluss von Lichtmustern auf die Zellisolation von Mikrotiterplattenarrays zeigen. (A) Mikrotiterwerke mit Durchmessern von 40 μm, die Bakterien (rot) nach aussaat und kultiviert enthalten. (B) Lichtbelichtung mit Kreis- und Ringmustern (blau). (C) Verminderte rote Fluoreszenz zeigt, dass Zellen aus bestrahlten Vertiefungen extrahiert werden. (D) Zweifarbiges Fluoreszenzbild von Membranen und Bakterien nach Bestrahlung, das die Entfernung sowohl des Hydrogels (grün) als auch der Bakterien (rot) aus den Zielbohrlöchern anzeigt. (E) Z-Stack, zweifarbiges Fluoreszenzbild von Zieltöpfen. Die rote Linie in (D) bezeichnet die in (E) abgebildete xz-Ebene und die grüne Linie in (E) die in (D) abgebildete xy-Ebene . Proben in Bildern (C-E) wurden gewaschen, um freigesetzte Zellen zu entfernen, dann fixiert und abgebildet. Maßstabsleiste = 40 μm. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung von van der Vlies et al.17. Copyright 2019 American Chemical Soceity. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um die Lebensfähigkeit von Bakterienzellen und die DNA-Qualität nach der Extraktion in diesem Format zu quantifizieren, wurden B. subtilis- und E. coli-Zellen ausgesät, kultiviert und dann aus Mikrotiterplatten-Arrays unter Verwendung von Kreis- und Ringmustern freigesetzt(Abbildung 8A, B). Freigesetzte Zellen wurden dann auf ATGN-Agarplatten plattiert und die DNA-Qualität der extrahierten Zellen wurde quantifiziert. Um sicherzustellen, dass bei jeder Extraktion eine konsistente Anzahl von Zellen vorhanden war, wurden Mikrobohrungen mit ähnlichen fluoreszierenden Intensitäten (~ 6000 A.E.) und damit eine ähnliche Anzahl von Zellen zur Freisetzung anvisiert. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen, die unter Verwendung eines Kreismusters extrahiert wurden, unterschied sich nicht signifikant von der Anzahl der lebensfähigen Zellen, die unter Verwendung eines Ringmusters für beide Bakterien extrahiert wurden (Abbildung 8C). Auch die DNA-Qualitätsniveaus unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Kreis- und Ringmustern für beide Bakterien (Abbildung 8D). Ähnlich wie bei Befunden in Bulk-Hydrogelen hatte die Anwendung von UV-Licht in der hier angegebenen Intensität und Dauer einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Lebensfähigkeit und DNA-Qualität von Zellen, die aus den Mikrotiterplatten-Arrays extrahiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass lebensfähige Bakterienzellen selektiv und mit minimalem Schaden aus Mikrotitertöpfen für die nachgeschaltete Analyse entnommen werden können.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig08.jpg"> Abbildung 8:Einfluss verschiedener Lichtexpositionsmuster auf die Zelllebensfähigkeit und DNA-Qualität von Bakterien, die aus Mikrotiterplatten-Arrays freigesetzt werden. (A,B) Sowohl für E. coli als auch für B. subtiliswurden Kreismuster und Ringmuster für die Zellextraktion aus 10 μm Mikrotiterlöchern verwendet. Kreismuster mit einem Durchmesser von 10 μm und Ringmuster mit einem Innendurchmesser von 10 μm und einem Außendurchmesser von 20 μm wurden in diesem Experiment zur Zellextraktion verwendet. Mikrotiterwerke mit den gleichen Durchmessern wurden verwendet, um sicherzustellen, dass die Anzahl der freigesetzten Zellen aus jedem Mikrobohrloch gleich war. (C) Die extrahierten Lösungen wurden dann plattiert, um die aus jedem Expositionsmuster gewonnene KBE/ml zu berechnen. Die statistische Analyse zeigte keinen signifikanten Unterschied in der KBE/ml aus Kreis- und Ringmuster sowohl für E. coli als auch für B. subtilis (P-Wert > 0,05, n = 6 für beide Stämme). (D) Die Spektrophotometrie wurde verwendet, um die DNA-Qualität von E. coli- und B. subtilis-Zellen anhand von Kreis- und Ringmustern zu messen. Hier zeigte die statistische Analyse keinen signifikanten Unterschied in der DNA-Qualität für die verwendeten Muster (P-Wert > 0,05, n = 6 für beide Stämme). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Design und Herstellung von Microwell-Arrays. (A) Standard-Mikrofabrikationstechniken wurden angewendet, um Mikrowellen-Arrays auf Siliziumwafern herzustellen. (B) Jedes Substrat bestand aus 7 x 7 Arrays von Vertiefungen mit einem Durchmesser von 10 μm mit einer Tiefe von 20 μm und einem Pitch von 30 μm. (C) Jedes Array bestand aus 225 Mikrobohrungen. Diese Zahl wurde von Barua et al.18modifiziert. Urheberrecht 2021 Frontiers Media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Die Verwendung von photoabbaubaren Hydrogelen zur Isolierung von Bakterienzellen unter Verwendung eines hochauflösenden Lichtmusterwerkzeugs wird berichtet. Wesentliche experimentelle Verfahren, Ergebnisse und Vorteile des Verfahrens werden überprüft. Die Methode ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Isolierung von Zielbakterien mit seltenen oder einzigartigen Funktionen aus heterogenen Gemeinschaften oder Populationen.

