Name: photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelo NSF CAREER Award #1944791.

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	<li>Welch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+single+cell+isolation+for+genomics+using+microraft+arrays.">Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).</li><li>Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+Single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+flow+cytometry:+The+role+of+microfabrication+methodologies,+performance+and+functional+specification.">Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification.</a> Technology. 06 (01), 1-23 (2018).</li><li>Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -. 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T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+copatterning+strategies+using+azlactone-based+block+copolymers.">Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabricating+reactive+surfaces+with+brush-like+and+crosslinked+films+of+azlactone-functionalized+block+co-polymers.">Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562 (2018).</li><li>Timm, A. 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P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Hydrogel+Interactions+in+Tissue+Engineering:+Mechanisms+and+Applications.">Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160 (2013).</li><li>Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+interactions+between+bacteria+and+hydrogels.">Mechanical interactions between bacteria and hydrogels.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10893 (2018).</li></ol>

A RRH e a AJV registraram uma patente sobre essa tecnologia. Os demais autores não declaram conflito de interesses.

Este manuscrito demonstra o uso de hidrogéis fotodegradáveis para triagem e isolamento de bactérias. O material e a abordagem permitem a cultura de alto rendimento, o controle sobre as mídias de crescimento e as condições de crescimento e a extração celular limpa e precisa de forma simples e econômica. A extração requer apenas um microscópio fluorescente juntamente com a ferramenta de iluminação padronizada e pode ser feita de forma sequencial para isolar vários alvos celulares. Cada extração leva de 5 a 10 minutos para ser realizada, e até 30 colônias alvo foram removidas de um único hidrogel. Uma das principais vantagens da abordagem é sua adaptabilidade a uma variedade de diferentes formatos de ensaio, como demonstrado aqui com a triagem de hidrogéis a granel e matrizes de microwell. O processo de separação em ambos os formatos tem sido usado com sucesso para isolar bactérias que exibem comportamento de crescimento único para genotipo a jusante após cultura e observação microscópica, uma capacidade crítica para conectar genótipo celular ao fenótipo. Até o momento, caracterizações genômicas de bactérias extraídas dessas interfaces incluíram sequenciamento de amplicon 16S para identificar coleções de várias espécies de bactérias de microbiomas ambientais que geram comportamento de crescimento emergente18, e para o sequenciamento de genoma inteiro para identificar com sucesso mutações genéticas que causam perfis raros de crescimento em células presentes dentro das bibliotecas mutantes19.
O uso de hidrogéis a granel para triagem e isolamento celular é o formato mais simples e simples. Hidrogéis fotodegradáveis em massa formam-se rapidamente (25 min) depois de misturar os precursores sobre tampas de vidro transparentes para encapsular células em uma matriz de cultura celular 3D que é imageda com um microscópio de fluorescência vertical ou invertido padrão. Assim, o método tem potencial para ser translacional para laboratórios comuns de microbiologia que não possuem recursos de microfabização ou expertise. Uma desvantagem para este formato é que as células são orientadas aleatoriamente ao longo do hidrogel tridimensional. Portanto, as células podem aparecer fora do plano focal quando imagens com objetivos de ampliação mais elevados e extração podem ser difíceis se colônias de células forem orientadas muito perto umas das outras ou se houver uma sobreposição vertical de colônias. Depositar um hidrogel fino (<13 μm) como descrito é fundamental para mitigar essa desvantagem. A exposição em padrões de luz cruzada quebradas(Figura 4B) é preferível aqui, pois este padrão resulta em células livres do hidrogel que têm exposição mínima à luz UV e podem ser prontamente recuperadas através de revestimento.
