Name: photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Bu araştırma NSF CAREER Award #1944791 tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>Welch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+single+cell+isolation+for+genomics+using+microraft+arrays.">Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).</li><li>Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. K., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+high-throughput+screening+of+small+mutant+libraries.">A microfluidic platform for high-throughput screening of small mutant libraries.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5234-5242 (2016).</li><li>Ishii, S., Tago, K., Senoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+and+isolation+for+microbiology+and+biotechnology:+Methods+and+applications.">Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1281-1292 (2010).</li><li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ichip+for+high-throughput+in+situ+cultivation+of+“uncultivable+microbial+species”.">Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of “uncultivable microbial species”.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Zhao, X., Zhong, J., Wei, C., Lin, C. W., Ding, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+viable+but+nonculturable+state+in+foodborne+pathogens.">Current perspectives on viable but nonculturable state in foodborne pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 580 (2017).</li><li>Wang, X., Gou, X., Chen, S., Yan, X., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+manipulation+tool+with+combined+microwell+array+and+optical+tweezers+for+cell+isolation+and+deposition.">Cell manipulation tool with combined microwell array and optical tweezers for cell isolation and deposition.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 23 (7), 075006 (2013).</li><li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Poonlapdecha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-conjugated+ferromagnetic+nanoparticles+with+lateral+flow+test+strip+assay+for+rapid+detection+of+Campylobacter+jejuni+in+poultry+samples.">Antibody-conjugated ferromagnetic nanoparticles with lateral flow test strip assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in poultry samples.</a> International Journal of Food Microbiology. 286, 6-14 (2018).</li><li>Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomagnetic+separation:+An+effective+pretreatment+technology+for+isolation+and+enrichment+in+food+microorganisms+detection.">Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).</li><li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+Single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+flow+cytometry:+The+role+of+microfabrication+methodologies,+performance+and+functional+specification.">Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification.</a> Technology. 06 (01), 1-23 (2018).</li><li>Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+and+microbial+engineering.">Microfluidics and microbial engineering.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 432-446 (2016).</li><li>Kehe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+screening+of+synthetic+microbial+communities.">Massively parallel screening of synthetic microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12804-12809 (2019).</li><li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+degradation+of+chain+and+step-polymerized+photodegradable+hydrogels.">Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels.</a> Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties.">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li><li>Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+demand+release+and+retrieval+of+bacteria+from+microwell+arrays+using+photodegradable+hydrogel+membranes.">On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).</li><li>Barua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+discovery+of+positive+and+negative+interactions+among+root+microbiome+bacteria+using+microwell+recovery+arrays.">Simultaneous discovery of positive and negative interactions among root microbiome bacteria using microwell recovery arrays.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 3361 (2021).</li><li>Fattahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+rapid+screening,+isolation,+and+genetic+characterization+of+bacteria+with+rare+phenotypes.">Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes.</a> Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+copatterning+strategies+using+azlactone-based+block+copolymers.">Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).</li><li>Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabricating+reactive+surfaces+with+brush-like+and+crosslinked+films+of+azlactone-functionalized+block+co-polymers.">Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562 (2018).</li><li>Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+tracking+of+microbial+community+development+within+a+microwell+array+platform.">Assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55701 (2017).</li><li>. DNeasy Blood &amp; Tissue Handbook - QIAGEN Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&amp;lang=en</a> (2021)</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+Maleimide-Thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+modified+salt-out+method+for+DNA+extraction+from+whole+blood+lymphocytes:+A+simple+and+economical+method+for+gene+polymorphism.">Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism.</a> Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28 (2018).</li><li>Hansen, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+of+bacteria+in+microwell+arrays+reveals+the+importance+of+confinement+in+community+development.">Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development.</a> PLoS One. 11 (5), 0155080 (2016).</li><li>Halsted, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transparent+microwell+arrays+for+optical+monitoring+and+dissection+of+microbial+communities.">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).</li><li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Hydrogel+Interactions+in+Tissue+Engineering:+Mechanisms+and+Applications.">Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160 (2013).</li><li>Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+interactions+between+bacteria+and+hydrogels.">Mechanical interactions between bacteria and hydrogels.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10893 (2018).</li></ol>

RRH ve AJV bu teknoloji hakkında patent başvurusunda bulundu. Geri kalan yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedir.

Bu makale, bakteri taraması ve izolasyonu için fotobozunur hidrojellerin kullanımını göstermektedir. Malzeme ve yaklaşım, yüksek verimli kültür, büyüme ortamı ve büyüme koşulları üzerinde kontrol ve basit ve uygun maliyetli bir şekilde temiz ve hassas hücre ekstraksiyonu sağlar. Ekstraksiyon sadece desenli aydınlatma aracı ile birleştirilmiş floresan bir mikroskop gerektirir ve birden fazla hücre hedefini izole etmek için sıralı bir şekilde yapılabilir. Her ekstraksiyon 5-10 dakika sürer ve tek bir hidrojelden 30'a kadar hedeflenen koloni çıkarılmıştır. Yaklaşımın önemli bir avantajı, hem dökme hidrojellerden hem de microwell dizilerinden tarama ile burada gösterildiği gibi, çeşitli farklı test formatlarına uyarlanabilirliğidir. Her iki formattaki ayırma işlemi, hücre genotipini fenotipe bağlamak için kritik bir yetenek olan kültür ve mikroskobik gözlemden sonra aşağı akış genotipleme için benzersiz büyüme davranışı gösteren bakterileri izole etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bugüne kadar, bu arayüzlerden çıkarılan bakterilerin genomik karakterizasyonları, acil büyüme davranışı üreten çevresel mikrobiyomlardan çok türlü bakteri koleksiyonlarını tanımlamak için16Samplicon dizilimini ve mutant kütüphanelerinde bulunan hücrelerde nadir büyüme profillerine neden olan genetik mutasyonları başarıyla tanımlamak için tam genom dizilimini içermektedir19.