Photodegradierbare Hydrogel-Grenzflächen für Bakterienscreening, -selektion und -isolierung

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Zellen schnell von Screening-Schnittstellen für die genomische Charakterisierung zu isolieren, und diese Fähigkeit ist von Bedeutung, da es makroskopisch beobachtbare Zellmerkmale mit genomischen Informationen kombinieren kann. Die anvisierten Bakterienzellen aus den Screening-Grenzflächen können mit dieser Technik auf operationell einfache Weise mit hoher räumlicher Position isoliert werden. Die Hydrogele können in anderen Siebschnittstellen implementiert werden.Das Hydrogel-Material kann leicht in mikrofluidische Kanäle eingebaut werden, um Auf-Abruf von Zellen aus mikrofluidischen Geräten auf Abruf zu ermöglichen. Beginnen Sie mit der Impfung des Vernetzungspuffers mit der gewünschten Zelldichte. Bereiten Sie die Hydrogel-Vorläuferlösung in einem 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen vor, indem Sie 12,5 Mikroliter des Vernetzungspuffers und 5,6 Mikroliter PEG ONB-Diacrylatlösung hinzufügen.Und schließlich fügen Sie 6,9 Mikroliter Unterarm-PEG-Thiollösung zu der Mischung hinzu. Für die Zellverkapselung in der Hydrogel-Vorläuferlösung legen Sie die thiolierten Basis-Deckgläser auf eine saubere Petrischale und positionieren zwei Abstandshalter auf den beiden gegenüberliegenden Seiten des Deckglases. Befestigen Sie die Abstandshalter auf dem Bodendeckglas, indem Sie die Abstandshalter an die Petrischale kleben.Nach Zugabe des gewünschten Volumens der Vorläuferlösung auf einem nicht reaktiven perfluoralkylierten Glasobjektträger den Objektträger auf den Bodendeckglas legen und die Hydrogelbildung bei Raumtemperatur 25 Minuten abschließen lassen. Sobald die Gelierung abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig den perfluoralkylierten Glasobjektträger. Legen Sie das Substrat in die 60 mal 15 Millimeter große Petrischale mit ATGN-Medien, die mit einem Antibiotikum ergänzt werden.Säen Sie 700 Mikroliter bakterielle Zellsuspensionen mit OD 600 von 0,1 über das Microwell-Array-Substrat und stellen Sie die Hydrogel-Vorläuferlösung her, wie zuvor unter Verwendung von 12,5 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung ATGN von pH acht gezeigt. 12,5 Mikroliter der Vorläuferlösung werden auf einem nicht reaktiven perfluoralkylierten Glasobjektträger pipettiert und zwei 38 Mikrometer große Stahlabstandhalter auf zwei gegenüberliegenden Seiten des mit Zellen innokulierten Mikrotiterfeld-Array-Substrats platziert. Dann den perfluoralkylierten Glasobjektträger mit dem Vorläuferlösungströpfchen invertieren und ein Tröpfchen in die Mitte des Mikrotitergutsubstrats legen.Wenn das Hydrogel nach einer Inkubation von 25 Minuten bei Raumtemperatur gebildet wird, entfernen Sie den Glasobjektträger vorsichtig vom Mikrotitergutsubstrat und legen Sie das Substrat in eine Petrischale mit ATGN-Medien, die mit Antibiotika ergänzt sind. Legen Sie die Probe in einen PDMS-Halter und fügen Sie das definierte Medium auf die Probe auf, um eine Austrocknung der Probe zu verhindern und eine Trägerlösung für freigesetzte Zellen bereitzustellen. Nachdem Sie den Kalibrierspiegel in Position gebracht haben, stellen Sie den Mikroskopfokus ein, um ein scharfes Bild der Kolonien innerhalb des Hydrogel- oder Mikrotiterrohrarrays zu erhalten, und inspizieren Sie, um Kolonien oder Vertiefungen von Interesse zu identifizieren.Entwerfen Sie hier die Lichtmuster, während die Kameraansicht die Kolonien in der Probe zeigt, um verschiedene Muster für die Zellextraktion zu testen und das definierte Muster zu speichern. Wählen Sie dann den Abschnitt Sitzungssteuerung aus und fügen Sie die gespeicherte Sequenz unter der Registerkarte mit dem Produktnamen des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs hinzu. Wählen Sie die Option zum Stimulieren des Musters, um die gewünschte Belichtungsposition anzuzeigen und anzupassen.Stellen Sie als Nächstes die Lichtintensität auf 60% und die