Name: stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

يتم دعم هذا العمل من خلال منح من المعهد الوطني للصحة (NIH) 5P20GM121310 و R61NS115161 و UG3NS115608.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex.">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice.">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li><li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning.">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li><li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information.">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINscope,+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations.">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987 (2020).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice.">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration.">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li><li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior.">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery.">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li><li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient-index+optics:+A+review.">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals.">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging.">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li><li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation.">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173 (2019).</li><li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice.">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li><li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice.">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li><li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases:+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy.">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).</li><li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre/loxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome.">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li><li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-loxP-mediated+recombination:+General+principles+and+experimental+considerations.">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li></ol>

لا يفيد المؤلفون بأي مصالح مالية متنافسة.

السؤال المركزي في علم الأعصاب هو فهم كيفية تشفير الديناميكيات والدوائر العصبية للمعلومات وتخزينها ، وكيف يتم تغييرها في أمراض الدماغ. باستخدام منظار مصغر في الجسم الحي Ca2+ نظام التصوير ، يمكن مراقبة النشاط العصبي الفردي من عدة مئات من الخلايا العصبية داخل الدائرة الدقيقة المحلية في وقت واحد من يتصرف بحرية. هنا ، يتم وصف بروتوكول جراحي مفصل للحقن الفيروسي وزرع عدسة GRIN لإعداد القوارض لتصوير دماغ عميق في الجسم الحي Ca2+ عبر نظام تسجيل مصغر تم تطويره خصيصا. يوضح الجدول 1 مقارنات نظام miniscope الخاص بنا مع أنظمة miniscope الأخرى المتاحة تجاريا والمصممة خصيصا 7,8,9,10,11,13,25,26. تجدر الإشارة إلى أن زرع عدسة GRIN باستخدام البروتوكول الجراحي الحالي متوافق مع أي أنظمة تصوير تجارية أو مصممة خصيصا بفوتون واحد وفوتون اثنين لدماغ عميق في الجسم الحي تصوير الكالسيوم.
من الحقن الفيروسي إلى الحصول على البيانات من miniscope في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، يستغرق الإجراء التجريبي بأكمله ما لا يقل عن 2 أشهر لإكماله. إنها عملية معقدة وكثيفة العمالة. يعتمد النجاح النهائي للتجربة على عوامل متعددة ، بما في ذلك الاختيار السليم ل GECIs ، وحقن الفيروس بدقة في منطقة الدماغ المستهدفة ، والتعبير الفيروسي الكافي في السكان العصبيين المطلوبين ، وزرع عدسة GRIN بدقة في الموقع المطلوب ، والشفاء الكافي من العمليات الجراحية ، وكذلك ، ما إذا كان الالتهاب الحاد يحدث بعد الجراحة ، وما إذا كان سلوك الحيوان يتأثر بشدة بالعمليات الجراحية ، وهلم جرا.
وتشمل خطوتان حاسمتان الحقن المجسمة للفيروس وزرع عدسة GRIN. لغرض العرض التوضيحي ، تم إجراء الحقن المجهري المجسمة في الماوس mPFC ، مع تشفير الفيروس المرتبط بالغدي (AAV1) GCaMP6f تحت سيطرة مروج CaMKII الذي يقوم بتسمية الخلايا العصبية الهرمية بشكل انتقائي في mPFC. تم اختيار GCaMP6f لأنه واحد من أسرع مؤشرات الكالسيوم وأكثرها حساسية مع وقت نصف اضمحلال يبلغ 71 مللي ثانية15. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعبير الفيروسي AAV ل GCaMP6f طويل الأمد (أي عدة أشهر) ، مما يجعله مثاليا لأداء التصوير المتكرر في الجسم الحي Ca2 + على مدى فترة طويلة للدراسات الطولية في نماذج الفئران للأمراض العصبية التنكسية27. يمكن تكييف بروتوكول الجراحة الحالي لاستهداف مجموعات الخلايا المختلفة في أي منطقة دماغية أخرى. تسمح العديد من الأدوات الفيروسية المتاحة بوضع علامات انتقائية على مجموعات عصبية محددة في منطقة الدماغ المطلوبة في العمر المطلوب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للباحثين الاستفادة من نظام إعادة تركيب Cre-LoxP والعديد من نماذج الفئران المعدلة وراثيا المتاحة لإجراء تعديلات وراثية ودراسة نتائج الدوائر السلوكية والعصبية28,29.
