Name: photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av NSF CAREER Award #1944791.

<ol>
	<li>Welch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+single+cell+isolation+for+genomics+using+microraft+arrays.">Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).</li><li>Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. K., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+high-throughput+screening+of+small+mutant+libraries.">A microfluidic platform for high-throughput screening of small mutant libraries.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5234-5242 (2016).</li><li>Ishii, S., Tago, K., Senoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+and+isolation+for+microbiology+and+biotechnology:+Methods+and+applications.">Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1281-1292 (2010).</li><li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ichip+for+high-throughput+in+situ+cultivation+of+“uncultivable+microbial+species”.">Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of “uncultivable microbial species”.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Zhao, X., Zhong, J., Wei, C., Lin, C. W., Ding, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+viable+but+nonculturable+state+in+foodborne+pathogens.">Current perspectives on viable but nonculturable state in foodborne pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 580 (2017).</li><li>Wang, X., Gou, X., Chen, S., Yan, X., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+manipulation+tool+with+combined+microwell+array+and+optical+tweezers+for+cell+isolation+and+deposition.">Cell manipulation tool with combined microwell array and optical tweezers for cell isolation and deposition.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 23 (7), 075006 (2013).</li><li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Poonlapdecha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-conjugated+ferromagnetic+nanoparticles+with+lateral+flow+test+strip+assay+for+rapid+detection+of+Campylobacter+jejuni+in+poultry+samples.">Antibody-conjugated ferromagnetic nanoparticles with lateral flow test strip assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in poultry samples.</a> International Journal of Food Microbiology. 286, 6-14 (2018).</li><li>Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomagnetic+separation:+An+effective+pretreatment+technology+for+isolation+and+enrichment+in+food+microorganisms+detection.">Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).</li><li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+Single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+flow+cytometry:+The+role+of+microfabrication+methodologies,+performance+and+functional+specification.">Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification.</a> Technology. 06 (01), 1-23 (2018).</li><li>Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+and+microbial+engineering.">Microfluidics and microbial engineering.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 432-446 (2016).</li><li>Kehe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+screening+of+synthetic+microbial+communities.">Massively parallel screening of synthetic microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12804-12809 (2019).</li><li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+degradation+of+chain+and+step-polymerized+photodegradable+hydrogels.">Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels.</a> Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties.">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li><li>Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+demand+release+and+retrieval+of+bacteria+from+microwell+arrays+using+photodegradable+hydrogel+membranes.">On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).</li><li>Barua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+discovery+of+positive+and+negative+interactions+among+root+microbiome+bacteria+using+microwell+recovery+arrays.">Simultaneous discovery of positive and negative interactions among root microbiome bacteria using microwell recovery arrays.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 3361 (2021).</li><li>Fattahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+rapid+screening,+isolation,+and+genetic+characterization+of+bacteria+with+rare+phenotypes.">Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes.</a> Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+copatterning+strategies+using+azlactone-based+block+copolymers.">Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabricating+reactive+surfaces+with+brush-like+and+crosslinked+films+of+azlactone-functionalized+block+co-polymers.">Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562 (2018).</li><li>Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+tracking+of+microbial+community+development+within+a+microwell+array+platform.">Assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55701 (2017).</li><li>. DNeasy Blood &amp; Tissue Handbook - QIAGEN Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en</a> (2021)</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+Maleimide-Thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+modified+salt-out+method+for+DNA+extraction+from+whole+blood+lymphocytes:+A+simple+and+economical+method+for+gene+polymorphism.">Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism.</a> Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28 (2018).</li><li>Hansen, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+of+bacteria+in+microwell+arrays+reveals+the+importance+of+confinement+in+community+development.">Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development.</a> PLoS One. 11 (5), 0155080 (2016).</li><li>Halsted, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transparent+microwell+arrays+for+optical+monitoring+and+dissection+of+microbial+communities.">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).</li><li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Hydrogel+Interactions+in+Tissue+Engineering:+Mechanisms+and+Applications.">Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160 (2013).</li><li>Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+interactions+between+bacteria+and+hydrogels.">Mechanical interactions between bacteria and hydrogels.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10893 (2018).</li></ol>

RRH og AJV har innlevert patent på denne teknologien. De resterende forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Dette manuskriptet demonstrerer bruk av foto nedbrytbare hydrogeler for bakteriescreening og isolasjon. Materialet og tilnærmingen muliggjør høy gjennomstrømningskultur, kontroll over vekstmedier og vekstforhold, og ren og presis celleutvinning på en enkel og kostnadseffektiv måte. Ekstraksjon krever bare et fluorescerende mikroskop kombinert med det mønstrede belysningsverktøyet og kan gjøres på en sekvensiell måte for å isolere flere cellemål. Hver utvinning tar 5-10 min å utføre, og opptil 30 målrettede kolonier er fjernet fra en enkelt hydrogel. En viktig fordel med tilnærmingen er tilpasningsevnen til en rekke forskjellige analyseformater, som vist her med screening fra både bulk hydrogeler og mikrowell arrays. Separasjonsprosessen i begge formatene har blitt brukt til å isolere bakterier som viser unik vekstatferd for nedstrøms genotyping etter kultur og mikroskopisk observasjon, en kritisk evne til å koble cellegenotype til fenotype. Til dags dato har genomiske karakteriseringer av bakterier hentet fra disse grensesnittene inkludert 16S ampliconsekvensering for å identifisere flerartssamlinger av bakterier fra miljømikrobiomer som genererer fremvoksende vekstatferd18, og for helgenomsekvensering for å identifisere genetiske mutasjoner som forårsaker sjeldne vekstprofiler i celler som er tilstede i mutante biblioteker19.