Hücre taraması ve izolasyonu için dökme hidrojel kullanmak en basit ve basit formattır. Dökme fotobozunur hidrojeller, standart bir dik veya ters floresan mikroskobu ile görüntülenen 3-B hücre kültürü matrisinde hücreleri kapsüllemek için öncülleri şeffaf cam kapaklar üzerinde karıştırdıktan sonra hızla (25 dk) oluşur. Bu nedenle, yöntem mikrofabrikasyon kaynakları veya uzmanlığı olmayan yaygın mikrobiyoloji laboratuvarlarına çeviri potansiyeline sahiptir. Bu biçimin bir dezavantajı, hücrelerin üç boyutlu hidrojel boyunca rastgele yönlendirilmiş olmasıdır. Bu nedenle, hücreler daha yüksek büyütme hedefleri ile görüntüleme yaparken odak düzleminin dışında görünebilir ve hücre kolonileri birbirine çok yakın yönlendirilirse veya kolonilerin dikey bir kaplaması varsa ekstraksiyon zor olabilir. Açıklandığı gibi ince bir hidrojel (<13 μm) biriktirmek, bu dezavantajı azaltmak için kritik öneme sahiptir. Kırık çapraz ışık desenlerinde pozlama (Şekil 4B) burada tercih edilir, çünkü bu desen UV ışığına minimum maruziyete sahip hidrojel içermeyen hücrelerle sonuçlanır ve kaplama yoluyla kolayca kurtarılabilir.
Buna karşılık, bakteri hücreleri küçük kültür veya ortak kültür siteleri17 , 18,26olarak hizmet veren ayrı mikrowelllere bölündürken, microwell dizi formatı daha iyi kontrol edilen bir arayüz sağlar. Microwell boyut, perde ve yoğunluk standart fotolitografik teknikler kullanılarak tam olarak üretilmiştir. Dökme hidrojellerle karşılaştırıldığında, hücreler hidrojel boyunca rastgele dağılmadığı için, hücreler sadece önceden tanımlanmış yerlerde bulunduğundan, bakteriler daha yüksek özgüllük derecesine ve çapraz kontaminasyon şansına sahip mikrowell dizilerinden çıkarılabilir. Tohumlama çözeltisindeki bakteri hücrelerinin konsantrasyonu ve oranları, önceki raporlarda karakterize edilen bir tohumlama işlemi ile mikrowell inoculum miktarını ve bileşimini kontrol etmek için de değiştirilebilir26, kullanıcıya ekranın deneysel tasarımında esneklik sağlar. Microwell dizisi formatı ile taramanın birincil dezavantajı, mikrofabrikasyon için gereken ek zaman ve uzmanlıktır. Mikrowelllerin imalatının, malzeme maliyetleri ve temiz oda giderlerini içeren dizi başına ~ 10 $ 'a mal olduğu tahmin edildi. Ek olarak, mikrowells dizileri geleneksel olarak silikondan yapılır, bu da substratlar şeffaf olmadığından görüntüleme zorluklarına neden olabilir. Ayrıca, silikon yüzeyden yüksek miktarda ışık saçılım mikrowells içinde görüntüleme sınırlayabilir ve desenli aydınlatma aracından UV ışığı ile hidrojel maruziyeti sırasında desen çözünürlüğünü azaltabilir (Şekil 8A,B'degörülür). Bu tür sınırlamaları gidermek için şeffaf kuvars substratlarında benzer mikrowelller üretilmiştir27; ancak, bu imalat önemli ölçüde daha zordur. Kuyunun çevresini aydınlatan halka desenlerine maruz kalmak, UV maruziyetini en aza indirirken kuyulardan serbest hücreler salmak için tercih edilir.
Her iki formatta da ortaya çıkan en yaygın sorun, hidrojel şişmesi nedeniyle kültür sırasında hidrojelin alttaki substrattan çıkarılmasıdır. Bu dökme hidrojeller için bir sorunsa, kimyasal (MTPS) bağlantı tabakasındaki tiyol gruplarının taban cam kapak kapağının yüzeyindeki varlığı, yoğunluğu ve homojenliği uygun bir yüzey karakterizasyon tekniği (XPS, ATR-FTIR, AFM vb.) kullanılarak doğrulanmalıdır. Verimsiz yüzey fonksiyonelleşmesi nedeniyle yüzey tiyool gruplarının düşük yoğunlukları, substrat ve hidrojel arasında zayıf bir etkileşime yol açabilir. Düşük düzeyde yüzey tiyolasyonu meydana gelirse, MTPS çözeltisinin stabilitesi kontrol edilmelidir. MTPS tedavisinden önce temiz bir yüzey sağlamak için cam kaydırağın ilk temizliğinde dikkatli olunmalı ve MTPS yüzey reaksiyonunda susuz toluen kullanımından emin olunmalıdır (Protokol Bölüm 4). Mikrowell dizileri söz konusu olduğunda, yüzeyler tiyolated değildir ve hidrojeller bunun yerine, hidrojelleri silikon substrata bağlayan hidrojel ile kuyuların kısmi doldurulması yoluyla bağlanır17. Hidrojel müfrezesi bu sistemde bir sorunsa, daha güçlü bağlanmayı teşvik etmek için hidrojel'i substrata daha fazla tutturmak için diziye daha fazla mikrowell veya diğer mikro ölçekli özellikler kazınabilir.