Belichtungszeit auf 40 Sekunden unter der LED-Steuerregisterkarte ein und starten Sie den Belichtungsprozess. Überwachen Sie den Hydrogelabbau in Echtzeit und im Brightfield-Modus, um die Zellfreisetzung sicherzustellen. Um die freigesetzte Zelle zu sammeln, ändern Sie den Mikroskopfilter von Brightfield auf TRITC, um den exponierten Bereich der Probe mit bloßem Auge sichtbar zu machen.Sobald der exponierte Bereich lokalisiert ist, platzieren Sie das Ende des Schlauches auf der bestrahlten Stelle und ändern Sie dann den Mikroskopfilter zurück in Brightfield, um den Zellabruf in Echtzeit zu überwachen. Verwenden Sie die Spritze, die am anderen Ende des Schlauches befestigt ist, um vorsichtig 200 Mikroliter Lösung mit den freigesetzten Zellen zu entnehmen und die Lösung zur DNA-Analyse oder Beschichtung in ein 1,5-Millimeter-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Für die Zellextraktion aus Bulk-Hydrogelen wurden unterschiedliche UV-Licht-Mikromuster verwendet, die die Morphologie der freigesetzten Zellen beeinflussten.Die UV-Exposition in einem Ringmuster führte zur Freisetzung der gesamten Kolonie, die in einem schützenden PEG-Hydrogel eingekapselt war. Im Gegensatz dazu könnten Zellen durch die Exposition eines Teils oder der gesamten Kolonie gegenüber UV-Licht entweder als aggregierte Zellcluster oder als freie Einzelzellen extrahiert werden. Die Zellaussaatdichte und -dicke des Hydrogels sind wichtig für die Zellverkapselung.Die dünneren Hydrogele führten zu Mikrokolonien mit minimaler Kolonieüberlappung, während die Hydrogele mit erhöhter Dicke zu überlappenden Kolonien führten, was zur Extraktion mehrerer Kolonien führen könnte. Überlappende Kolonien können während der Extraktion aufgrund der zweidimensionalen Natur des Lichtmusters zu einer Kreuzkontamination führen. Wenn eine Top-Kolonie ins Visier genommen wurde, wurde auch die darunter liegende Kolonie mit ihr extrahiert.Die Wirkung unterschiedlicher UV-Licht-Mikromuster auf die Zelllebensfähigkeit wurde ebenfalls bewertet. Wenn Mikrokolonien kontrollierten Dosen von UV-Licht entweder in einem kreisförmigen oder kreuzförmigen Muster ausgesetzt wurden, wurden die Zellwiederherstellung und die DNA-Reinheit nicht beeinflusst. Die Zellen wurden mit diesem Ansatz erfolgreich aus Mikrotiterplatten-Arrays gewonnen, was aus den repräsentativen konfokalen Mikroskopiebildern hervorging, wobei bei Bestrahlung im Kreis- und Ringmuster die Zellen im jeweiligen Muster entfernt wurden.Nach der Extraktion aus Microwell-Arrays wurden die Zelllebensfähigkeit und die DNA-Menge bewertet. Die Expositionsmuster beeinflussten weder die Anzahl der lebensfähigen Zellen noch die DNA-Qualität, was darauf hindeutet, dass lebensfähige Bakterienzellen selektiv aus Mikrobohrungen mit minimalem Schaden entnommen werden konnten und ihre DNA mit hoher Reinheit für die nachgeschaltete genomische Analyse isoliert werden konnte. Überprüfen Sie immer, ob sich das Hydrogel gebildet hat, bevor Sie den perfluoralkylierten Deckglas entfernen.Präzision und Sorgfalt sind erforderlich, um die Abstandhalter für die Hydrogelabscheidung zu platzieren und die Schläuche für die Extraktion von Zellen zu verwenden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele zur Entkopplung der Auswirkungen von Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Forschung

Biotechnik

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradient Stamm Chip für anregende zellulären Verhaltensweisen in Zelle beladenen Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Anwendungen für Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Hydrogel-Arrays ermöglichen erhöhten Durchsatz für Screening-Effekte von Matrixkomponenten und Therapeutika in 3D-Tumormodellen

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

Isolierung von Gentherapievektoren der nächsten Generation durch Engineering, Barcoding und Screening von Kapsidvarianten des Adeno-assoziierten Virus (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...