Å bruke bulk hydrogeler for cellescreening og isolasjon er det mest enkle og enkle formatet. Bulk foto nedbrytbare hydrogeler dannes raskt (25 min) etter blanding av forløperne over gjennomsiktige glassdeksler for å innkapsle celler i en 3D-cellekulturmatrise som er avbildet med et standard oppreist eller invertert fluorescensmikroskop. Metoden har dermed potensial til å være translasjonell til vanlige mikrobiologiske laboratorier som ikke har mikrofabrikasjonsressurser eller kompetanse. En ulempe med dette formatet er at cellene er tilfeldig orientert gjennom den tredimensjonale hydrogelen. Derfor kan celler vises ut av fokusplanet når avbildning med høyere forstørrelsesmål og ekstraksjon kan være vanskelig hvis cellekolonier er orientert for nær hverandre, eller hvis det er et vertikalt overlegg av kolonier. Deponering av en tynn hydrogel (<13 μm) som beskrevet er avgjørende for å redusere denne ulempen. Eksponering i ødelagte krysslysmønstre (Figur 4B) er å foretrekke her, da dette mønsteret resulterer i celler fri for hydrogelen som har minimal eksponering for UV-lys og lett kan gjenvinnes gjennom plating.
I motsetning gir microwell-matriseformatet et mer godt kontrollert grensesnitt, da bakterieceller er partisjonert i diskrete mikrowells som tjener som små kultur- eller samkultursteder17,18,26. Microwell-dimensjon, tonehøyde og tetthet fremstilles nøyaktig ved hjelp av standard fotolittografiske teknikker. Sammenlignet med bulk hydrogeler, kan bakterier ekstraheres fra mikrowell arrayer med høyere grad av spesifisitet og lavere sjanse for krysskontaminering, da cellene bare er til stede på forhåndsdefinerte steder, ikke tilfeldig spredt over hele hydrogelen. Konsentrasjonen og forholdet mellom bakterieceller i såingsløsningen kan også varieres for å kontrollere mengden og sammensetningen av mikrowell inoculum gjennom en såingsprosess som har blitt karakterisert i tidligere rapporter26, noe som gir brukeren fleksibilitet i skjermens eksperimentelle design. Den primære ulempen ved screening med microwell array-formatet er den ekstra tiden og ekspertisen som kreves for mikrofabrikasjon. Fabrikasjon av mikrowells ble estimert til å koste ~ $ 10 per matrise, som inkluderer materialkostnader og renromsutgifter. I tillegg er mikrowells matriser tradisjonelt laget av silisium, noe som kan forårsake avbildningsvansker siden substratene ikke er gjennomsiktige. Videre kan en høy mengde lysspredning fra silisiumoverflaten begrense bildebehandlingen i mikrowells og kan redusere mønsteroppløsningen under hydrogeleksponering med UV-lys fra det mønstrede belysningsverktøyet (sett i figur 8A,B). Lignende mikrowells har blitt fremstilt på gjennomsiktige kvartssubstrater for å adressere denne typen begrensninger27; Denne fabrikasjonen er imidlertid betydelig vanskeligere. Eksponering for ringmønstre som lyser opp omkretsen av brønnen, er å foretrekke her for å frigjøre friplasser fra brønnene samtidig som UV-eksponering minimeres.
Det vanligste problemet som oppstår i begge format er løsrivelse av hydrogelen fra det underliggende substratet under kultur på grunn av hydrogel hevelse. Hvis dette er et problem for bulkhydrgeler, bør tilstedeværelsen, tettheten og ensartetheten til tiolgrupper i det kjemiske (MTPS) festelaget over overflaten av glassdekslene verifiseres ved hjelp av en passende overflatekarakteriseringsteknikk (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Lave tettheter av overflatetiolgrupper på grunn av ineffektiv overflatefunksjonalisering kan føre til en svak interaksjon mellom substratet og hydrogelen. Hvis det oppstår et lavt nivå av overflatetiolasjon, bør stabiliteten til MTPS-løsningen kontrolleres. Det må utvises forsiktighet ved første rengjøring av glasssklie for å sikre en ren overflate før MTPS-behandling, og det må utvises forsiktighet for å sikre bruk av vannfri toluen under MTPS overflatereaksjon (protokoll avsnitt 4). Når det gjelder mikrowellmatriser, blir overflater ikke thiolated, og hydrogeler festes i stedet gjennom delvis fylling av brønnene med hydrogelen, som forankrer hydrogelen til silisiumsubstratet17. Hvis hydrogelavløsning er et problem i dette systemet, kan flere mikrowells eller andre mikroskalafunksjoner etses inn i matrisen for ytterligere å forankre hydrogelen til substratet for å fremme sterkere vedlegg.