Em contraste, o formato de matriz de microwell fornece uma interface mais bem controlada, uma vez que as células bacterianas são particionadas em microwells discretas que servem como pequenos locais de cultura ou co-culturas17,18,26. Dimensão, tom e densidade de microwell são precisamente fabricados usando técnicas fotolithográficas padrão. Em comparação com hidrogéis a granel, as bactérias podem ser extraídas de matrizes de microwell com maior grau de especificidade e menor chance de contaminação cruzada, já que as células só estão presentes em locais predefinidos, não dispersas aleatoriamente por todo o hidrogel. A concentração e as proporções de células bacterianas na solução de semeadura também podem ser variadas para controlar a quantidade e a composição do inóculo de microwell através de um processo de semeadura que tem sido caracterizado em relatórios anteriores26, dando ao usuário flexibilidade no desenho experimental da tela. A principal desvantagem da triagem com o formato de matriz de microwell é o tempo adicional e a experiência necessária para a microfabricção. A fabricação de microwells foi estimada em ~$10 por matriz, o que inclui custos materiais e despesas de limpeza. Além disso, as matrizes de microwells são tradicionalmente feitas de silício, o que pode causar dificuldades de imagem, uma vez que os substratos não são transparentes. Além disso, uma alta quantidade de luz espalhada da superfície de silício pode limitar a imagem dentro dos microwells e pode diminuir a resolução de padrões durante a exposição de hidrogel com luz UV da ferramenta de iluminação padronizada (vista na Figura 8A,B). Micro-poços semelhantes foram fabricados em substratos transparentes de quartzo para atender a esses tipos de limitações27; no entanto, essa fabricação é consideravelmente mais difícil. A exposição a padrões de anéis que iluminam o perímetro do poço é preferível aqui para liberar células livres dos poços, minimizando a exposição uv.
O problema mais comum que ocorre em ambos os formatos é o desprendimento do hidrogel do substrato subjacente durante a cultura devido ao inchaço do hidrogel. Se este for um problema para hidrogéis a granel, a presença, densidade e uniformidade de grupos de thiol na camada química (MTPS) de fixação através da superfície da tampa de vidro base deve ser verificada usando uma técnica de caracterização de superfície apropriada (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Baixas densidades de grupos de thiol de superfície devido à funcionalidade superficial ineficiente podem levar a uma interação fraca entre o substrato e o hidrogel. Se ocorrer um baixo nível de tiaolação superficial, a estabilidade da solução MTPS deve ser verificada. Deve-se tomar cuidado na limpeza inicial do escorregador de vidro para garantir uma superfície limpa antes do tratamento do MTPS, e deve-se tomar cuidado para garantir o uso de tolueno anidro durante a reação superficial do MTPS (Seção de Protocolo 4). No caso de matrizes de microwell, as superfícies não são tialadas, e os hidrogéis, em vez disso, anexam através do enchimento parcial dos poços com o hidrogel, que ancora o hidrogel ao substratode silício 17. Se o desprendimento de hidrogel for um problema neste sistema, mais microestações ou outras características de microescala podem ser gravadas na matriz para ancorar ainda mais o hidrogel ao substrato para promover um apego mais forte.
Uma limitação da técnica em ambos os formatos é a estabilidade limitada dos hidrogéis na presença de bactérias. Nota-se que algumas bactérias, como a A. tumefaciens,podem degradar o hidrogel ao longo de 5-7 dias17,19, o que limita o tempo de experimento. A investigação atual dos mecanismos de degradação bacteriana está em andamento; É hipótese de que os grupos éster presentes nos monômeros diacrilatados estejam sujeitos à hidrólise mediada por bactérias e/ou degradação enzimática, como observado em outros sistemas17. O desenvolvimento de químicas mais estáveis de hidrogel estenderá o tempo que as bactérias podem permanecer no hidrogel e estenderá a tela a microrganismos com taxas de crescimento mais lentas. Uma segunda limitação é que, em ambos os formatos, a recuperação e extração celular ocorrem em ambiente aberto, resultando em volumes de extração relativamente altos (30-100 μL), que podem ser suscetíveis à contaminação externa. Assim, deve-se ter cuidado para garantir que células suficientes estejam presentes das colônias-alvo, minimizando o volume da solução de extração. Para obter células suficientes para chapeamento e recuperação ou para extração de material de DNA, observou-se que em hidrogéis a granel, as células devem ser cultivadas tempo suficiente para atingir diâmetros de colônias de pelo menos 10 μm. Para diminuir o volume necessário para extração celular, observou-se que o uso de uma seringa e tubos microliter (Figura 2) foi mais eficiente do que a pipetação. A tubulação permitiu que os isolados fossem retirados do ponto de liberação com mais precisão, exigindo menos volume da solução e diminuindo a chance de contaminação.
Trabalhos futuros envolvem compreender o efeito das propriedades mecânicas de hidrogel no crescimento celular, uma vez que as características mecânicas desses hidrogéis são bem controladas pela seleção de precursores monômeros baseados em PEG apropriados de vários pesos moleculares28, e as interações mecânicas provavelmente desempenham um papel importante no comportamento das bactérias29. Como os materiais de hidrogel podem ser facilmente incorporados em uma variedade de diferentes sistemas e dispositivos, o desenvolvimento adicional também é focado na integração deste material em sistemas microfluidos. Isso reduziria a solução de extração para femtoliter para volumes picoliter, em comparação com os volumes tradicionais de 30-100 μL atualmente exigidos no formato de coleta aberta. Volumes menores de soluções reduziriam consideravelmente a contaminação potencial e moveriam a abordagem para o isolamento e a caracterização de células únicas.

