Name: photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Это исследование было поддержано премией NSF CAREER Award #1944791.

<ol>
	<li>Welch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+single+cell+isolation+for+genomics+using+microraft+arrays.">Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).</li><li>Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. K., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+high-throughput+screening+of+small+mutant+libraries.">A microfluidic platform for high-throughput screening of small mutant libraries.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5234-5242 (2016).</li><li>Ishii, S., Tago, K., Senoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+and+isolation+for+microbiology+and+biotechnology:+Methods+and+applications.">Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1281-1292 (2010).</li><li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ichip+for+high-throughput+in+situ+cultivation+of+“uncultivable+microbial+species”.">Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of “uncultivable microbial species”.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Zhao, X., Zhong, J., Wei, C., Lin, C. W., Ding, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+viable+but+nonculturable+state+in+foodborne+pathogens.">Current perspectives on viable but nonculturable state in foodborne pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 580 (2017).</li><li>Wang, X., Gou, X., Chen, S., Yan, X., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+manipulation+tool+with+combined+microwell+array+and+optical+tweezers+for+cell+isolation+and+deposition.">Cell manipulation tool with combined microwell array and optical tweezers for cell isolation and deposition.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 23 (7), 075006 (2013).</li><li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Poonlapdecha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-conjugated+ferromagnetic+nanoparticles+with+lateral+flow+test+strip+assay+for+rapid+detection+of+Campylobacter+jejuni+in+poultry+samples.">Antibody-conjugated ferromagnetic nanoparticles with lateral flow test strip assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in poultry samples.</a> International Journal of Food Microbiology. 286, 6-14 (2018).</li><li>Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomagnetic+separation:+An+effective+pretreatment+technology+for+isolation+and+enrichment+in+food+microorganisms+detection.">Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).</li><li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+Single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+flow+cytometry:+The+role+of+microfabrication+methodologies,+performance+and+functional+specification.">Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification.</a> Technology. 06 (01), 1-23 (2018).</li><li>Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+and+microbial+engineering.">Microfluidics and microbial engineering.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 432-446 (2016).</li><li>Kehe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+screening+of+synthetic+microbial+communities.">Massively parallel screening of synthetic microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12804-12809 (2019).</li><li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+degradation+of+chain+and+step-polymerized+photodegradable+hydrogels.">Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels.</a> Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties.">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li><li>Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+demand+release+and+retrieval+of+bacteria+from+microwell+arrays+using+photodegradable+hydrogel+membranes.">On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).</li><li>Barua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+discovery+of+positive+and+negative+interactions+among+root+microbiome+bacteria+using+microwell+recovery+arrays.">Simultaneous discovery of positive and negative interactions among root microbiome bacteria using microwell recovery arrays.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 3361 (2021).</li><li>Fattahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+rapid+screening,+isolation,+and+genetic+characterization+of+bacteria+with+rare+phenotypes.">Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes.</a> Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+copatterning+strategies+using+azlactone-based+block+copolymers.">Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabricating+reactive+surfaces+with+brush-like+and+crosslinked+films+of+azlactone-functionalized+block+co-polymers.">Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562 (2018).</li><li>Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+tracking+of+microbial+community+development+within+a+microwell+array+platform.">Assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55701 (2017).</li><li>. DNeasy Blood &amp; Tissue Handbook - QIAGEN Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en</a> (2021)</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+Maleimide-Thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+modified+salt-out+method+for+DNA+extraction+from+whole+blood+lymphocytes:+A+simple+and+economical+method+for+gene+polymorphism.">Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism.</a> Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28 (2018).</li><li>Hansen, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+of+bacteria+in+microwell+arrays+reveals+the+importance+of+confinement+in+community+development.">Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development.</a> PLoS One. 11 (5), 0155080 (2016).</li><li>Halsted, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transparent+microwell+arrays+for+optical+monitoring+and+dissection+of+microbial+communities.">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).</li><li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Hydrogel+Interactions+in+Tissue+Engineering:+Mechanisms+and+Applications.">Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160 (2013).</li><li>Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+interactions+between+bacteria+and+hydrogels.">Mechanical interactions between bacteria and hydrogels.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10893 (2018).</li></ol>