En begrensning av teknikken i begge formatene er hydrogelenes begrensede stabilitet i nærvær av bakterier. Det har blitt bemerket at noen bakterier, som A. tumefaciens, kan forringe hydrogelen i løpet av 5-7 dager17,19, noe som begrenser eksperimenttiden. Nåværende undersøkelse av mekanismene for bakteriell nedbrytning er i gang; Det er hypoteset at estergruppene som er tilstede fra diakrylatmonomene, er utsatt for bakteriemediert hydrolyse og/eller enzymatisk nedbrytning, som nevnt i andre systemer17. Å utvikle mer stabile hydrogelkjemier vil forlenge tiden bakterier kan forbli i hydrogelen og vil utvide skjermen til mikroorganismer med lavere vekstrater. En annen begrensning er at i begge formater forekommer cellegjenoppretting og ekstraksjon i et åpent miljø, noe som resulterer i relativt høye ekstraksjonsvolumer (30-100 μL), som kan være utsatt for forurensning utenfra. Dermed må det tas hensyn til at nok celler er til stede fra målkoloniene samtidig som ekstraksjonsløsningsvolumet minimeres. For å oppnå nok celler til plating og utvinning eller for utvinning av DNA-materiale, ble det observert at i bulk hydrogeler må celler dyrkes lenge nok til å nå kolonidiametre på minst 10 μm. For å senke det nødvendige volumet for celleutvinning ble det observert at bruk av en mikrolitersprøyte og rør (figur 2) var mer effektivt enn pipettering. Slangen gjorde det mulig å trekke isolasjonene mer nøyaktig fra utløserpunktet, noe som krevde mindre løsningsvolum og reduserte sjansen for forurensning.
Fremtidig arbeid innebærer å forstå effekten av hydrogel mekaniske egenskaper på cellevekst, da mekaniske egenskaper ved disse hydrogelene er godt kontrollert av valg av passende PEG-baserte monomerforløpere av ulike molekylvekter28, og mekaniske interaksjoner spiller sannsynligvis en viktig rolle i bakterieadferd29. Siden hydrogelmaterialene lett kan innlemmes i en rekke forskjellige systemer og enheter, er videreutvikling også fokusert på integrering av dette materialet i mikrofluidiske systemer. Dette vil redusere utvinningsløsningen til femtoliter til picoliter-volumer, sammenlignet med tradisjonelle 30-100 μL volumer som for tiden kreves i det åpne samlingsformatet. Mindre løsningsvolumer vil i stor grad redusere potensiell forurensning og flytte tilnærmingen til encellet isolasjon og karakterisering.

Isolering av celler med unik oppførsel fra et komplekst og heterogent miljø er grunnleggende for å skaffe genetisk informasjon i biologi1. I mikrobiologi blir valg og isolering av sjeldne eller unike mikrober etter observasjon viktig i mange applikasjoner som krever en sammenheng mellom genomisk informasjon og observerbar fenotypisk informasjon. Disse bruksområdene inkluderer valg av fenotypisk sjeldne stammer fra mutantbibliotekene2, valg av keystone-mikroorganismer fra komplekse mikrobielle samfunn3,4og valg av fenotypisk sjeldne, men viktige bakterier fra isogene populasjoner. Isolering av levedyktige, men ikke-culturable celler (VBNC) fra en bakteriepopulasjon er et viktig eksempel på sistnevnte, hvor celler med VBNC-fenotypen ofte er skjult i bakteriepopulasjoner ved 1:102 til 1:105 forhold5,6. På grunn av de utbredte vanskelighetene i bakterieisolasjon, er mye fortsatt ukjent om mange fenotypisk sjeldne mikroorganismer. Disse begrensningene understreker behovet for celleisolasjonsteknikker for først å identifisere målcellen eller -cellene fra en blanding og deretter hente og isolere dem for nedstrøms molekylær analyse7.
Noen av de mest etablerte metodene for celleisolasjon inkluderer strømningscytometri og fluorescerende aktivert cellesortering (FACS)8, immunomagnetisk separasjon9,10og mikrofluidikk11. Selv om disse isolasjonsmetodene har høy verdi, har de også ulemper som begrenser bruken av dem. FOR eksempel kan FACS gi rutinemessig mikrobiell isolasjon på encellet nivå for oppfølging genomisk analyse3, men er ofte begrenset av tilgjengelighet og utgifter, samt nedstrøms forurensningsproblemer11. Mikrofluidbaserte tilnærminger som mikrofluid strømningscytometri har fått mye oppmerksomhet, som sammenlignet med konvensjonell strømningscytometri gir en betydelig reduksjon i prøvevolumet som kreves12. Separasjon og gjenfinning av individuelle eller små samlinger av celler fra mikrofluidiske enheter er imidlertid ofte et utfordrende problem som vanligvis krever et mer komplekst oppsett og enhetsdesign13. Mange mikrofluidbaserte tilnærminger genetisk karakteriserer celler før de legges inn og observeres i en enhet14, og begrenser antall unike arter som observeres når de utfører en funksjonell skjerm. Gitt disse begrensningene, er det nødvendig med ytterligere innovasjon av både metoder og materialer som er praktiske for cellescreening og isolasjon for utbredt bruk i mange laboratorier.