Tekniğin her iki formatta da bir sınırlaması, hidrojellerin bakteri varlığında sınırlı stabilitesidir. A. tumefaciensgibi bazı bakterilerin, deney süresini sınırlayan 5-7 gün17,19boyunca hidrojelleri bozabileceği belirtilmiştir. Bakteriyel bozulma mekanizmalarının mevcut soruşturması devam etmektedir; diakrilat monomerlerden mevcut olan ester gruplarının, diğer sistemlerde belirtildiği gibi bakteri aracılı hidroliz ve/veya enzimatik bozulmaya maruz kaldığı varsayılır17. Daha kararlı hidrojel kimyaları geliştirmek, bakterilerin hidrojelde kalabileceği süreyi uzatacak ve ekranı daha yavaş büyüme oranlarına sahip mikroorganizmalara genişletecektir. İkinci bir sınırlama, her iki formatta da, hücre kurtarma ve ekstraksiyonu açık bir ortamda meydana gelir ve bu da dış kontaminasyona duyarlı olabilen nispeten yüksek ekstraksiyon hacimlerine (30-100 μL) neden olur. Bu nedenle, ekstraksiyon çözeltisi hacmini en aza indirirken hedef kolonilerden yeterli hücrenin bulunduğundan emin olmak için dikkatli olunmalıdır. Kaplama ve geri kazanım veya DNA materyalinin çıkarılması için yeterli hücre elde etmek için, dökme hidrojellerde hücrelerin en az 10 μm koloni çaplarına ulaşacak kadar uzun süre kültürlenmesi gerektiği gözlenmiştir. Hücre ekstraksiyonu için gerekli hacmi azaltmak için, bir mikroliter şırınga ve boru kullanmanın (Şekil 2) pipetlemeden daha verimli olduğu gözlenmiştir. Boru, izolelerin serbest bırakma noktasından daha doğru bir şekilde çekilmesini sağladı, daha az çözelti hacmi gerektirdi ve kirlenme olasılığını azalttı.
Gelecekteki çalışmalar, hidrojel mekanik özelliklerinin hücre büyümesi üzerindeki etkisinin anlaşılmasını içerir, çünkü bu hidrojellerin mekanik özellikleri çeşitli moleküler ağırlıkların uygun PEG tabanlı monomer öncüllerinin seçimi ile iyi kontrol edilir28ve mekanik etkileşimler muhtemelen bakteri davranışında önemli bir rol oynar29. Hidrojel malzemeler çeşitli farklı sistem ve cihazlara kolayca dahil edilebildiğinden, bu malzemenin mikroakışkan sistemlere entegrasyonuna da odaklanmaktadır. Bu, şu anda açık koleksiyon formatında gerekli olan geleneksel 30-100 μL hacimlere kıyasla, femtoliter'den picoliter hacimlerine ekstraksiyon çözümünü azaltacaktır. Daha küçük çözelti hacimleri potansiyel kontaminasyonu büyük ölçüde azaltır ve yaklaşımı tek hücreli izolasyon ve karakterizasyona doğru taşır.

Karmaşık ve heterojen bir ortamdan benzersiz davranışlara sahip hücrelerin izolasyonu biyolojide genetik bilgi elde etmek için temeldir1. Mikrobiyolojide, genomik bilgiler ile gözlemlenebilir fenotipik bilgiler arasında bağlantı gerektiren birçok uygulamada nadir veya benzersiz mikropların gözlemden sonra seçilmesi ve izolasyonu önem kazanmaktadır. Bu uygulamalar arasında mutant kütüphanelerden fenotipik olarak nadir suşların seçilmesi2, karmaşık mikrobiyal topluluklardan kilit taşı mikroorganizmalarının seçilmesi3,4ve izojenik popülasyonlardan fenotipik olarak nadir ancak önemli bakterilerin seçilmesi yer almaktadır. Canlı ancak kültüre dönüştürülemeyen hücrelerin (VBNC) bakteri popülasyonundan izolesi, VBNC fenotipine sahip hücrelerin genellikle 1:102 ila 1:10 5 oranlarında5 ,6'dabakteri popülasyonlarında gizlendiği ikincisinin önemli bir örneğidir. Bakteri izolasyonundaki yaygın zorluklar nedeniyle, birçok fenotipik olarak nadir mikroorganizma hakkında çok şey bilinmemektedir. Bu sınırlamalar, önce hedef hücreyi veya hücreleri bir karışımdan tanımlamak ve daha sonra aşağı akış moleküler analizi için bunları almak ve izole etmek için hücre izolasyon tekniklerine duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır7.
Hücre izolasyonunun en yaygın yöntemlerinden bazıları akış sitometrisi ve floresan aktif hücre sıralama (FACS)8, immünmanyetik ayırma9,10ve mikroakışkanlar11 'dir. Bu yalıtım yöntemleri yüksek değere sahip olsa da, kullanımlarını sınırlayan dezavantajları da vardır. Örneğin, FACS takip genomik analizi için tek hücreli düzeyde rutin mikrobiyal izolasyon sağlayabilir3, ancak genellikle kullanılabilirliği ve giderinin yanı sıra aşağı akış kontaminasyon sorunları ile sınırlıdır11. Mikroakışkan akış sitometrisi gibi mikroakışkan tabanlı yaklaşımlar, geleneksel akış sitometrisine kıyasla, gerekli numune hacminde önemli bir azalma sağlayan çok dikkat çekmiş12. Bununla birlikte, mikroakışkan cihazlardan bireysel veya küçük hücre koleksiyonlarının ayrılması ve alınması genellikle daha karmaşık bir kurulum ve cihaz tasarımı gerektiren zorlu bir sorundur13. Birçok mikroakışkan tabanlı yaklaşım, hücreleri bir cihazda girilmeden ve gözlemlenmeden önce genetik olarak karakterize edilir14fonksiyonel bir ekran gerçekleştirirken gözlenen benzersiz türlerin sayısını sınırlar. Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, birçok laboratuvarda yaygın kullanım için hücre taraması ve izolasyon için pratik olan hem yöntemlerin hem de malzemelerin daha fazla yenilendirilerek yenilendir.