O isolamento de células com comportamentos únicos de um ambiente complexo e heterogêneo é fundamental para a obtenção de informações genéticas na biologia1. Na microbiologia, a seleção e isolamento de micróbios raros ou únicos após a observação torna-se importante em muitas aplicações que requerem uma conexão entre informações genômicas e informações fenotípicas observáveis. Essas aplicações incluem selecionar cepas fenotipicamente raras de bibliotecas mutantes2, selecionar microrganismos-chave de comunidades microbianas complexas3,4, e selecionar bactérias fenotipicamente raras, mas importantes de populações isogênicas. O isolamento de células viáveis, mas não culturais (VBNC) de uma população de bactérias é um exemplo importante deste último, onde as células com o fenótipo VBNC são frequentemente escondidas em populações de bactérias em 1:102 a 1:105 proporções5,6. Devido às dificuldades generalizadas no isolamento das bactérias, muito ainda é desconhecido sobre muitos microrganismos fenotipicamente raros. Essas limitações enfatizam a necessidade de técnicas de isolamento celular para primeiro identificar a célula-alvo ou células de uma mistura e, em seguida, recuperá-las e isolá-las para análise molecular a jusante7.
Alguns dos métodos mais comumente estabelecidos de isolamento celular incluem citometria de fluxo e classificação celular ativada fluorescente (FACS)8,separação imunomagnética9,10e microfluidos11. Embora esses métodos de isolamento tenham alto valor, eles também têm desvantagens que limitam seu uso. Por exemplo, o FACS pode fornecer isolamento microbiano de rotina no nível de célula única para análise genômica de seguimento3, mas muitas vezes é limitado por sua disponibilidade e despesa, bem como problemas de contaminação a jusante11. Abordagens microfluidas, como a citometria de fluxo microfluido, obtiveram muita atenção, o que, em comparação com a citometria de fluxo convencional, permite uma redução significativa no volume amostral necessário12. No entanto, a separação e recuperação de uma coleção individual ou pequena de células de dispositivos microfluidos é muitas vezes um problema desafiador que normalmente requer uma configuração mais complexa e design de dispositivo13. Muitas abordagens baseadas em microfluido caracterizam geneticamente as células antes de serem inseridas e observadas em um dispositivo14, limitando o número de espécies únicas observadas ao realizar uma tela funcional. Diante dessas limitações, é necessária uma inovação adicional de métodos e materiais práticos para triagem celular e isolamento para uso generalizado em muitos laboratórios.
Este artigo apresenta uma nova abordagem baseada em materiais para rastreamento e isolamento de bactérias. O método utiliza hidrogéis fotodegradáveis para encapsulamento celular, cultura, observação microscópica e liberação e recuperação sob demanda de bactérias-alvo com fenótipos únicos. Hidrogéis são projetados para conter tamanho de malha de 10 nm, onde cada crosslink contém grupos o-nitrobenzyl15. O material encapsula ou prende células para observação, permitindo a difusão de nutrientes e resíduos de e para células para a cultura. Expor o material a uma fonte de luz UV padronizada de 365 nm através de um microscópio vertical permite a degradação local do hidrogel através de fotocleavage dos grupos o-nitrobenzyl16, 17. A degradação desencadeia a liberação seletiva de células para recuperação para análise a jusante, incluindo análise genômica e, potencialmente, proteômica e transcriômica. A configuração experimental e o protocolo são relativamente simples, baratos e translacionais para laboratórios de microbiologia. Requer apenas encapsulamento celular através da formação de hidrogel, observação de células capturadas com um campo brilhante vertical e microscópio de fluorescência, e a iluminação de células de interesse com uma fonte de luz UV padronizada para recuperação.
Uma das principais vantagens dessa abordagem baseada em materiais para a triagem é sua adaptabilidade a diferentes formatos de triagem. Em seu formato mais básico, o material pode ser usado para triagem encapsulando uma coleção de células heterogêneas em hidrogéis a granel. As células são então observadas para o fenótipo desejado, e células individuais de interesse são removidas para caracterização genômica. Em formatos mais elaborados, o material também pode ser integrado em dispositivos de laboratório em um chip para fornecer liberação e recuperação precisa de células das áreas desejadas do dispositivo. Ambos os formatos são descritos aqui, e ambos habilitaram novas aplicações de triagem microbiana e seleção17,18,19. O método é demonstrado aqui com organismos gram-negativos modelo(Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) e um modelo de organismo Gram-positivo(Bacillus subtilis) e foi prontamente estendido a uma variedade de outras bactérias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>175617-25G</td>
			<td>&#62; 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox detergent powder</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>1104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Certified ACS Granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave SK300C</td>
			<td>Yamato Scientific</td>
			<td>18016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 1A1135</td>
			<td>Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td>1A1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield upright microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C614-500</td>
			<td>For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>0188-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: -30-60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: &#60; 32 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli ATCC 25922</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R19020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium microscope slides plain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td>Contains inhibitor, 30 wt% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incu-Shaker Mini</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>E5-0014-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 7-hydrate</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Avantor Performance Materials, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen, compressed</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)</td>
			<td>NOF America Corporation</td>
			<td>PTE-100SH</td>
			<td>Sunbright-PTE-100SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>K813-500ML</td>
			<td>Store between 15 &#176;C&#8211;30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon400</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>DSI-D-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>25 x 75 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>BioXtra, &#62; 98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505-250G</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#62; 99.0% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel thickness gage</td>
			<td>Precision Brand Products</td>
			<td>77739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-1L</td>
			<td>Anhydrous, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td>For microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FS-110H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation

Biólogos há muito tentam entender a relação entre fenótipo e genótipo. Para entender melhor essa conexão, é crucial desenvolver tecnologias práticas que acoplam o rastreamento celular microscópico com isolamento celular em alta pureza para análise genética a jusante. Aqui, descreve-se o uso de hidrogéis polidegradáveis poli (etileno glicol) para triagem e isolamento de bactérias com fenótipos de crescimento únicos de populações de células heterogêneas. O método conta com encapsulamento ou tração de células com o hidrogel, seguido pela cultura, triagem microscópica, em seguida, uso de uma ferramenta de padronização de luz de alta resolução para controle espacial da degradação do hidrogel e liberação de células selecionadas em uma solução para recuperação. A aplicação de diferentes padrões de luz permite o controle sobre a morfologia da célula extraída, e padrões como anéis ou cruzes podem ser usados para recuperar células com exposição mínima direta à luz UV para mitigar danos ao DNA aos isolados. Além disso, a ferramenta de padronização da luz fornece uma dose de luz ajustável para alcançar várias taxas de degradação e liberação celular. Permite a degradação em alta resolução, permitindo a recuperação celular com precisão espacial em escala de micron. Aqui, demonstra-se o uso deste material para triagem e recuperação de bactérias de hidrogéis a granel e dispositivos microfabricados de laboratório em um chip. O método é barato, simples e pode ser usado para aplicações comuns e emergentes em microbiologia, incluindo o isolamento de cepas bacterianas com perfis raros de crescimento de bibliotecas mutantes e isolamento de consórcios bacterianos com fenótipos emergentes para caracterizações genômicas.