RRH и AJV подали патент на эту технологию. Остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Эта рукопись демонстрирует использование фоторазлагаемых гидрогелей для скрининга и выделения бактерий. Материал и подход обеспечивают высокую пропускную способность культивирования, контроль над питательными средами и условиями роста, а также чистую и точную экстракцию клеток простым и экономически эффективным способом. Экстракция требует только флуоресцентного микроскопа в сочетании с инструментом узорчатого освещения и может быть выполнена последовательным образом для изоляции нескольких клеточных мишеней. Каждая экстракция занимает 5-10 минут, и из одного гидрогеля удаляется до 30 целевых колоний. Ключевым преимуществом этого подхода является его адаптивность к множеству различных форматов анализа, как показано здесь с помощью просеивания как из объемных гидрогелей, так и из микролуночных массивов. Процесс разделения в обоих форматах был успешно использован для выделения бактерий, которые демонстрируют уникальное поведение роста для последующего генотипирования после культивирования и микроскопического наблюдения, что является критической способностью для соединения генотипа клеток с фенотипом. На сегодняшний день геномные характеристики бактерий, извлеченных из этих интерфейсов, включают секвенирование ампликонов 16S для идентификации многовидовых коллекций бактерий из микробиомов окружающей среды, которые генерируют эмерджентное поведение роста18,и для секвенирования всего генома для успешной идентификации генетических мутаций, которые вызывают редкие профили роста в клетках, присутствующих в мутантных библиотеках19.
Использование объемных гидрогелей для скрининга и изоляции клеток является наиболее простым и понятным форматом. Объемные фоторазлагаемые гидрогели образуются быстро (25 мин) после смешивания предшественников над прозрачными стеклянными крышками для инкапсуляции клеток в матрицу 3D-культуры клеток, которая визуализируется стандартным вертикальным или перевернутым флуоресцентным микроскопом. Таким образом, метод может быть трансляционным для обычных микробиологических лабораторий, которые не имеют ресурсов микропроизводства или опыта. Недостатком этого формата является то, что клетки случайным образом ориентированы по всему трехмерному гидрогелю. Поэтому клетки могут появляться вне фокальной плоскости при визуализации с более высокими целями увеличения, и извлечение может быть затруднено, если клеточные колонии ориентированы слишком близко друг к другу или если есть вертикальное наложение колоний. Осаждение тонкого гидрогеля (<13 мкм), как описано, имеет решающее значение для смягчения этого недостатка. Экспозиция в разбитых перекрестных световых паттернах(рисунок 4B)здесь предпочтительна, так как эта картина приводит к тому, что клетки, свободные от гидрогеля, имеют минимальное воздействие ультрафиолетового света и могут быть легко восстановлены путем покрытия.
В отличие от этого, формат массива микролунок обеспечивает более хорошо контролируемый интерфейс, поскольку клетки бактерий разделены на дискретные микролунки, которые служат в качестве небольших культур или ко-культур участков17,18,26. Размеры, шаг и плотность микролунок точно изготавливаются с использованием стандартных фотолитографических методов. По сравнению с объемными гидрогелями, бактерии могут быть извлечены из микролуночных массивов с более высокой степенью специфичности и меньшей вероятностью перекрестного загрязнения, поскольку клетки присутствуют только в заранее определенных местах, а не случайным образом диспергированы по всему гидрогелю. Концентрация и соотношение клеток бактерий в посевном растворе также могут быть изменены для контроля количества и состава микролуночного инокулята посредством процесса посева, который был охарактеризован в предыдущих отчетах26,что дает пользователю гибкость в экспериментальном проектировании экрана. Основным недостатком скрининга с форматом массива микровелл является дополнительное время и опыт, необходимые для микропроизводства. Производство микроузелей, по оценкам, стоило ~ 10 долларов США за массив, что включает в себя материальные затраты и расходы на чистые помещения. Кроме того, массивы микролунок традиционно изготавливаются из кремния, что может вызвать трудности с визуализацией, поскольку подложки непрозрачны. Кроме того, большое количество рассеяния света от поверхности кремния может ограничить визуализацию в микролунках и может уменьшить разрешение рисунка во время воздействия гидрогеля ультрафиолетовым светом от инструмента узорчатого освещения (см. Рисунок 8A,B). Аналогичные микроскважины были изготовлены на прозрачных кварцевых подложках для устранения этих типов ограничений27; однако эта фабрикация значительно сложнее. Воздействие кольцевых узоров, которые освещают периметр скважины, здесь предпочтительно для высвобождения свободных ячеек из скважин при минимизации воздействия ультрафиолета.