Dette dokumentet presenterer en ny, materialbasert tilnærming for bakteriescreening og isolasjon. Metoden bruker foto nedbrytbare hydrogeler for celleinnkapsling, kultur, mikroskopisk observasjon og behovsbetinget frigjøring og gjenoppretting av målrettede bakterier med unike fenotyper. Hydrogeler er designet for å inneholde 10 nm maskestørrelse, hvor hver krysskobling inneholder o-nitrobenzyl gruppe15. Materialet innkapsler eller fanger celler for observasjon samtidig som diffusjon av næringsstoffer og avfallsprodukter kan spres til og fra celler for kultur. Å utsette materialet for en mønstret 365 nm UV-lyskilde gjennom et oppreist mikroskop muliggjør lokal nedbrytning av hydrogelen gjennom fotocleavage av o-nitrobenzyl gruppe16,17. Nedbrytning utløser selektiv frigjøring av celler for utvinning for nedstrømsanalyse, inkludert genomisk og potensielt proteomisk og transremisk analyse. Det eksperimentelle oppsettet og protokollen er relativt enkel, billig og translasjonell til mikrobiologiske laboratorier. Det krever bare celleinnkapsling gjennom hydrogeldannelse, observasjon av fangede celler med oppreist brightfield og fluorescensmikroskop, og belysning av celler av interesse med en mønstret UV-lyskilde for gjenfinning.
En viktig fordel med denne materialbaserte tilnærmingen til screening er tilpasningsevnen til forskjellige screeningformater. I sitt mest grunnleggende format kan materialet brukes til screening ved å innkapsle en heterogen cellesamling i bulkhydrgeler. Celler observeres deretter for ønsket fenotype, og individuelle celler av interesse fjernes for genomisk karakterisering. I mer forseggjorte formater kan materialet også integreres i lab-on-a-chip-enheter for å gi presis celleutløsning og gjenfinning fra ønskede områder av enheten. Begge formatene er beskrevet her, og begge har aktivert nyere nye mikrobielle screening- og utvalgsprogrammer17,18,19. Metoden er demonstrert her med modell Gram-negative organismer (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) og en modell Gram-positiv organisme (Bacillus subtilis) og har lett blitt utvidet til en rekke andre bakterier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>175617-25G</td>
			<td>&#62; 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox detergent powder</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>1104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Certified ACS Granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave SK300C</td>
			<td>Yamato Scientific</td>
			<td>18016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 1A1135</td>
			<td>Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td>1A1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield upright microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C614-500</td>
			<td>For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>0188-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: -30-60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: &#60; 32 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli ATCC 25922</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R19020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium microscope slides plain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td>Contains inhibitor, 30 wt% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incu-Shaker Mini</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>E5-0014-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 7-hydrate</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Avantor Performance Materials, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen, compressed</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)</td>
			<td>NOF America Corporation</td>
			<td>PTE-100SH</td>
			<td>Sunbright-PTE-100SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>K813-500ML</td>
			<td>Store between 15 &#176;C&#8211;30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon400</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>DSI-D-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>25 x 75 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>BioXtra, &#62; 98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505-250G</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#62; 99.0% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel thickness gage</td>
			<td>Precision Brand Products</td>
			<td>77739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-1L</td>
			<td>Anhydrous, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td>For microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FS-110H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation

Biologer har lenge forsøkt å forstå forholdet mellom fenotype og genotype. For bedre å forstå denne forbindelsen er det avgjørende å utvikle praktiske teknologier som kombinerer mikroskopisk cellescreening med celleisolasjon ved høy renhet for nedstrøms genetisk analyse. Her beskrives bruk av fotodegraderbare poly(etylenglykol) hydrogeler for screening og isolering av bakterier med unike vekstfenotyper fra heterogene cellepopulasjoner. Metoden er avhengig av å innkapsle eller fange celler med hydrogelen, etterfulgt av kultur, mikroskopisk screening, og deretter bruke et høyoppløselig lysmønsterverktøy for romlig kontroll av hydrogelforringelse og frigjøring av utvalgte celler til en løsning for gjenfinning. Bruk av forskjellige lysmønstre gir mulighet for kontroll over morfologien til den ekstraherte cellen, og mønstre som ringer eller kryss kan brukes til å hente celler med minimal direkte UV-lyseksponering for å redusere DNA-skade på isolasjonene. Videre gir lysmønsterverktøyet en justerbar lysdose for å oppnå ulike nedbrytnings- og celleutløsningshastigheter. Det gir forringelse ved høy oppløsning, noe som muliggjør celleuthenting med mikronskala romlig presisjon. Her demonstreres bruken av dette materialet for å screene og hente bakterier fra både bulkhydrgeler og mikrofabricated lab-on-a-chip-enheter. Metoden er billig, enkel og kan brukes til vanlige og nye anvendelser i mikrobiologi, inkludert isolering av bakteriestammer med sjeldne vekstprofiler fra mutante biblioteker og isolering av bakteriekonsortier med fremvoksende fenotyper for genomiske karakteriseringer.