إحدى السمات الفريدة للبروتوكول المقدم هي أن الشفط الآلي لأنسجة المخ طبقة تلو الأخرى تم إجراؤه قبل زرع عدسة GRIN (قطرها 1 مم). ويتحقق ذلك من خلال إبرة 27 G متصلة بنظام فراغ ، يتم التحكم فيها بواسطة ذراع روبوتية مصممة خصيصا وبرنامج23. استنادا إلى تجربتنا ، تولد هذه الطريقة سطحا موحدا لعدسة GRIN للاتصال بها وتسبب ضررا أقل للأنسجة المجاورة من شفط الأنسجة اليدوي23. لهذا السبب ، يجلب هذا الإجراء ميزة واضحة لعدسات GRIN ذات القطر الأوسع نسبيا (على سبيل المثال ، 1 مم). ومع ذلك، قد لا يكون شفط الأنسجة ضروريا لزرع عدسة GRIN بقطر أصغر (0.5 مم أو 0.25 مم). بدلا من ذلك ، يمكن زراعته مباشرة على طول المسار الرائد المصنوع بإبرة 30 G21.
إلى جانب الخطوتين الحاسمتين اللتين تمت مناقشتهما أعلاه ، يجب النظر بعناية في العديد من العوامل الأخرى من أجل نجاح العملية. (1) يجب تعقيم جميع الأدوات التي تتصل بالدماغ لمنع العدوى. (2) يجب إجراء جميع خطوات الجراحة لتقليل الضرر الذي يلحق بالدماغ لمنع المزيد من الالتهاب وتكوين الأنسجة الندبية المفرطة. (3) يجب النظر بعناية في جرعات التخدير التي تعطى في البداية ويتم الحفاظ عليها أثناء الجراحة ، وخاصة تلك التي تدار داخل الصفاق. يمكن تعديل جرعات التخدير وفقا لسلالات الفئران المختلفة ، حيث قد يكون بعضها أكثر عرضة للإصابة. (4) يجب مراقبة حالة الفأر باستمرار أثناء الجراحة. أخيرا ، (5) تحتاج الفئران إلى المراقبة بانتظام بعد الجراحة ، حيث قد تحدث العديد من المضاعفات بعد الجراحة.
على الرغم من إزالة جزء من أنسجة المخ من جانب واحد خلال خطوة زرع عدسة GRIN ، إلا أننا لم نلاحظ أي عجز سلوكي واضح 7,12. يبلغ وزن المنظار الصغير حوالي 2 جرام ، وقد تم تصميم الكابل خصيصا لجعله خفيفا ولضمان قدرة الماوس على حمله بسهولة. يتم توصيل المنظار الصغير والكابل فقط بالحيوان قبل التصوير في الجسم الحي وفصلهما بعد التصوير. عادة ما لا تستغرق عملية التصوير بأكملها أكثر من 30 دقيقة. لذلك ، لا تمنع هذه الأجهزة الماوس من التصرف بحرية. تحتاج خطوات التثبيت وإزالة المنظار المصغر إلى تخدير قصير (أقل من 2 دقيقة) مع الأيزوفلوران لغرض تقييد الحيوان. عادة ما نسمح للفأر بالتعافي من التعرض القصير للأيسوفلوران لمدة 30 دقيقة قبل إجراء التصوير في الجسم الحي. لقد أجرينا تصوير الكالسيوم المصغر في الجسم الحي مرة واحدة في الأسبوع لبضعة أسابيع دون ملاحظة أي تأثير على صحة الفئران والسلوك الاجتماعي للفأر12.
أحد القيود الرئيسية لنظام تسجيل المنظار المصغر الحالي هو الحاجة إلى توصيل المجهر بكبل للحصول على البيانات. يؤدي وجود الكابل في بعض الأحيان إلى تقييد أداء مهمة الماوس ويحد من تسجيل واحد في كل مرة. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير منظار لاسلكي مصغر25,26. سيؤدي ذلك إلى توسيع أداء المهمة والسماح بالتصوير المتزامن في الجسم الحي من متعددة في مجموعة. علاوة على ذلك ، فإن تطوير GECIs أكثر حساسية مع أطوال موجية قابلة للفصل الطيفي جنبا إلى جنب مع منظار مصغر مزدوج اللون سيوفر إمكانيات أكثر إثارة لأبحاث علم الأعصاب.

تعد إشارات Ca2+ داخل الخلايا منظما أساسيا لنمو الخلايا وانتشارها وتمايزها والهجرة ونسخ الجينات وإفرازها وموت الخلايا المبرمج1. في الخلايا العصبية ، يتم التحكم بدقة في إشارات Ca2+ لأن نمطها المكاني الزماني يرتبط بوظائف حاسمة مثل استثارة الغشاء ، وإطلاق الناقل العصبي ، واللدونة المشبكية2.