Наиболее распространенной проблемой, которая возникает в любом формате, является отделение гидрогеля от нижележащего субстрата во время культивирования из-за набухания гидрогеля. Если это проблема для объемных гидрогелей, наличие, плотность и однородность тиольных групп в химическом (MTPS) крепежном слое по всей поверхности крышки основного стекла должны быть проверены с использованием соответствующего метода определения характеристик поверхности (XPS, ATR-FTIR, AFM и т. Д.). Низкая плотность поверхностных тиольных групп из-за неэффективной функционализации поверхности может привести к слабому взаимодействию между субстратом и гидрогелем. При возникновении низкого уровня поверхностной тиолации следует проверить стабильность раствора MTPS. Следует соблюдать осторожность при первоначальной очистке стеклянной горки, чтобы обеспечить чистую поверхность перед обработкой MTPS, и следует проявлять осторожность для обеспечения использования безводного толуола во время поверхностной реакции MTPS (раздел 4 Протокола). В случае микролуночных массивов поверхности не тиолированы, а гидрогели вместо этого присоединяются через частичное заполнение скважин гидрогелем, который прикрепляет гидрогель к кремниевой подложке17. Если отделение гидрогеля является проблемой в этой системе, в массив можно вытравить больше микролунок или других микромасштабных объектов для дальнейшего закрепления гидрогеля на подложке, чтобы способствовать более сильному прикреплению.
Ограничением метода в любом формате является ограниченная стабильность гидрогелей в присутствии бактерий. Было отмечено, что некоторые бактерии, такие как A. tumefaciens,могут разлагать гидрогель в течение 5-7 дней17,19,что ограничивает время эксперимента. В настоящее время ведутся исследования механизмов бактериальной деградации; предполагается, что эфирные группы, присутствующие в мономерах диакрилата, подвержены опосредованному бактериями гидролизу и/или ферментативной деградации, как отмечено в других системах17. Разработка более стабильных химических веществ гидрогеля продлит время, в течение которого бактерии могут оставаться в гидрогеле, и расширит экран на микроорганизмы с более медленными темпами роста. Второе ограничение заключается в том, что в обоих форматах восстановление и экстракция клеток происходят в открытой среде, что приводит к относительно высоким объемам экстракции (30-100 мкл), которые могут быть восприимчивы к внешнему загрязнению. Таким образом, необходимо позаботиться о том, чтобы обеспечить присутствие достаточного количества клеток из колоний-мишеней при минимизации объема экстракционного раствора. Чтобы получить достаточное количество клеток для покрытия и восстановления или для экстракции материала ДНК, было замечено, что в объемных гидрогелях клетки должны культивироваться достаточно долго, чтобы достичь диаметра колонии не менее 10 мкм. Для уменьшения необходимого объема для экстракции клеток было отмечено, что использование микролитрового шприца и трубки (рисунок 2) было более эффективным, чем пипетка. Трубки позволили более точно извлекать изоляты из точки высвобождения, требуя меньшего объема раствора и снижая вероятность загрязнения.
Будущая работа предполагает понимание влияния механических свойств гидрогеля на рост клеток, так как механические особенности этих гидрогелей хорошо контролируются путем отбора соответствующих предшественников мономеров на основе ПЭГ различной молекулярной массы28,а механические взаимодействия, вероятно, играют важную роль в поведении бактерий29. Поскольку гидрогелевые материалы могут быть легко включены в различные системы и устройства, дальнейшее развитие также сосредоточено на интеграции этого материала в микрофлюидные системы. Это уменьшило бы экстракционный раствор до фемтолитра до пиколитров по сравнению с традиционными объемами 30-100 мкл, требуемыми в настоящее время в формате открытой коллекции. Меньшие объемы раствора значительно уменьшат потенциальное загрязнение и сдвинут подход к одноэлементной изоляции и характеристике.