Para investigar a capacidade da luz UV de desencadear a degradação controlada do hidrogel para liberação celular, os hidrogéis foram encapsulados primeiro sobre tampas thiolated sem a presença de bactérias. Cada hidrogel foi exposto a três padrões de círculo de réplica de luz em diferentes intensidades e tempos de exposição. A degradação percentual do gel foi calculada após a exposição à luz UV em cada intensidade de luz, e o tempo de exposição foi então quantificado por grupos de tiool pingente acoplado com um corante fluoresceína-5-maelimida para imagem de fluorescência19,24. Um exemplo representativo de como esses dois parâmetros afetam a degradação do hidrogel é mostrado na Figura 3. Como evidente, a luz padronizada fornecida pela ferramenta de iluminação padronizada fornece controle espaço-temporal da degradação do hidrogel em uma resolução que pode permitir a liberação de apenas um pequeno número de células.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig03.jpg"> Figura 3: Controle sobre a degradação do hidrogel. A dose de luz UV e a taxa de degradação do hidrogel resultante são incapazes através da ferramenta de iluminação padronizada. (Inset) Duas intensidades de luz diferentes foram escolhidas para a degradação padronizada do hidrogel. Após exposição à luz UV de 365 nm, hidrogéis foram rotulados com fluoresceína-5-maleimida para imagem de fluorescência. Reimpresso (adaptado) com permissão da Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para extração celular, diferentes padrões de luz foram usados para investigar a liberação celular(Figura 4). Aqui, as células das bactérias Agrobacterium foram encapsuladas em hidrogéis a granel sobre tampas de vidro arrojadas, então cultivadas em colônias de microescala. Os hidrogéis foram então inspecionados em microscopia de campo brilhante, e microcolônias direcionadas foram expostas a padrões variados de luz UV. Observou-se que diferentes padrões de exposição influenciaram a morfologia das células liberadas. Isso é potencialmente benéfico para várias aplicações. Por exemplo, expor um padrão de anel ao redor da colônia alvo resulta na liberação de toda a colônia ainda encapsulada em um hidrogel PEG protetor e sem exposição direta à luz UV(Figura 4A),que pode preservar células e fornecer uma fácil purificação a jusante. Em contraste, expondo parte ou toda a colônia à luz UV, as células podem ser extraídas tanto como aglomerados celulares agregados (Figura 4B) ou como células individuais livres(Figura 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig04.jpg"> Figura 4: Controle sobre a morfologia das células extraídas. (A) Uso de um padrão de anel para liberar toda a colônia celular, protegida em uma matriz PEG. (B) Uso de um padrão cruzado quebrado para liberação celular em agregados. (C) Uso de um padrão cruzado para liberar células individuais. Reimpresso (adaptado) com permissão de Fattahi et al.19 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Crítico no protocolo de encapsulamento está tanto a densidade de semeadura celular quanto a espessura do hidrogel, pois ambos os parâmetros podem influenciar o número de células incorporadas no hidrogel para observação. Para demonstrar, as amostras de células de tumefaciens A. foram encapsuladas em hidrogéis de duas espessuras diferentes usando espaçadores finos (12,7 μm) ou espaçadores de espessura (40 μm) cultivados, e imagens seguindo os protocolos estabelecidos. Hidrogéis mais finos resultaram em uma densidade de microcollonia de 90 colônias/mm2 em todo o hidrogel, onde foi observada sobreposição mínima de colônias(Figura 5A). Em contraste, espessuras de hidrogel superiores a 12,7 μm resultaram na formação de colônias sobrepostas na direção vertical (Figura 5B), o que pode resultar na extração de múltiplas colônias. Colônias sobrepostas podem causar contaminação cruzada durante a extração devido à natureza bidimensional do padrão de luz. Por exemplo, uma colônia superior pode ser alvo, enquanto uma colônia subjacente também é extraída com ela(Figura 5C). Portanto, recomenda-se o uso de espaçadores de 12,7 μm para a preparação de hidrogel.