Bu makale, bakteri taraması ve izolasyonu için yeni, malzeme tabanlı bir yaklaşım salamektedir. Yöntem, hücre kapsülleme, kültür, mikroskobik gözlem ve benzersiz fenotiplere sahip hedeflenen bakterilerin isteğe bağlı salınımı ve geri kazanımı için fotobozunur hidrojeller kullanır. Hidrojeller, her çapraz bağlantının o-nitrobenzyl grupları 15 içerdiği10 nmağ boyutu içerecek şekilde tasarlanmıştır. Malzeme, besin maddelerinin ve atık ürünlerin kültür için hücrelere ve hücrelerden yayılmasına olanak tanırken hücreleri gözlem için kapsüller veya hapsedir. Malzemenin dik bir mikroskopla desenli 365 nm UV ışık kaynağına maruzlenmesi, o-nitrobenzil gruplarının fotokopleajı yoluyla hidrojelin lokal olarak bozulmasını sağlar16,17. Bozulma, genomik ve potansiyel olarak proteomik ve transkriptomik analiz de dahil olmak üzere aşağı akış analizi için hücrelerin seçici olarak geri salınımını tetikler. Deneysel kurulum ve protokol nispeten basit, ucuz ve mikrobiyoloji laboratuvarlarına çeviriseldir. Sadece hidrojel oluşumu yoluyla hücre kapsüllemesi, yakalanan hücrelerin dik bir parlak alan ve floresan mikroskopla gözlemlenmesi ve geri alma için desenli bir UV ışık kaynağı ile ilgi çekici hücrelerin aydınlatılmasını gerektirir.
Taramaya yönelik bu materyal tabanlı yaklaşımın önemli bir avantajı, farklı tarama formatlarına uyarlanabilirliğidir. En temel formatında, malzeme dökme hidrojellerde heterojen bir hücre koleksiyonunu kapsülleyerek tarama için kullanılabilir. Hücreler daha sonra istenen fenotip için gözlenir ve genomik karakterizasyon için tek tek ilgi çekici hücreler çıkarılır. Daha ayrıntılı formatlarda, malzeme, cihazın istenen alanlarından hassas hücre salınımı ve alımı sağlamak için çip üzerindeki laboratuvar cihazlarına da entegre edilebilir. Her iki format da burada açıklanmıştır ve her ikisi de son zamanlarda yeni mikrobiyal tarama ve seçim uygulamalarınıetkinleştirdi 17,18,19. Yöntem burada model Gram-negatif organizmalar(Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) ve bir model Gram-pozitif organizma (Bacillus subtilis) ile gösterilmiştir ve çeşitli diğer bakterilere kolayca genişletilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>175617-25G</td>
			<td>&#62; 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox detergent powder</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>1104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Certified ACS Granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave SK300C</td>
			<td>Yamato Scientific</td>
			<td>18016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 1A1135</td>
			<td>Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td>1A1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield upright microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C614-500</td>
			<td>For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>0188-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: -30-60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Silicones Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Storage temperature: &#60; 32 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli ATCC 25922</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R19020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium microscope slides plain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td>Contains inhibitor, 30 wt% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incu-Shaker Mini</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>E5-0014-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 7-hydrate</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Avantor Performance Materials, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>ACS reagent, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen, compressed</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)</td>
			<td>NOF America Corporation</td>
			<td>PTE-100SH</td>
			<td>Sunbright-PTE-100SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>VWR Amresco Life Science</td>
			<td>K813-500ML</td>
			<td>Store between 15 &#176;C&#8211;30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon400</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>DSI-D-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>25 x 75 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>BioXtra, &#62; 98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505-250G</td>
			<td>BioUltra, for molecular biology, &#62; 99.0% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel thickness gage</td>
			<td>Precision Brand Products</td>
			<td>77739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-1L</td>
			<td>Anhydrous, &#62; 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td>For microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FS-110H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodegradable hydrogel interfaces for bacteria screening, selection, and isolation

Biyologlar uzun zamandır fenotip ve genotip arasındaki ilişkiyi anlamaya çalıştılar. Bu bağlantıyı daha iyi anlamak için, aşağı akış genetik analizi için mikroskobik hücre taramasını hücre izolasyonu ile yüksek saflıkta birleştirilen pratik teknolojiler geliştirmek çok önemlidir. Burada, heterojen hücre popülasyonlarından benzersiz büyüme fenotiplerine sahip bakterilerin taranır ve izolasyonu için fotobozunur poli (etilen glikol) hidrojellerin kullanımı açıklanmıştır. Yöntem, hücreleri hidrojel ile kapsüllemek veya içine almak, ardından kültür, mikroskobik tarama, daha sonra hidrojel bozulmasının mekansal kontrolü ve seçilen hücrelerin geri alma için bir çözeltiye salınması için yüksek çözünürlüklü bir ışık desenleme aracının kullanılmasına dayanır. Farklı ışık desenlerinin uygulanması, çıkarılan hücrenin morfolojisi üzerinde kontrol sağlar ve izolatlardaki DNA hasarını azaltmak için halkalar veya haçlar gibi desenler, en az doğrudan UV ışığına maruz kalan hücreleri almak için kullanılabilir. Ayrıca, ışık desenleme aracı, çeşitli bozulma ve hücre salınım hızlarına ulaşmak için ayarlanabilir bir ışık dozu sunar. Mikron ölçeğinde uzamsal hassasiyetle hücre alımını sağlayarak yüksek çözünürlükte bozulmaya izin verir. Burada, bu malzemenin hem dökme hidrojellerden hem de çip üzerindeki mikrofabrik laboratuvardan bakterileri taramak ve almak için kullanımı gösterilmiştir. Yöntem ucuz, basittir ve mutant kütüphanelerden nadir büyüme profillerine sahip bakteri suşlarının izolasyonu ve genomik karakterizasyonlar için acil fenotipli bakteri konsorsiyumlarının izolasyonu da dahil olmak üzere mikrobiyolojide yaygın ve gelişmekte olan uygulamalar için kullanılabilir.