Выделение клеток с уникальным поведением из сложной и гетерогенной среды имеет основополагающее значение для получения генетической информации в биологии1. В микробиологии отбор и выделение редких или уникальных микробов после наблюдения становится важным во многих приложениях, требующих связи между геномной информацией и наблюдаемой фенотипической информацией. Эти приложения включают выбор фенотипически редких штаммов из мутантных библиотек2,отбор ключевых микроорганизмов из сложных микробных сообществ3,4и отбор фенотипически редких, но важных бактерий из изогенных популяций. Выделение жизнеспособных, но некультурных клеток (VBNC) из популяции бактерий является важным примером последнего, где клетки с фенотипом VBNC часто скрыты в популяциях бактерий в соотношениях 1:102 до 1:105 5,6. Из-за широко распространенных трудностей в выделении бактерий многое остается неизвестным о многих фенотипически редких микроорганизмах. Эти ограничения подчеркивают необходимость того, чтобы методы изоляции клеток сначала идентифицировали клетку-мишень или клетки из смеси, а затем извлекали и изолировали их для последующего молекулярного анализа7.
Некоторые из наиболее часто устанавливаемых методов изоляции клеток включают проточную цитометрию и флуоресцентную активированную сортировку клеток (FACS)8,иммуномагнитное разделение9,10и микрофлюидику11. Хотя эти методы изоляции имеют высокую ценность, они также имеют недостатки, которые ограничивают их использование. Например, FACS может обеспечить рутинную микробную изоляцию на уровне одной клетки для последующего геномного анализа3, но часто ограничена его доступностью и стоимостью, а также проблемами загрязнения11. Микрофлюидные подходы, такие как микрофлюидная проточная цитометрия, получили большое внимание, что, по сравнению с обычной проточной цитометрией, позволяет значительно уменьшить требуемый объем образца12. Однако разделение и извлечение отдельных или небольших коллекций клеток из микрофлюидных устройств часто является сложной задачей, которая обычно требует более сложной настройки и конструкции устройства13. Многие микрофлюидные подходы генетически характеризуют клетки до того, как они будут введены и наблюдаемы в устройстве14,ограничивая количество уникальных видов, наблюдаемых при выполнении функционального экрана. Учитывая эти ограничения, для широкого использования во многих лабораториях требуются дальнейшие инновации как методов, так и материалов, которые являются практичными для скрининга и изоляции клеток.
В этой статье представлен новый, основанный на материалах подход к скринингу и изоляции бактерий. Метод использует фоторазлагаемые гидрогели для инкапсуляции клеток, культивирования, микроскопического наблюдения, а также высвобождения и восстановления по требованию целевых бактерий с уникальными фенотипами. Гидрогели рассчитаны на содержание 10 нм размера сетки, где каждое сшитое звеносодержит o-нитробензиловые группы15. Материал инкапсулирует или захватывает клетки для наблюдения, обеспечивая при этом диффузию питательных веществ и отходов в клетки и из них для культивирования. Воздействие на материал узорчатого 365 нм УФ-источника света через вертикальный микроскоп позволяет локально разрушать гидрогель через фоторасщепление о-нитробензиловых групп16,17. Деградация вызывает селективное высвобождение клеток для восстановления для последующего анализа, включая геномный и, возможно, протеомный и транскриптомный анализ. Экспериментальная установка и протокол относительно просты, недороги и трансляционны для микробиологических лабораторий. Он требует только инкапсуляции клеток путем образования гидрогеля, наблюдения захваченных клеток с помощью вертикального яркого поля и флуоресцентного микроскопа и освещения интересующих клеток узорчатым источником ультрафиолетового света для извлечения.
Ключевым преимуществом этого подхода к скринингу на основе материалов является его адаптивность к различным форматам скрининга. В своем самом базовом формате материал может быть использован для скрининга путем инкапсуляции гетерогенной коллекции клеток в объемные гидрогели. Затем клетки наблюдают за желаемым фенотипом, а отдельные клетки, представляющие интерес, удаляются для геномной характеристики. В более сложных форматах материал также может быть интегрирован в лабораторные устройства для обеспечения точного высвобождения и извлечения клеток из желаемых областей устройства. Оба формата описаны здесь, и оба позволили в последнее время использовать новые приложения для микробного скрининга и отбора17,18,19. Метод демонстрируется здесь с помощью модели грамотрицательных организмов(Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens)и модельного грамположительного организма(Bacillus subtilis)и был легко распространен на множество других бактерий.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>175617-25G</td>
			<td>&#62; 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox detergent powder</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>1104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Certified ACS Granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave SK300C</td>
			<td>Yamato Scientific</td>
			<td>18016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 1A1135</td>
			<td>Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td>1A1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield upright microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C614-500</td>
			<td>For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>0188-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: -30-60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: &#60; 32 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli ATCC 25922</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R19020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium microscope slides plain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td>Contains inhibitor, 30 wt% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incu-Shaker Mini</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>E5-0014-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 7-hydrate</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Avantor Performance Materials, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen, compressed</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)</td>
			<td>NOF America Corporation</td>
			<td>PTE-100SH</td>
			<td>Sunbright-PTE-100SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>K813-500ML</td>
			<td>Store between 15 &#176;C&#8211;30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon400</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>DSI-D-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>25 x 75 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>BioXtra, &#62; 98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505-250G</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#62; 99.0% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel thickness gage</td>
			<td>Precision Brand Products</td>
			<td>77739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-1L</td>
			<td>Anhydrous, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td>For microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FS-110H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation