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig05.jpg"> Figura 5: A espessura do hidrogel afeta a pureza da extração. (A) Utilizando espaçadores com uma espessura de 12,7 μm para formação de hidrogel, as colônias são formadas dentro de um plano focal de 10x. (B) A sobreposição de colônias pode ser observada a 10x de ampliação se forem utilizados espaçadores com espessuras maiores que 12,7 μm. (C) A contaminação cruzada pode ocorrer com uma sobreposição de colônias durante a liberação celular: (i) um padrão de anel é usado para liberar uma colônia celular alvo, (ii) a colônia celular alvo se desprende do hidrogel, e (iii) uma segunda colônia subjacente é observada durante a exposição à luz sob a colônia alvo. Esta colônia também é removida, resultando em contaminação cruzada. Reimpresso (adaptado) com permissão da Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Dado o dano potencial a bactérias com luz UV, o efeito de variados micropatterns de luz UV na viabilidade celular foi ainda estudado utilizando modelo, bactérias Gram-positivas(B. subtilis) e modelo, bactérias Gram-negativas(E. coli). Cada um foi encapsulado dentro de hidrogéis a granel e cultivado em colônias de microescala de acordo com os protocolos padrão, verificando sua compatibilidade com o hidrogel. Microcolônias-alvo de tamanhos equivalentes (26 ± 1 μm de diâmetro) foram então expostas a uma dose de luz constante (168 mJ/mm2), seja na forma de padrões de círculo expondo microcolônias inteiras à luz UV ou padrões cruzados que degradam apenas bordas de hidrogel para minimizar a exposição da luz às células. As células foram então recuperadas e banhadas para quantificar a UFC/mL recuperada de cada colônia. Não foi encontrada diferença significativa no nível de recuperação celular(Figura 6A). Para investigar melhor a pureza das células extraídas, o DNA foi extraído de amostras de E. coli e analisado utilizando um espectotómetro UV-Vis. Para ambos os padrões, os níveis de qualidade do DNA estão dentro de uma faixa A260/A280 entre 1,8 e 2.0(Figura 6B),que está na faixa ideal para sequenciamento genômico25. Isso demonstra que os padrões UV utilizados para liberação sob as condições descritas têm efeito mínimo sobre a quantidade de células viáveis recuperadas dos hidrogéis a granel ou da qualidade genômica do DNA após a extração.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig06.jpg"> Figura 6: Impacto de diferentes padrões de exposição à luz na viabilidade celular e qualidade do DNA de bactérias liberadas a partir de hidrogéis a granel. (A) Níveis de recuperação celular para e. coli e B. subtilis após a extração usando padrões cruzados e padrões de círculo. Para este experimento, a extração foi feita a partir de colônias esféricas com o mesmo diâmetro (26 μm ± 1 μm) para garantir que o número de células liberadas de cada colônia fosse equivalente. As soluções extraídas foram então emplacardas para calcular a UFC/mL adquirida a partir de cada padrão. A análise estatística não mostrou diferença significativa na UFC/mL obtida a partir de padrões cruzados e circulares tanto para E. coli quanto B. subtilis (valor P > 0,05, n= 6 para ambas as cepas). (B) Quantificação espectrofotométrica da qualidade do DNA para células isoladas de E. coli utilizando padrões cruzados e circulares. Aqui, a análise estatística não mostrou diferença significativa na qualidade do DNA para os padrões utilizados (valor P > 0,05, n = 6) ( C ) Imagens decampobrilhante de colônias com diâmetros iguais expostos a padrões cruzados e circulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os arrays Microwell fornecem uma interface alternativa de triagem de laboratório em um chip que oferece recursos de triagem mais controlados em comparação com hidrogéis a granel. Por exemplo, as matrizes de microwell permitem a semeadura de bactérias em locais de cultura discretos onde o número de células no inóculo pode ser controlado. Características geométricas de microwells, como profundidade e diâmetro, também são controladas através de métodos padrão de microfabricação. Com esses benefícios, os microwells têm sido úteis para estudar o crescimento de bactérias sob confinamento espacial26, e mais recentemente para a descoberta de interações simbióticas e antagônicas entre diferentes espécies bacterianas quando confinadas na microescala18. A extração celular de poços para análise genômica, como o sequenciamento de amplicon 16S, é fundamental para essas aplicações. Usando o mesmo material de hidrogel, a luz UV pode ser exposta sobre um poço contendo células de interesse, seja como padrões de círculo ou anel. Este último garante a degradação do hidrogel apenas no perímetro de microwell para evitar a irradiação direta das células. Para demonstrar isso, as células de tumefaciens que expressavam mCherry foram semeadas em poços, o hidrogel foi então anexado à matriz de microwell. As células eram cultivadas e irradiadas com padrões de círculo ou anel. A membrana foi então manchada com corante fluoresceíno-5-maleimida. Imagens de fluorescência de duas cores revelaram que tanto a membrana quanto as células dentro dos poços são removidas para ambos os padrões de irradiação17. Ao contrário do formato de hidrogel a granel, a extração celular aqui só foi observada na forma de aglomerados celulares18.