UV ışığının hücre salınımı için kontrollü hidrojel bozulmasını tetikleme yeteneğini araştırmak için, hidrojeller ilk olarak bakteri olmadan tiyolated coverlips üzerinde kapsüllendi. Her hidrojel, farklı yoğunluklarda ve maruz kalma sürelerinde üç ayrıştırılmış ışık çemberi desenine maruz kaldı. Yüzde jel bozulması, her ışık yoğunluğunda UV ışığına maruz kaldıktan sonra hesaplandı ve maruz kalma süresi daha sonra floresan görüntüleme için floresan-5-maelimide boyası ile kolye tiyol gruplarının birleştirilmesiyle ölçüldü19,24. Bu iki parametrenin hidrojel bozulmasına nasıl etki ederek etkilediğine dair temsili bir örnek Şekil 3'te gösterilmiştir. Belirgin olduğu gibi, desenli aydınlatma aracı tarafından sağlanan desenli ışık, hidrojel bozulmasının sadece az sayıda hücrenin salınmasını mümkün kılacak bir çözünürlükte mekansal-zamansal kontrolünü sağlar.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig03.jpg"> Şekil 3: Hidrojel bozulması üzerinde kontrol. UV ışık dozu ve elde edilen hidrojel bozulma oranı desenli aydınlatma aracı ile ayarlanabilir. (Giriş) Desenli hidrojel bozulması için iki farklı ışık yoğunluğu seçildi. 365 nm UV ışığa maruz kaldıktan sonra, hidrojeller floresan görüntüleme için floresan-5-maleimid ile etiketlendi. Fattahi ve ark.19 Telif Hakkı 2020 Amerikan Kimya Derneği'nin izniyle yeniden basıldı (uyarlandı). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hücre ekstraksiyonu için hücre salınımını araştırmak için farklı ışık desenleri kullanılmıştır (Şekil 4). Burada, Agrobacterium bakteri hücreleri tiyolated cam kapaklar üzerinde dökme hidrojellere kapsüllendi, daha sonra mikro ölçekli koloniler halinde kültüre edildi. Hidrojeller daha sonra brightfield mikroskopisinde incelendi ve hedeflenen mikrokolonlar çeşitli UV ışık desenlerine maruz kaldı. Farklı maruz kalma örüntülerinin salınan hücrelerin morfolojisini etkilediği gözlendi. Bu, çeşitli uygulamalar için potansiyel olarak faydalıdır. Örneğin, hedef koloninin etrafındaki bir halka deseninin açığa çıkması, hala koruyucu bir PEG hidrojelinde kapsüllenmiş ve hücreleri koruyabilen ve kolay aşağı akış saflaştırması sağlayabilen doğrudan UV ışığına maruz kalmadantümkoloninin salınmasıyla sonuçlanır. Buna karşılık, koloninin bir kısmını veya tamamını UV ışığına maruz kalarak, hücreler birleştirilmiş hücre kümeleri (Şekil 4B) veya serbest, tek tek hücreler (Şekil 4C) olarak çıkarılabilir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig04.jpg"> Şekil 4: Çıkarılan hücrelerin morfolojisi üzerinde kontrol. (A) Peg matrisinde korunan tüm hücre kolonisini serbest bırakmak için halka deseninin kullanılması. (B) Agregalarda hücre salınımı için kırık bir çapraz desen kullanımı. (C) Tek tek hücreleri serbest bırakmak için çapraz desen kullanımı. Fattahi ve ark.19'dan izin alınarak yeniden basıldı (uyarlandı) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Kapsülleme protokolünde kritik olan, hem hücre tohumlama yoğunluğu hem de hidrojel kalınlığıdır, çünkü bu parametrelerin her ikisi de gözlem için hidrojelde bulunan hücre sayısını etkileyebilir. Göstermek için, A. tumefaciens hücre örnekleri ince ara parçalar (12.7 μm) veya kalın ara parçalar (40 μm) kültürlü kullanılarak iki farklı kalınlıkta hidrojel içine kapsüllendi ve belirlenen protokolleri izleyerek görüntülendi. Daha ince hidrojeller, minimum koloni çakışmasının gözlendiği hidrojel boyunca 90 koloni / mm2 mikrokolony yoğunluğuna neden oldu (Şekil 5A). Buna karşılık, 12,7 μm'den büyük hidrojel kalınlıkları dikey yönde üst üste binen kolonilerin oluşmasına neden oldu (Şekil 5B), bu da birden fazla koloninin çıkarılmasına neden olabilir. Üst üste binen koloniler, ışık deseninin iki boyutlu doğası nedeniyle ekstraksiyon sırasında çapraz kontaminasyona neden olabilir. Örneğin, bir üst koloni hedeflenebilirken, alttaki bir koloni de onunla çıkarılır (Şekil 5C). Bu nedenle, hidrojel hazırlama için 12,7 μm aralayıcı kullanılması önerilir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig05.jpg"> Şekil 5: Hidrojel kalınlığı ekstraksiyon saflığını etkiler. (A) Hidrojel oluşumu için 12,7 μm kalınlığında aralayıcılar kullanılarak, bir 10x odak düzlemi içinde koloniler oluşur. (B) 12,7 μm'den daha büyük kalınlıklara sahip aralayıcılar kullanılırsa kolonilerin yer paylaşımı 10 kat büyütmede gözlemlenebilir. (C) Hücre salınımı sırasında kolonilerin yer paylaşımı ile çapraz kontaminasyon meydana gelebilir: (i) hedeflenen bir hücre kolonisini serbest bırakmak için bir halka deseni kullanılır, (ii) hedeflenen hücre kolonisi hidrojelden ayrılır ve (iii) hedeflenen koloninin altındaki ışığa maruz kalma sırasında ikinci bir altta yatan koloni görülür. Bu koloni de çıkarılır ve çapraz kontaminasyona neden edilir. Fattahi ve ark.19 Telif Hakkı 2020 Amerikan Kimya Derneği'nin izniyle yeniden basıldı (uyarlandı). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