Биологи давно пытаются понять взаимосвязь между фенотипом и генотипом. Чтобы лучше понять эту связь, крайне важно разработать практические технологии, которые сочетают микроскопический скрининг клеток с выделением клеток высокой чистоты для последующего генетического анализа. Здесь описано использование фоторазлагаемых поли(этиленгликолевых) гидрогелей для скрининга и выделения бактерий с уникальными фенотипами роста из гетерогенных клеточных популяций. Метод основан на инкапсуляции или захвате клеток гидрогелем с последующим культивированием, микроскопическим скринингом, затем использованием инструмента светового паттерна высокого разрешения для пространственно-временного контроля деградации гидрогеля и высвобождения выбранных клеток в раствор для извлечения. Применение различных световых паттернов позволяет контролировать морфологию извлеченной клетки, а такие паттерны, как кольца или кресты, могут быть использованы для извлечения клеток с минимальным прямым воздействием ультрафиолетового света для смягчения повреждения ДНК изолятами. Кроме того, инструмент для построения светового паттерна обеспечивает регулируемую дозу света для достижения различных стадий деградации и высвобождения клеток. Он обеспечивает деградацию с высоким разрешением, обеспечивая извлечение клеток с пространственной точностью в микронном масштабе. Здесь демонстрируется использование этого материала для скрининга и извлечения бактерий как из объемных гидрогелей, так и из микрофабрикатных лабораторных устройств. Метод является недорогим, простым и может быть использован для распространенных и новых применений в микробиологии, включая выделение бактериальных штаммов с редкими профилями роста из библиотек мутантов и выделение бактериальных консорциумов с возникающими фенотипами для геномных характеристик.

Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Сообщается об использовании фоторазлагаемых гидрогелей для выделения бактериальных клеток с помощью инструмента для измерения света с высоким разрешением. Рассматриваются основные экспериментальные процедуры, результаты и преимущества процесса. Метод обеспечивает быструю и недорогую изоляцию целевых бактерий, проявляющих редкие или уникальные функции, из гетерогенных сообществ или популяций.

Фоторазлагаемые гидрогелевые интерфейсы для скрининга, отбора и выделения бактерий

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Этот протокол предназначен для быстрой изоляции клеток от экранирующих интерфейсов для геномной характеристики, и эта возможность важна, поскольку она может сочетать макроскопически наблюдаемые особенности клеток с геномной информацией. Целевые бактериальные клетки из экранирующих интерфейсов могут быть изолированы с высоким пространственным положением операционно простым способом с использованием этого метода. Гидрогели могут быть реализованы в других интерфейсах скрининга.Материал гидрогеля может быть легко включен в микрофлюидные каналы для извлечения по требованию клеток из микрофлюидных устройств. Начните с прививки буфера сшивки с желаемой плотностью клеток. Готовят раствор предшественника гидрогеля в 0,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке, добавляя 12,5 микролитра сшивающего буфера и 5,6 микролитра раствора диакрилата ПЭГ ОНБ.И, наконец, добавьте в смесь 6,9 микролитров раствора тиола ПЭГ для предплечья. Для инкапсуляции клеток в растворе предшественника гидрогеля поместите тиолированные основания на чистую чашку Петри и расположите две распорки на двух противоположных сторонах крышки. Закрепите распорки на крышке основания, приклеив распорки к чашке Петри.После добавления желаемого объема раствора предшественника на нереакционноспособную перфторалкилированную стеклянную горку поместите затвор на основание крышки и дайте гидрогелевому образованию завершиться при комнатной температуре в течение 25 минут. Как только гелеобразование будет завершено, аккуратно удалите перфторалкилированный стеклянный слайд. Поместите субстрат в чашку Петри размером 60 на 15 миллиметров, содержащую среду ATGN, дополненную антибиотиком.Посейте 700 микролитров бактериальных клеточных суспензий с OD 600 0,1 над субстратом микролуночного массива и получите раствор предшественника гидрогеля, как было продемонстрировано ранее, используя 12,5 микролитра фосфатного буферного физиологического раствора ATGN рН восемь. Пипетка 12,5 микролитров раствора-предшественника на нереакционноспособном перфторалкилированном стеклянном предметном стекле и размещение двух 38-микрометровых стальных распорок на двух противоположных сторонах подложки микролуночного массива, иннокулированной ячейками. Затем переверните перфторалкилированный стеклянный слайд с каплей раствора предшественника и поместите каплю в середину субстрата микролунки.Когда гидрогель образуется после инкубации в течение 25 минут при комнатной температуре, осторожно удалите стеклянный слайд из микролунтового субстрата и поместите субстрат в чашку Петри, содержащую среду ATGN, дополненную антибиотиком. Поместите образец в держатель PDMS и добавьте определенную среду поверх образца, чтобы предотвратить обезвоживание образца и обеспечить раствор носителя для высвобождаемых клеток. После того, как калибровочное зеркало находится в положении, отрегулируйте фокус микроскопа, чтобы получить четкое изображение колоний в массиве гидрогелей или микролунок, и осмотрите, чтобы определить колонии или колодцы, представляющие интерес.Здесь спроектируйте световые паттерны, в то время как вид камеры показывает колонии внутри образца, чтобы проверить различные паттерны для извлечения клеток и сохранить определенный шаблон. Затем выберите раздел управления сеансом, добавьте сохраненную последовательность на вкладку с названием инструмента узорчатой подсветки. Выберите опцию стимуляции узора для просмотра и настройки нужного места экспозиции.Затем отрегулируйте интенсивность света до 60% и время экспозиции до 40 секунд под вкладкой управления светодиодами и запустите процесс экспозиции. Мониторинг деградации гидрогеля в режиме реального времени и режиме Brightfield для обеспечения высвобождения клеток. Чтобы собрать высвобожденную клетку, измените фильтр микроскопа с Brightfield на TRITC, чтобы визуализировать открытую область образца невооруженным глазом.