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig07.jpg"> Figura 7: Imagens representativas de microscopia confocal que mostram impacto do padrão de luz no isolamento celular a partir de matrizes de microwell. (A) Microwells com diâmetros de 40 μm contendo bactérias (vermelhas) após semeadura e cultura. (B) Exposição à luz usando padrões de círculo e anel (azul). (C) A diminuição da fluorescência vermelha demonstra que as células são extraídas de poços irradiados. (D) Imagem de fluorescência de duas cores de membranas e bactérias após a irradiação, indicando a remoção tanto do hidrogel (verde) quanto das bactérias (vermelhas) dos poços alvo. (E) Z-stack, imagem de fluorescência de duas cores de poços alvo. A linha vermelha em (D) denota o plano xz imaged in (E), e a linha verde em (E) denota o plano xy imagem em(D). Amostras em imagens (C-E) foram lavadas para remoção de células liberadas, depois fixadas e imagens. Barra de escala = 40 μm. Reimpresso (adaptado) com permissão de van der Vlies et al.17. Copyright 2019 American Chemical Soceity. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para quantificar a viabilidade celular das bactérias e a qualidade do DNA após a extração neste formato, as células B. subtilis e E. coli foram semeadas, cultivadas e, em seguida, liberadas de matrizes de microwell usando padrões de círculo e anel(Figura 8A,B). As células liberadas foram então banhadas em placas de ágar ATGN, e a qualidade do DNA das células extraídas foi quantificada. Para garantir que um número consistente de células estivesse presente durante cada extração, microwells com intensidades fluorescentes semelhantes (~6000 a.U.) e, portanto, um número semelhante de células foram alvo de liberação. O número de células viáveis extraídas usando um padrão de círculo não foi significativamente diferente do número de células viáveis extraídas utilizando padrão de anel para qualquer bactéria(Figura 8C). Além disso, os níveis de qualidade do DNA não foram significativamente diferentes entre os padrões do círculo e do anel para qualquer bactéria(Figura 8D). Assim, semelhante aos achados em hidrogéis a granel, a aplicação da luz UV na intensidade e duração especificadas aqui teve um impacto insignificante na viabilidade e qualidade do DNA das células extraídas das matrizes de microwell. Esses achados demonstram que as células de bactérias viáveis podem ser seletivamente recuperadas de microwells com danos mínimos para análise a jusante.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig08.jpg"> Figura 8: Impacto de diferentes padrões de exposição à luz na viabilidade celular e qualidade do DNA de bactérias liberadas de matrizes de microwell. (A,B) Tanto para e. coli quanto para B. subtilis,padrões de círculo e padrões de anéis foram usados para extração celular de microwells de 10 μm. Padrão de círculo com diâmetro de 10 μm e padrão do anel com diâmetro interno de 10 μm e diâmetro externo de 20 μm foram utilizados neste experimento para extração celular. Microwells com os mesmos diâmetros foram usados para garantir que o número de células liberadas de cada microwell fosse o mesmo. (C) As soluções extraídas foram então emplacar-se para calcular a UFC/mL adquirida a partir de cada padrão de exposição. A análise estatística não mostrou diferença significativa na UFC/mL obtida a partir do padrão de círculo e anel tanto para E. coli quanto B. subtilis (valor P > 0,05, n = 6 para ambas as cepas). (D) A espectrofotometria foi usada para medir a qualidade do DNA das células E. coli e B. subtilis usando padrões de círculo e anel. Aqui, a análise estatística não mostrou diferença significativa na qualidade do DNA para os padrões utilizados (valor P > 0,05, n = 6 para ambas as cepas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Design e fabricação de matrizes de microwell. (A) Técnicas padrão de microfabricação foram aplicadas para fabricar matrizes de microwell em wafers de silício. (B) Cada substrato consistiu em 7 x 7 matrizes de poços de diâmetro de 10μm com profundidade de 20 μm e 30 μm de arremesso. (C) Cada matriz consistia de 225 microwells. Este valor foi modificado a partir de Barua et al.18. Copyright 2021 Frontiers Media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>