UV ışığı ile bakterilere potansiyel hasar göz önüne alındığında, çeşitli UV ışık mikropatternlerinin hücre canlılığı üzerindeki etkisi model, Gram-pozitif bakteri (B. subtilis) ve model, Gram-negatif bakteriler (E. coli) kullanılarak daha fazla çalışılmıştır. Her biri dökme hidrojeller içinde kapsüllendi ve hidrojel ile uyumluluklarını doğrulayarak standart protokollere göre mikro ölçekli kolonilere kültürlendi. Eşdeğer boyutlardaki hedeflenen mikrokolonlar (26 ± 1 μm çapı), daha sonra sabit bir ışık dozuna (168 mJ/ mm2)maruz kaldı, tüm mikrokolonları UV ışığına maruz bırakan daire desenleri veya hücrelere ışık maruziyetini en aza indirmek için sadece hidrojel kenarlarını bozan çapraz desenler şeklinde. Hücreler daha sonra kurtarıldı ve her koloniden kurtarılan CFU/mL'yi ölçmek için kaplandı. Hücre iyileşme düzeyinde anlamlı bir fark bulunmadı(Şekil 6A). Çıkarılan hücrelerin saflığını daha fazla araştırmak için DNA, E. coli örneklerinden çıkarıldı ve bir UV-Vis spektrofotometresi kullanılarak analiz edildi. Her iki model için de DNA kalite seviyeleri, genomik dizileme için ideal aralıkta olan1.8 ile 2.0 ( Şekil 6B ) arasında bir A260/ A280aralığına girer. Bu, açıklanan koşullar altında serbest bırakılmak için kullanılan UV desenlerinin, dökme hidrojellerden veya ekstraksiyondan sonra genomik DNA kalitesinden kurtarılan canlı hücrelerin miktarı üzerinde minimum etkiye sahip olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig06.jpg"> Şekil 6: Farklı ışık maruziyet kalıplarının, dökme hidrojellerden salınan bakterilerin hücre canlılığı ve DNA kalitesi üzerindeki etkisi. (A) Çapraz desenler ve daire desenleri kullanılarak ekstraksiyondan sonra hem E. coli hem de B. subtilis için hücre kurtarma seviyeleri. Bu deney için, her koloniden salınan hücre sayısının eşdeğer olduğundan emin olmak için aynı çapa (26 μm ± 1 μm) sahip küresel kolonilerden ekstraksiyon yapıldı. Çıkarılan çözeltiler daha sonra her desenden elde edilen CFU/mL'yi hesaplamak için kaplandı. İstatistiksel analizde hem E. coli hem de B. subtilis için çapraz ve daire desenlerinden elde edilen CFU/mL'de anlamlı bir fark olmadığı tespit edildi (P değeri > her iki suş için 0.05, n= 6). (B) Çapraz ve daire desenleri kullanılarak izole E. coli hücreleri için DNA kalitesinin spektrofotometrik nicelemesi. Burada istatistiksel analizde kullanılan desenler için DNA kalitesinde anlamlı bir fark görünmedi (P değeri > 0.05, n = 6) (C) Çapraz ve daire desenlerine maruz kalan eşit çaplara sahip kolonilerin Brightfield görüntüleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Microwell dizileri, dökme hidrojellere kıyasla daha kontrollü tarama özellikleri sunan alternatif, çip üzerinde laboratuvar tarama arayüzü sağlar. Örneğin, microwell dizileri, inoculumdaki hücre sayısının kontrol edilebildiği ayrı kültür alanlarına bakterilerin tohumlanmasını sağlar. Mikrowelllerin derinlik ve çap gibi geometrik özellikleri de standart mikrofabrikasyon yöntemleri ile kontrol edilir. Bu faydalarla, mikrowelller mekansal hapsetme altında bakteri büyümesini incelemek için yararlı olmuştur26ve en son mikro ölçekli18'debir araya geldiğinde farklı bakteri türleri arasındaki simbiyotik ve antagonistik etkileşimlerin keşfi için . 16S amplicon dizilimi gibi genomik analizler için kuyulardan hücresel ekstraksiyon bu uygulamalar için kritik öneme sahiptir. Aynı hidrojel malzeme kullanılarak, UV ışığı daire veya halka desenleri olarak ilgi çekici hücreler içeren bir kuyu üzerinde maruzkalınabilir. İkincisi, hücrelerin doğrudan ışınlanmasını önlemek için sadece mikrowell çevresinde hidrojel bozulmasını sağlar. Bunu göstermek için, mCherry'yi ifade eden A. tumefaciens hücreleri kuyulara tohumlandı, hidrojel daha sonra mikrowell dizisine bağlandı. Hücreler kültüre edildi ve daha sonra daire veya halka desenleriyle ışınlandı. Membran daha sonra floresan-5-maleimid boya ile boyandı. İki renkli floresan görüntüler, hem membran hem de kuyulardaki hücrelerin her iki ışınlama deseni için çıkarıldığını ortaya koydu17. Dökme hidrojel formatının aksine, buradaki hücre ekstraksiyonu sadece hücre kümeleri şeklinde gözlenmiştir18.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig07.jpg"> Şekil 7: Microwell dizilerinden hücre izolasyonu üzerinde ışık deseni etkisini gösteren temsili konfokal mikroskopi görüntüleri. (A) Tohumlama ve kültürden sonra bakteri (kırmızı) içeren 40 μm çapında mikrowelller. (B) Daire ve halka desenleri (mavi) kullanarak ışığa maruz kalma. (C) Azalan kırmızı floresan, hücrelerin ışınlanmış kuyulardan çıkarıldığını gösterir. (D) Işınlamadan sonra membranların ve bakterilerin iki renkli floresan görüntüsü, hem hidrojel (yeşil) hem de bakterilerin (kırmızı) hedef kuyulardan çıkarıldığını gösterir. (E) Z-yığını, hedef kuyuların iki renkli floresan görüntüsü. (D) rengindeki kırmızı çizgi (E) içinde görüntülenmiş xz düzlemini, (E) içinde yeşil çizgi ise (D) içinde görüntülenmiş xy düzlemini gösterir. Görüntülerdeki örnekler (C-E) serbest bırakılan hücrelerin çıkarılması için yıkandı, daha sonra düzeltildi ve görüntülendi. Ölçek çubuğu = 40 μm. Van der Vlies ve ark.17'denizin alınarak yeniden basıldı (uyarlandı). Telif Hakkı 2019 Amerikan Kimyasal Soceity. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu formatta ekstraksiyondan sonra bakteri hücresi canlılığını ve DNA kalitesini ölçmek için, B. subtilis ve E. coli hücreleri tohumlandı, kültürlendi ve daha sonra daire ve halka desenleri kullanılarak mikrowell dizilerinden serbest bırakıldı (Şekil 8A, B). Serbest bırakılan hücreler daha sonra ATGN agar plakaları üzerine kaplandı ve çıkarılan hücrelerin DNA kalitesi ölçüldü. Her ekstraksiyon sırasında tutarlı sayıda hücrenin bulunduğundan emin olmak için, benzer floresan yoğunluklarına (~6000 A.U.) sahip mikrowelller ve bu nedenle benzer sayıda hücre salınım için hedeflenmiştir. Daire deseni kullanılarak çıkarılan canlı hücrelerin sayısı, her iki bakteri için halka deseni kullanılarak çıkarılan canlı hücrelerin sayısından önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 8C). Ayrıca, DNA kalite seviyeleri her iki bakteri için daire ve halka desenleri arasında önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 8D). Bu nedenle, dökme hidrojellerdeki bulgulara benzer şekilde, UV ışığının burada belirtilen yoğunlukta ve sürede uygulanması, mikrowell dizilerinden çıkarılan hücrelerin canlılığı ve DNA kalitesi üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahipti. Bu bulgular, canlı bakteri hücrelerinin aşağı akış analizi için mikrowelllerden en az hasarla seçici olarak alınabileceğini göstermektedir.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig08.jpg"> Şekil 8: Farklı ışık maruziyet kalıplarının mikrowell dizilerinden salınan bakterilerin hücre canlılığı ve DNA kalitesi üzerindeki etkisi. (A,B) Hem E. coli hem de B. subtilisiçin, 10 μm mikrowells hücre ekstraksiyonu için daire desenleri ve halka desenleri kullanılmıştır. Hücre ekstraksiyonu için yapılan bu deneyde 10 μm çapında daire deseni ve iç çapı 10 μm, dış çapı 20 μm olan halka deseni kullanılmıştır. Her mikrowell'den salınan hücre sayısının aynı olmasını sağlamak için aynı çaplara sahip mikrowelller kullanıldı. (C) Çıkarılan çözeltiler daha sonra her pozlama deseninden elde edilen CFU/mL'yi hesaplamak için kaplanmıştır. İstatistiksel analizde hem E. coli hem de B. subtilis için daire ve halka deseninden elde edilen CFU/mL'de anlamlı bir fark olmadığı tespit edildi (P değeri > her iki suş için 0.05, n = 6). (D) Spektrofotometri, daire ve halka desenleri kullanılarak hem E. coli hem de B. subtilis hücrelerinin DNA kalitesini ölçmek için kullanılmıştır. Burada istatistiksel analizde kullanılan desenler için DNA kalitesinde anlamlı bir fark olmadığı (P değeri > 0.05, n = her iki suş için 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tamamlayıcı Şekil 1: Mikrowell dizilerinin tasarımı ve imalatı. (A) Silikon gofretler üzerinde mikrowell dizileri imal etmek için standart mikrofabrikasyon teknikleri uygulanmıştır. (B) Her substrat, 20 μm derinlik ve 30 μm pitch ile 7 x 7 dizi 10μm çapında kuyulardan oluşuyordu. (C) Her dizi 225 mikrowell'den oluşuyordu. Bu rakam Barua ve ark.18'den değiştirilmiştir. Telif Hakkı 2021 Frontiers Media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation at JoVE.com

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Yüksek çözünürlüklü bir ışık sıvazlama aracı kullanarak bakteri hücrelerini izole etmek için fotobozunur hidrojellerin kullanıldığı bildirilmektedir. Sürecin temel deneysel prosedürleri, sonuçları ve avantajları gözden geçirilmiştir. Yöntem, heterojen topluluklardan veya popülasyonlardan nadir veya benzersiz işlevler gösteren hedeflenen bakterilerin hızlı ve ucuz izolasyon edilmesini sağlar.

Bakteri Taraması, Seçimi ve İzolasyonu için Fotobozunur Hidrojel Arayüzleri

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Bu protokol, hücreleri genomik karakterizasyon için tarama arayüzlerinden hızla izole etmek için tasarlanmıştır ve bu yetenek, makroskopik olarak gözlemlenebilir hücre özelliklerini genomik bilgilerle birleştirebildiği için önemlidir. Tarama arayüzlerinden hedeflenen bakteri hücreleri, bu teknik kullanılarak operasyonel olarak basit bir şekilde yüksek uzamsal konumla izole edilebilir. Hidrojeller diğer tarama arayüzlerinde uygulanabilir.Hidrojel malzeme, hücrelerin mikroakışkan cihazlardan isteğe bağlı olarak alınması için mikroakışkan kanallara kolayca dahil edilebilir. Çapraz bağlama tamponu istenen hücre yoğunluğu ile aşılayarak başlayın. Çapraz bağlama tamponunun 12,5 mikrolitresini ve PEG ONB diakrilit çözeltisinin 5,6 mikrolitresini ekleyerek hidrojel öncül çözeltisini 0,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın.Ve son olarak, karışıma 6.9 mikrolitrelik forearm PEG tiyol çözeltisi ekleyin. Hidrojel öncül çözeltisinde hücre kapsülleme için, tiyolated baz kapakları temiz bir Petri kabına yerleştirin ve kapakçık iki karşı tarafına iki aralayıcı yerleştirin. Aralayıcıları Petri kabına bantlayarak taban kapak kapağındaki araları sabitlayın.Reaktif olmayan perfloroalkylated cam kaydırağına öncü çözeltinin istenen hacmini ekledikten sonra, slaydı taban kapak kapağına yerleştirin ve hidrojel oluşumunun oda sıcaklığında 25 dakika boyunca tamamlanmasını bekleyin. Jelleşme tamamlandıktan sonra, perfloroalkylated cam slaydı yavaşça çıkarın. Substratı antibiyotikle desteklenmiş ATGN ortamı içeren 60 ila 15 milimetre Petri kabına