For å undersøke UV-lysets evne til å utløse kontrollert hydrogelforringelse for cellefrigjøring, ble hydrogeler først innkapslet over tiolerte deksler uten bakterier til stede. Hver hydrogel ble utsatt for tre replikeringssirkelmønstre av lys ved forskjellige intensiteter og eksponeringstider. Prosentandelen gelforringelse ble beregnet etter UV-lyseksponering ved hver lysintensitet, og eksponeringstiden ble deretter kvantifisert ved kobling av anhengstiolgrupper med fluorescein-5-maelimidfargestoff for fluorescensavbildning19,24. Et representativt eksempel på hvordan disse to parametrene påvirker hydrogelforringelse, er vist i figur 3. Som tydelig gir mønstret lys fra det mønstrede belysningsverktøyet romlig-temporal kontroll av hydrogelforringelse ved en oppløsning som kan muliggjøre frigjøring av bare et lite antall celler.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig03.jpg"> Figur 3: Kontroll over hydrogelforringelse. UV-lysdose og resulterende hydrogelforringelseshastighet er justerbar via det mønstrede belysningsverktøyet. (Innsettt) To forskjellige lysintensiteter ble valgt for mønstret hydrogelforringelse. Etter 365 nm UV-lyseksponering ble hydrogeler merket med fluorescein-5-maleimid for fluorescensavbildning. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For celleuttrekking ble forskjellige lysmønstre brukt til å undersøke cellefrigjøring (figur 4). Her ble Agrobacteriumbakterieceller innkapslet i bulkhydrgeler over tiolerte glassdeksler, og deretter dyrket i mikroskalakolonier. Hydrogeler ble deretter inspisert i brightfield mikroskopi, og målrettede mikrokolonier ble utsatt for varierte UV-lysmønstre. Det ble observert at forskjellige eksponeringsmønstre påvirket morfologien til de frigjorte cellene. Dette er potensielt gunstig for ulike applikasjoner. For eksempel resulterer det i frigjøring av hele kolonien som fortsatt er innkapslet i en beskyttende PEG-hydrogel og uten direkte UV-lyseksponering (figur 4A), som kan bevare celler og gi enkel nedstrøms rensing. Ved å eksponere deler av eller hele kolonien for UV-lys kan celler derimot trekkes ut enten som aggregerte celleklynger (figur 4B) eller som frie, individuelle celler (figur 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig04.jpg"> Figur 4: Kontroll over morfologien til de ekstraherte cellene. (A) Bruk av et ringmønster for å frigjøre hele cellekolonien, beskyttet i en PEG-matrise. (B) Bruk av et brutt kryssmønster for celleutløsing i aggregater. (C) Bruk av et kryssmønster for å frigjøre enkeltceller. Reprinted (tilpasset) med tillatelse fra Fattahi et al.19 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Kritisk i innkapslingsprotokollen er både cellefrøtettheten og tykkelsen på hydrogelen, da begge disse parametrene kan påvirke antall celler innlemmet i hydrogelen for observasjon. For å demonstrere ble A. tumefaciens celleprøver innkapslet i hydrogeler av to forskjellige tykkelser ved hjelp av tynne avstandsstykker (12,7 μm) eller tykke avstandsstykker (40 μm) dyrket, og avbildet etter de etablerte protokollene. Tynnere hydrogeler resulterte i en mikrokolonitetthet på 90 kolonier/mm2 i hele hydrogelen, der det ble observert minimal kolonioverlapping (figur 5A). I motsetning til dette resulterte hydrogeltykkelser større enn 12,7 μm i dannelsen av overlappende kolonier i vertikal retning (figur 5B), noe som kan føre til utvinning av flere kolonier. Overlappende kolonier kan forårsake krysskontaminering under ekstraksjon på grunn av lysmønsterets todimensjonale natur. For eksempel kan en toppkoloni målrettes, mens en underliggende koloni også ekstraheres med den (Figur 5C). Derfor anbefales bruk av 12,7 μm avstandsstykker for hydrogelpreparat.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig05.jpg"> Figur 5: Hydrogeltykkelse påvirker ekstraksjonsrenheten. (A) Ved å bruke avstandsstykker med en tykkelse på 12,7 μm for hydrogeldannelse, dannes kolonier innenfor ett 10x fokalplan. (B) Overlegg av kolonier kan observeres ved 10x forstørrelse hvis avstandsstykker med større tykkelser enn 12,7 μm brukes. (C) Krysskontaminering kan oppstå med et overlegg av kolonier under celleutløsning: (i) et ringmønster brukes til å frigjøre en målrettet cellekoloni, (ii) den målrettede cellekolonien løsnes fra hydrogelen, og (iii) en andre underliggende koloni observeres under lyseksponeringen under den målrettede kolonien. Denne kolonien er også fjernet, noe som resulterer i krysskontaminering. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Gitt den potensielle skaden på bakterier med UV-lys, ble effekten av varierte UV-lysmikropatterner på celle levedyktighet videre studert ved hjelp av modell, Gram-positive bakterier (B. subtilis) og modell, Gram-negative bakterier (E. coli). Hver av dem ble innkapslet i bulkhydrgeler og dyrket i mikroskalakolonier i henhold til standardprotokoller, og bekreftet deres kompatibilitet med hydrogelen. Målrettede mikrokolonier av tilsvarende størrelse (26 ± 1 μm diameter) ble deretter utsatt for en konstant lysdose (168 mJ/mm2), enten i form av sirkelmønstre som utsetter hele mikrokolonier for UV-lys eller kryssmønstre som bare forringer hydrogelkanter for å minimere lyseksponering for celler. Celler ble deretter gjenvunnet og belagt for å kvantifisere CFU / ml gjenvunnet fra hver koloni. Fant ingen signifikant forskjell i cellegjenopprettingsnivå (figur 6A). For å undersøke renheten til de ekstraherte cellene ytterligere, ble DNA hentet fra E. coli-prøver og analysert ved hjelp av et UV-Vis spektrofotometer. For begge mønstrene faller DNA-kvalitetsnivåene innenfor et A260/A280-område mellom 1,8 og 2,0 (figur 6B), som er i det ideelle området for genomisk sekvensering25. Dette viser at UV-mønstrene som brukes til frigjøring under de beskrevne forholdene har minimal effekt på mengden levedyktige celler som utvinnes fra bulkhydrgelene eller på genomisk DNA-kvalitet etter utvinning.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig06.jpg"> Figur 6: Påvirkning av ulike lyseksponeringsmønstre på celle levedyktighet og DNA-kvalitet på bakterier frigjort fra bulk hydrogeler. (A) Cellegjenvinningsnivåer for både E. coli og B. subtilis etter utvinning ved hjelp av kryssmønstre og sirkelmønstre. For dette eksperimentet ble utvinning gjort fra sfæriske kolonier med samme diameter (26 μm ± 1 μm) for å sikre at antall frigjorte celler fra hver koloni var ekvivalent. De ekstraherte løsningene ble deretter belagt for å beregne CFU/ml som er anskaffet fra hvert mønster. Statistisk analyse viste ingen signifikant forskjell i CFU/ml hentet fra kryss- og sirkelmønstre for både E. coli og B. subtilis (P-verdi > 0,05, n= 6 for begge stammene). (B) Spektrofotometrisk kvantifisering av DNA-kvalitet for isolerte E. coli-celler ved hjelp av kryss- og sirkelmønstre. Her viste statistisk analyse ikke en signifikant forskjell i DNA-kvalitet for mønstrene som brukes (P-verdi > 0,05, n = 6) (C) Brightfield-bilder av kolonier med like diametre utsatt for kryss- og sirkelmønstre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Microwell-rekker gir et alternativt, lab-on-a-chip screening-grensesnitt som tilbyr mer kontrollerte screeningfunksjoner sammenlignet med bulkhydrgeler. For eksempel muliggjør mikrowellmatriser såing av bakterier til diskrete kultursteder der antall celler i inoculum kan kontrolleres. Geometriske egenskaper av mikrowells som brønndybde og diameter styres også gjennom standard mikrofabrikasjonsmetoder. Med disse fordelene har mikrowells vært nyttige for å studere bakterievekst under romlig innesperring26, og senest for oppdagelsen av symbiotiske og antagonistiske interaksjoner mellom forskjellige bakteriearter når de er begrenset sammen ved mikroskala18. Cellulær utvinning fra brønner for genomisk analyse som 16S amplicon sekvensering er avgjørende for disse bruksområdene. Ved hjelp av samme hydrogelmateriale kan UV-lys eksponeres over en brønn som inneholder celler av interesse, enten som sirkel- eller ringmønstre. Sistnevnte sikrer hydrogelforringelse bare ved mikrowell-omkretsen for å forhindre direkte bestråling av celler. For å demonstrere dette ble A. tumefaciens celler som uttrykker mCherry sådd inn i brønner, hydrogelen ble deretter festet til mikrowell-matrisen. Celler ble dyrket og deretter bestrålet med enten sirkel- eller ringmønstre. Membranen ble deretter farget med fluorescein-5-maleimidfargestoff. Tofargers fluorescensbilder viste at både membranen og cellene i brønnene fjernes for begge bestrålingsmønstrene17. I motsetning til bulk hydrogelformatet har celleutvinning her bare blitt observert i form av celleklynger18.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig07.jpg"> Figur 7: Representative konfiskeringsmikroskopibilder som viser lysmønsterpåvirkning på celleisolasjon fra mikrowellmatriser. (A) Mikrowells med diameter på 40 μm som inneholder bakterier (rød) etter sådd og kultur. (B) Lyseksponering ved hjelp av sirkel- og ringemønstre (blå). (C) Redusert rød fluorescens viser at celler ekstraheres fra bestrålede brønner. (D) Tofarget fluorescensbilde av membraner og bakterier etter bestråling, noe som indikerer fjerning av både hydrogel (grønn) og bakterier (rød) fra målbrønner. (E) Z-stack, tofarget fluorescensbilde av målbrønner. Den røde linjen i (D) angir xz-planet som er avbildet i (E), og den grønne linjen i (E) angir xy-planet som er avbildet i (D). Eksempler på bilder (C-E) ble vasket for fjerning av frigitte celler, deretter fast og avbildet. Skalastang = 40 μm. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra van der Vlies et al.17. Copyright 2019 Amerikansk kjemisk soceity. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For å kvantifisere bakterier celle levedyktighet og DNA-kvalitet etter utvinning i dette formatet, B. subtilis og E. coli celler ble sådd, dyrket, og deretter frigjort fra microwell arrays ved hjelp av sirkel og ring mønstre (Figur 8A, B). Frigjorte celler ble deretter belagt på ATGN agarplater, og DNA-kvaliteten på de ekstraherte cellene ble kvantifisert. For å sikre at et konsekvent antall celler var til stede under hver ekstraksjon, ble mikrowells med lignende fluorescerende intensiteter (~ 6000 a.U.) og derfor et lignende antall celler målrettet for frigjøring. Antall levedyktige celler som ble trukket ut ved hjelp av et sirkelmønster, var ikke signifikant forskjellig fra antall levedyktige celler som ble ekstrahert ved hjelp av ringmønster for begge bakteriene (Figur 8C). DNA-kvalitetsnivåene var heller ikke signifikant forskjellige mellom sirkel- og ringmønstrene for noen av bakteriene (Figur 8D). Derfor, i likhet med funn i bulkhydrgeler, hadde anvendelsen av UV-lys med den intensiteten og varigheten som er angitt her, en ubetydelig innvirkning på levedyktigheten og DNA-kvaliteten på celler hentet fra mikrowellmatrisene. Disse funnene viser at levedyktige bakterieceller selektivt kan hentes fra mikrowells med minimal skade for nedstrømsanalyse.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig08.jpg"> Figur 8: Påvirkning av ulike lyseksponeringsmønstre på celle levedyktighet og DNA-kvalitet på bakterier frigjort fra mikrowell arrays. (A,B) For både E. coli og B. subtilisble sirkelmønstre og ringmønstre brukt til celleutvinning fra 10 μm mikrowells. Sirkelmønster med en diameter på 10 μm og ringmønster med en indre diameter på 10 μm og ytre diameter på 20 μm ble brukt i dette eksperimentet for celleutvinning. Mikrowells med samme diameter ble brukt for å sikre at antall frigjorte celler fra hver mikrowell var det samme. (C) De ekstraherte løsningene ble deretter belagt for å beregne CFU/ml fra hvert eksponeringsmønster. Statistisk analyse viste ingen signifikant forskjell i CFU/ml hentet fra sirkel- og ringmønster for både E. coli og B. subtilis (P-verdi > 0,05, n = 6 for begge stammene). (D) Spektrofotometri ble brukt til å måle DNA-kvaliteten til både E. coli og B. subtilis celler ved hjelp av sirkel- og ringmønstre. Her viste statistisk analyse ingen signifikant forskjell i DNA-kvaliteten for mønstrene som ble brukt (P-verdi > 0,05, n = 6 for begge stammene). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplerende figur 1: Design og fabrikasjon av mikrowellmatriser. (A) Standard mikrofabrikasjonsteknikker ble brukt til å fremstille mikrowellmatriser på silisiumskiver. (B) Hvert underlag besto av 7 x 7 arrayer med 10μm diameter brønner med 20 μm dybde og 30 μm pitch. (C) Hver matrise besto av 225 mikrowells. Denne figuren er endret fra Barua et al.18. Opphavsrett 2021 Frontiers Media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Bruk av foto nedbrytbare hydrogeler for å isolere bakterieceller ved hjelp av et høyoppløselig lys patteringsverktøy rapporteres. Viktige eksperimentelle prosedyrer, resultater og fordeler ved prosessen gjennomgås. Metoden muliggjør rask og billig isolering av målrettede bakterier som viser sjeldne eller unike funksjoner fra heterogene samfunn eller populasjoner.

Foto nedbrytbare Hydrogel-grensesnitt for bakteriescreening, utvelgelse og isolasjon

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Denne protokollen er utformet for raskt å isolere celler fra screeninggrensesnitt for genomisk karakterisering, og denne funksjonen er betydelig fordi den kan kombinere makroskopisk observerbare cellefunksjoner med genomisk informasjon. De målrettede bakteriecellene fra screeninggrensesnittene kan isoleres med høy romlig posisjon på en operasjonelt enkel måte ved hjelp av denne teknikken. Hydrogelene kan implementeres i andre screeninggrensesnitt.Hydrogelmaterialet kan lett innlemmes i mikrofluidiske kanaler for behovsbetinget gjenfinning av celler fra mikrofluidiske enheter. Begynn med å inokulere krysskoblingsbufferen med ønsket celletetthet. Forbered hydrogelforløperløsningen i et mikrosenterrør på 0,5 milliliter ved å tilsette 12,5 mikroliter av krysskoblingsbufferen og 5,6 mikroliter PEG ONB diakrylatoppløsning.Og til slutt, tilsett 6,9 mikroliter underarm PEG tiol løsning til blandingen. For celleinnkapsling i hydrogelforløperløsningen, plasser de tiolerte basedekslene på en ren Petri-tallerken og plasser to avstandsstykker på de to motsatte sidene av dekslene. Fest avstandsstykkene på bunndekslene ved å teipe avstandsstykkene til Petri-parabolen.Etter å ha lagt til ønsket volum av forløperløsningen på en ikke-reaktiv perfluoroalkylert glasssklie, plasser lysbildet på bunndekslene og la hydrogelformasjonen fullføre ved romtemperatur i 25 minutter. Når gelasjonen er fullført, fjern forsiktig den perfluoroalkylaterte glasssklie. Plasser substratet i 60 med 15 millimeter Petri-tallerken som inneholder ATGN-medier supplert med antibiotika.Frø 700 mikroliter bakterielle celle suspensjoner med OD 600 av 0,1 over mikrowell array substratet og gjøre hydrogel forløper løsning som vist tidligere ved hjelp av 12,5 mikroliter fosfat bufret saltvann ATGN av pH åtte. Pipette 12,5 mikroliter av forløperløsningen på en ikke-reaktiv perfluoroalkylert glasssklie og plasser to 38 mikrometer stål avstandsstykker på to motsatte sider av mikrowell array substratet innokulert med celler. Snu deretter den perfluoroalkylaterte glasssklie med forløperløsningsdråpen og legg en dråpe midt i mikrowellsubstratet.Når hydrogelen dannes etter en inkubasjon på 25 minutter ved romtemperatur, fjern glasssklien forsiktig