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Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

O uso de hidrogéis fotodegradáveis para isolar células bacterianas utilizando uma ferramenta de pattering de luz de alta resolução é relatado. Procedimentos experimentais essenciais, resultados e vantagens do processo são revistos. O método permite o isolamento rápido e barato de bactérias-alvo que mostram funções raras ou únicas de comunidades ou populações heterogêneas.

Interfaces de hidrogel fotodegradável para triagem, seleção e isolamento de bactérias

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Este protocolo foi projetado para isolar rapidamente as células das interfaces de triagem para caracterização genômica e essa capacidade é significativa porque pode combinar recursos de células macroscopicamente observáveis com informações genômicas. As células bacterianas direcionadas das interfaces de triagem podem ser isoladas com alta posição espacial de forma operacionalmente simples usando essa técnica. Os hidrogéis podem ser implementados em outras interfaces de triagem.O material de hidrogel pode ser facilmente incorporado em canais microfluidos para recuperação sob demanda de células de dispositivos microfluidos. Comece inoculando o tampão de ligação cruzada com a densidade celular desejada. Prepare a solução precursora do hidrogel em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro adicionando 12,5 microliters do buffer de ligação cruzada e 5,6 microlitradores da solução de diacrilato PEG ONB.E por último, adicione 6,9 microliters de solução de tiool PEG do antebraço à mistura. Para encapsulamento celular na solução precursora do hidrogel, coloque as tampas de base tialada em uma placa de Petri limpa e posicione dois espaçadores nos dois lados opostos do deslizamento de cobertura. Fixar os espaçadores na tampa da base, gravando os espaçadores na placa de Petri.Depois de adicionar o volume desejado da solução precursora em um slide de vidro perfluoroalquilado não reativo, coloque o slide na tampa da base e permita que a formação de hidrogel seja concluída à temperatura ambiente por 25 minutos. Uma vez que a gelação esteja completa, remova suavemente o deslizamento de vidro perfluoroalquilado. Coloque o substrato na placa de Petri de 60 por 15 milímetros contendo mídia ATGN complementada com antibiótico.Semente 700 microliters de suspensões de células bacterianas com OD 600 de 0,1 sobre o substrato da matriz de microwell e fazer a solução precursora de hidrogel, como demonstrado anteriormente usando 12,5 microlitres de salina tamponada de fosfato ATGN de pH oito. Pipetas 12,5 microlitros da solução precursora em um deslizamento de vidro perfluoroalquilado não reativo e colocam dois espaçadores de aço de 38 micrômetros em dois lados opostos do substrato de matriz de micropovas innoculados com células. Em seguida, inverta o deslizamento de vidro perfluoroalquilado com a gota de solução precursora e coloque uma gotícula no meio do substrato de microwell.Quando o hidrogel for formado após uma incubação de 25 minutos à temperatura ambiente, remova suavemente o slide de vidro do substrato de microwell e coloque o substrato em uma placa de Petri contendo mídia ATGN suplementada com antibiótico. Coloque a amostra em um suporte de PDMS e adicione a mídia definida no topo da amostra para evitar a desidratação da amostra e forneça uma solução portadora para células liberadas. Depois de colocar o espelho de calibração em posição, ajuste o foco do microscópio para obter uma imagem nítida das colônias dentro do conjunto de hidrogel ou microwell e inspecione para identificar colônias ou poços de interesse.Aqui, projete os padrões de luz enquanto a visão da câmera mostra as colônias dentro da amostra para testar diferentes padrões para extração celular e salvar o padrão definido. Em seguida, selecione a seção de controle de sessão, adicione a sequência salva sob a guia intitulada com o nome do produto da ferramenta de iluminação padronizada. Escolha a opção para estimular o padrão para visualizar e ajustar o local de exposição desejado.Em seguida, ajuste a intensidade da luz para 60% e o tempo de exposição para 40 segundos sob a guia de controle led e inicie o processo de exposição. Monitore a degradação do hidrogel em tempo real e o modo Brightfield para garantir a liberação da célula. Para coletar a célula liberada, altere o filtro de microscópio de Brightfield para TRITC para visualizar a área exposta da amostra a olho nu.Uma vez localizada a área exposta, coloque a extremidade da tubulação sobre o local irradiado e, em seguida, mude o filtro de microscópio de volta para Brightfield para monitorar a recuperação celular em tempo real. Use a seringa presa à outra extremidade da tubulação para retirar cuidadosamente 200 microliters de solução contendo as células liberadas e transferir a solução para um tubo de centrífugas de 1,5 milímetros para análise ou revestimento de DNA. Diferentes micro padrões de luz UV foram usados para extração celular a partir de hidrogéis a granel, o que influenciou a morfologia das células liberadas.A exposição uv em um padrão de anel resultou na liberação de toda a colônia encapsulada em um hidrogel PEG protetor. Em contraste, expondo parte ou toda a colônia à luz UV, as células poderiam ser extraídas tanto como aglomerados celulares agregados ou como células individuais livres. A densidade de semeadura celular e a espessura do hidrogel são importantes para o encapsulamento celular.Os hidrogéis mais finos resultaram em micro colônias com sobreposição mínima de colônias, enquanto os hidrogéis com maior espessura resultaram em colônias sobrepostas, o que pode resultar na extração de múltiplas colônias. Colônias sobrepostas podem causar contaminação cruzada durante a extração devido à natureza bidimensional do padrão de luz. Quando uma colônia superior foi alvo, a colônia subjacente também foi extraída com ela.Também foi avaliado o efeito de variados micro padrões de luz UV sobre a viabilidade celular. Quando as micro colônias foram expostas a doses controladas de luz UV em um padrão circular ou transversal, a recuperação celular e a pureza do DNA não foram afetadas. As células foram recuperadas com sucesso de matrizes de microwell usando essa abordagem, o que ficou evidente a partir das imagens representativas de microscopia confocal, onde após a irradiação no padrão circular e anel, as células foram removidas no respectivo padrão.Após a extração de matrizes de microwell, a viabilidade celular e a quantidade de DNA foram avaliadas. Os padrões de exposição não afetaram nem a contagem de células viáveis nem a qualidade do DNA, indicando que as células viáveis das bactérias poderiam ser seletivamente recuperadas de microwells com dano mínimo, e seu DNA poderia ser isolado em alta pureza para análise genômica a jusante. Verifique sempre se o hidrogel se formou antes de remover o deslizamento de cobertura perfluoroalquilado.Precisão e cuidado são necessários para colocar os espaçadores para deposição de hidrogel e usar os tubos para extração de células.

Research

JoVE Journal

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Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Preparação de Hidroxi-PAAm hidrogéis para dissociar os efeitos de Mecanotransdução Sugestões

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Bioengenharia

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Construção de Fichas de hidrogel modular para micropadronadas Macro-escalado 3D Cellular Arquitetura

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Isolamento de vetores de terapia gênica de próxima geração por meio de engenharia, código de barras e triagem de variantes do capsídeo do vírus adenoassociado (AAV)

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