yerleştirin.Mikrowell dizisi substratı üzerinde 0.1 OD 600 ile bakteri hücresi süspansiyonlarının tohum 700 mikrolitresi ve daha önce gösterildiği gibi hidrojel öncül çözeltisini pH sekiz fosfat tamponlu salin ATGN 12.5 mikrolitre kullanarak yapmak. Pipet 12.5 reaktif olmayan perfloroalkylated cam slayt üzerinde öncü çözeltinin mikrolitreleri ve hücreler ile aşılanmış mikrowell dizisi substratının iki karşı tarafına iki adet 38 mikrometre çelik ara parça yerleştirin. Daha sonra perfloroalkylated cam kaydırağı öncü çözelti damlacığı ile ters çevirin ve mikrowell substratının ortasına bir damlacık yerleştirin.Hidrojel oda sıcaklığında 25 dakikalık bir inkübasyondan sonra oluştuğunda, cam slaydı mikrowell substratından hafifçe çıkarın ve substratı antibiyotikle desteklenmiş ATGN ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin. Örneği bir PDMS tutucusuna yerleştirin ve numune dehidrasyonunu önlemek ve serbest bırakılan hücreler için bir taşıyıcı çözüm sağlamak için tanımlanan ortamı numunenin üzerine ekleyin. Kalibrasyon aynasını yerine getirdikten sonra, hidrojel veya microwell dizisindeki kolonilerin keskin bir görüntüsünü elde etmek için mikroskop odağını ayarlayın ve kolonileri veya ilgi çekici kuyuları tanımlamak için inceleyin.Burada, kamera görünümü hücre çıkarma için farklı desenleri test etmek ve tanımlanan deseni kaydetmek için numunenin içindeki kolonileri gösterirken ışık desenlerini tasarlayın. Ardından oturum denetimi bölümünü seçin, desenli aydınlatma aracı ürün adıyla başlıklı sekmenin altına kaydedilmiş sırayı ekleyin. İstediğiniz pozlama konumunu görüntülemek ve ayarlamak için deseni uyarma seçeneğini belirleyin.Ardından, LED kontrol sekmesi altında ışık yoğunluğunu %60'a ve pozlama süresini 40 saniyeye ayarlayın ve pozlama işlemini başlatın. Hücre salınımını sağlamak için hidrojel bozulmasını gerçek zamanlı ve Brightfield modunda izleyin. Serbest bırakılan hücreyi toplamak için mikroskop filtresini Brightfield'dan TRITC'ye değiştirerek numunenin açıkta kalan alanını çıplak gözle görselleştirin.Açık alan yerleştirildikten sonra, borunun ucunu ışınlanmış noktaya yerleştirin, ardından hücre alımını gerçek zamanlı olarak izlemek için mikroskop filtresini tekrar Brightfield olarak değiştirin. Serbest bırakılan hücreleri içeren 200 mikrolitre çözeltiyi dikkatlice çekmek ve çözeltiyi DNA analizi veya kaplama için 1,5 milimetrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için borunun diğer ucuna bağlı şırıngayı kullanın. Serbest bırakılan hücrelerin morfolojisini etkileyen dökme hidrojellerden hücre ekstraksiyonu için farklı UV ışık mikro desenleri kullanılmıştır.Halka deseninde UV maruziyeti, koruyucu bir PEG hidrojelinde kapsüllenmiş tüm koloninin serbest bırakılmasına neden oldu. Buna karşılık, koloninin bir kısmını veya tamamını UV ışığına maruz kalarak, hücreler agrega hücre kümeleri veya serbest bireysel hücreler olarak çıkarılabilir. Hücre tohumlama yoğunluğu ve hidrojel kalınlığı hücre kapsülleme için önemlidir.Daha ince hidrojeller, minimum koloni üst üste binen mikro kolonilerle sonuçlanırken, artan kalınlıktaki hidrojeller üst üste binen kolonilerle sonuçlandı ve bu da birden fazla koloninin çıkarılmasına neden olabilir. Üst üste binen koloniler, ışık deseninin iki boyutlu doğası nedeniyle ekstraksiyon sırasında çapraz kontaminasyona neden olabilir. Üst koloni hedeflendiğinde, alttaki koloni de onunla birlikte çıkarıldı.Çeşitli UV ışık mikro desenlerinin hücre canlılığı üzerindeki etkisi de değerlendirildi. Mikro koloniler dairesel veya çapraz desende kontrollü dozlarda UV ışığına maruz kaldıklarında hücre iyileşmesi ve DNA saflığı etkilenmedi. Hücreler, dairesel ve halka deseninde ışınlama yapıldıktan sonra hücrelerin ilgili desende çıkarıldığı temsili konfokal mikroskopi görüntülerinden belirgin olan bu yaklaşım kullanılarak microwell dizilerinden başarıyla alınmıştır.Mikrowell dizilerinden çıkarıldıktan sonra hücre canlılığı ve DNA miktarı değerlendirildi. Maruz kalma şekilleri ne canlı hücre sayısını ne de DNA kalitesini etkiledi, bu da uygulanabilir bakteri hücrelerinin mikroüllerden en az hasarla seçici olarak alınabileceğini ve DNA'larının aşağı akış genomik analizi için yüksek saflıkta izole edilebileceğini gösterdi. Perfloroalkylated kapak sapını çıkarmadan önce her zaman hidrojel oluştuğunu kontrol edin.Hidrojel biriktirme için ara maddeleri yerleştirmek ve hücrelerin çıkarılması için boruları kullanmak için hassasiyet ve bakım gereklidir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Hücre yüklü hidrojel uyarıcı hücresel davranışları için degrade zorlanma çip

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Açık Kaynak Mikroplaka Uyumlu Aydınlatma Panelleri Uygulamaları

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Periferik Nöromühendislik için Grafen Bazlı 3D Biyohibrid Hidrojel Biyomürekkebin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

Yeni Nesil Gen Terapisi Vektörlerinin Mühendislik, Barkodlama ve Adeno-İlişkili Virüs (AAV) Kapsid Varyantlarının Taranması Yoluyla İzolasyonu

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...