Как только открытая область будет найдена, поместите конец трубки на облученное место, а затем измените фильтр микроскопа обратно на Brightfield, чтобы контролировать извлечение клеток в режиме реального времени. Используйте шприц, прикрепленный к другому концу трубки, чтобы осторожно извлечь 200 микролитров раствора, содержащего освобожденные клетки, и перенести раствор в 1,5-миллиметровую центрифужную трубку для анализа ДНК или покрытия. Различные микроструктуры ультрафиолетового света использовались для извлечения клеток из объемных гидрогелей, что повлияло на морфологию высвобождаемых клеток.Воздействие ультрафиолета в кольцевой схеме привело к высвобождению всей колонии, инкапсулированной в защитный гидрогель ПЭГ. Напротив, подвергая часть или всю колонию воздействию ультрафиолетового света, клетки могут быть извлечены либо как агрегированные кластеры клеток, либо как свободные отдельные клетки. Плотность посева клеток и толщина гидрогеля важны для инкапсуляции клеток.Более тонкие гидрогели приводили к микроколониям с минимальным перекрытием колоний, в то время как гидрогели с увеличенной толщиной приводили к перекрытию колоний, что могло привести к извлечению нескольких колоний. Перекрывающиеся колонии могут вызвать перекрестное загрязнение во время экстракции из-за двумерного характера светового рисунка. Когда верхняя колония становилась мишенью, нижележащая колония также извлекалась вместе с ней.Также оценивалось влияние различных микрообразов ультрафиолетового света на жизнеспособность клеток. Когда микроколонии подвергались воздействию контролируемых доз ультрафиолетового света в круговом или перекрестном виде, восстановление клеток и чистота ДНК не были затронуты. Клетки были успешно извлечены из массивов микролунок с использованием этого подхода, что было очевидно из репрезентативных изображений конфокальной микроскопии, где при облучении в круговом и кольцевом паттерне клетки удалялись в соответствующем рисунке.После извлечения из массивов микровелл оценивали жизнеспособность клеток и количество ДНК. Паттерны воздействия не повлияли ни на количество жизнеспособных клеток, ни на качество ДНК, что указывает на то, что жизнеспособные клетки бактерий могут быть избирательно извлечены из микролунок с минимальным повреждением, а их ДНК может быть выделена с высокой чистотой для последующего геномного анализа. Всегда проверяйте, что гидрогель сформировался, прежде чем удалять перфторалкилированный покров.Точность и осторожность необходимы для размещения распорок для гидрогелевого осаждения и использования трубок для экстракции клеток.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Подготовка гидрокси-PAAM Гидрогели расцепления последствий механотрансдукции сцен

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Гидрогель Строительные леса для суставной хондроцит культуры и хряща поколения

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Строительство модульных гидрогеля листов для Micropatterned Макро-масштабного 3D Cellular архитектуры

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Градиент штамм чип для стимулирования клеточных поведения в ячейке Ладена Гидрогель

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Кучность биоактивные белки или пептидов на гидрогеля с помощью фотохимии биологических приложений

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Изготовления внеклеточная матрица производные гидрогеля почек коры

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Приложения для microplate-совместимых панелей для освещения с открытым исходным кодом

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Получение и характеристика 3D-биогибридных гидрогелевых биочернил на основе графена для периферической нейроинженерии

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Гидрогелевые матрицы обеспечивают повышенную пропускную способность для скрининговых эффектов компонентов матрицы и терапии в 3D-моделях опухолей

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

Выделение векторов генной терапии следующего поколения с помощью инженерии, штрих-кодирования и скрининга вариантов капсида аденоассоциированного вируса (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...