fra mikrowellsubstratet og legg substratet i en Petri-tallerken som inneholder ATGN-medier supplert med antibiotika. Plasser prøven i en PDMS-holder, og legg til det definerte mediet over eksemplet for å forhindre prøvedehydrering og gi en bærebølgeløsning for frigitte celler. Etter å ha fått kalibreringsspeilet på plass, juster mikroskopfokuset for å få et skarpt bilde av koloniene i hydrogel- eller mikrowellmatrisen og inspiser for å identifisere kolonier eller brønner av interesse.Her utformer du lysmønstrene mens kameravisningen viser koloniene i prøven for å teste forskjellige mønstre for celleuttrekking og lagre det definerte mønsteret. Velg deretter øktkontrolldelen, legg til den lagrede sekvensen under fanen med tittelen med produktnavnet for det mønstrede belysningsverktøyet. Velg alternativet for å stimulere mønsteret for å vise og justere ønsket eksponeringsplassering.Deretter justerer du lysintensiteten til 60 % og eksponeringstiden til 40 sekunder under LED-kontrollfanen og starter eksponeringsprosessen. Overvåk hydrogelforringelsen i sanntid og Brightfield-modus for å sikre celleutløsning. For å samle den frigjorte cellen, endre mikroskopfilteret fra Brightfield til TRITC for å visualisere det eksponerte området av prøven av det blotte øye.Når det eksponerte området er plassert, plasser enden av slangen på det bestrålede stedet, og bytt deretter mikroskopfilteret tilbake til Brightfield for å overvåke celleuthenting i sanntid. Bruk sprøyten som er festet til den andre enden av slangen for å forsiktig trekke ut 200 mikroliter oppløsning som inneholder de frigjorte cellene og overfør løsningen til et 1,5 millimeter sentrifugerør for DNA-analyse eller plating. Ulike UV-lysmikromønstre ble brukt til celleutvinning fra bulkhydrgeler, noe som påvirket morfologien til de frigjorte cellene.UV-eksponeringen i et ringmønster resulterte i frigjøring av hele kolonien innkapslet i en beskyttende PEG-hydrogel. Ved å eksponere deler av eller hele kolonien for UV-lys, kan celler derimot trekkes ut enten som aggregerte celleklynger eller som frie enkeltceller. Cellefrøtettheten og tykkelsen på hydrogelen er viktig for celleinnkapsling.De tynnere hydrogelene resulterte i mikrokolonier med minimal kolonioverlapping, mens hydrogelene med økt tykkelse resulterte i overlappende kolonier, noe som kan føre til utvinning av flere kolonier. Overlappende kolonier kan forårsake krysskontaminering under ekstraksjon på grunn av lysmønsterets todimensjonale natur. Da en toppkoloni ble målrettet, ble den underliggende kolonien også hentet ut med den.Effekten av varierte UV-lysmikromønstre på celle levedyktighet ble også vurdert. Når mikrokolonier ble utsatt for kontrollerte doser UV-lys i enten et sirkulært eller kryssmønster, ble ikke cellegjenoppretting og DNA-renhet påvirket. Cellene ble vellykket hentet fra mikrowell arrays ved hjelp av denne tilnærmingen, noe som var tydelig fra de representative konfikale mikroskopibildene, hvor ved bestråling i sirkulært og ringmønster ble cellene fjernet i det respektive mønsteret.Etter ekstraksjon fra mikrowell arrays ble celle levedyktighet og DNA-mengde vurdert. Eksponeringsmønstrene påvirket verken det levedyktige celleantallet eller DNA-kvaliteten, noe som indikerer at levedyktige bakterieceller selektivt kan hentes fra mikrowells med minimal skade, og deres DNA kan isoleres ved høy renhet for nedstrøms genomisk analyse. Kontroller alltid at hydrogelen har dannet seg før du fjerner den perfluoroalkylaterte deksleslipen.Presisjon og omsorg er nødvendig for å plassere avstandsstykkene for hydrogelavsetning og bruke slangene til utvinning av celler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Utarbeidelse av Hydroxy-PAAM Hydrogeler for frakobling effekten av Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Stillas for Ledd chondrocyttransplantasjon Kultur og brusk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Bygging av Modular Hydrogel blad for Micropatterned Macro-skalert 3D Cellular Arkitektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradient belastning Chip for stimulerende cellulære atferd i celle-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mønstre bioaktive proteiner eller peptider på Hydrogel bruker fotokjemi for biologiske programmer

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Fabrikere en nyre Cortex ekstracellulær Matrix-avledet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Søknader om åpen kilde Mikroplate-kompatibel belysning paneler

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Fremstilling og karakterisering av grafenbasert 3D biohybrid hydrogelbioblekk for perifer nevroteknologi

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Hydrogel arrayer muliggjør økt gjennomstrømning for screeningeffekter av matrisekomponenter og terapeutiske stoffer i 3D tumormodeller

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

Isolering av neste generasjons genterapivektorer gjennom engineering, strekkoding og screening av adeno-associated virus (AAV) kapsidvarianter

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...