يعد تصوير الكالسيوم في الجسم الحي تقنية قوية يمكن استخدامها لفك تشفير تمثيل الدائرة العصبية كعنصر أساسي في السلوكيات الحيوانية الطبيعية ، وتحديد الأنشطة العصبية الشاذة في النماذج الحيوانية لاضطرابات الدماغ ، وكشف الأهداف العلاجية المحتملة التي قد تطبيع هذه الدوائر المتغيرة. الاثنان الشائعان في أنظمة تصوير الكالسيوم في الجسم الحي هما المجهر الفلوري للمسح بالليزر ثنائي الفوتون3،4،5،6 والتنظير المجهري المصغر المثبت على الرأس (miniscope) 7،8،9،10،11،12،13 . يوفر المجهر التقليدي ثنائي الفوتون مزايا قيادية مثل دقة أفضل وضوضاء أقل وتبييض ضوئي أقل. ومع ذلك ، يطلب من التجارب أن تكون ثابتة الرأس ، مما يحد من دراسات السلوك التي يمكن إجراؤها3،4،5،6. على النقيض من ذلك ، فإن نظام المنظار المصغر المثبت على الرأس صغير ومحمول ، مما يجعل من الممكن دراسة مجموعة واسعة من اختبارات السلوك باستخدام تتصرف بحرية7،8،9،10،11،12،13.
هناك مؤشران رائدان ل Ca2+ ، وهما المؤشرات الكيميائية5,14 ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) 15,16. تم تسهيل تصوير Ca2+ باستخدام GECIs عالية الحساسية التي يتم تسليمها مع ناقلات فيروسية تسمح بوضع علامات محددة على الخلايا العصبية في الدائرة المستهدفة. إن الجهد المستمر لتعزيز الحساسية وطول العمر والقدرة على تسمية حتى المقصورات تحت الخلوية ، يجعل GECIs مثالية لمختلف دراسات تصوير الكالسيوم في الجسم الحي 17،18،19.
إن تشتت الضوء في أنسجة المخ أثناء التصوير يحد من الاختراق البصري في العمق ، حتى مع المجهر ثنائي الفوتون. ومع ذلك ، فإن عدسة مؤشر التدرج (GRIN) تتغلب على هذه المشكلة حيث يمكن تضمين عدسة GRIN مباشرة في الأنسجة البيولوجية ونقل الصور من منطقة الدماغ العميقة إلى هدف المجهر. على عكس العدسة التقليدية المصنوعة من مواد متجانسة بصريا وتتطلب سطحا معقدا الشكل للتركيز وإنشاء الصور ، يعتمد أداء عدسة GRIN على تغيير معامل الانكسار التدريجي داخل مادة العدسة التي تحقق التركيز البؤري مع سطح المستوى20. يمكن تصنيع عدسة GRIN حتى قطر 0.2 مم. لذلك ، يمكن زرع عدسة GRIN مصغرة في الدماغ العميق دون التسبب في الكثير من الضرر.
في هذه المقالة ، يتم تقديم بروتوكول جراحة كامل للدماغ العميق في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي. لغرض العرض التوضيحي ، نصف جراحات الدماغ التي تستهدف على وجه التحديد قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) لدماغ الفأر وتسجيل تصوير الكالسيوم في الجسم الحي عبر نظام منظار مصغر مصمم خصيصا طورته مجموعة الدكتور لين في المعهد الوطني لتعاطي المخدرات (NIDA / IRP) 7,12. يتضمن الإجراء التجريبي عمليتين جراحيتين رئيسيتين في الدماغ. الجراحة الأولى هي حقن ناقل فيروسي بشكل نمطي يعبر عن GCaMP6f (GECI) في mPFC. الجراحة الثانية هي زرع عدسة GRIN في نفس منطقة الدماغ. بعد التعافي من جراحات الدماغ هذه ، فإن الإجراء اللاحق هو تثبيت حامل المنظار المصغر (القاعدة) على جمجمة الفأر باستخدام أسمنت الأسنان. في الجسم الحي يمكن إجراء تصوير Ca2+ في أي وقت بعد تركيب المنظار المصغر على قاعدته. بروتوكول الجراحة للحقن الفيروسي وزرع عدسة GRIN متوافق مع أي أنظمة تصوير تجارية أو مصممة خصيصا أحادية الفوتون وثنائية الفوتون للدماغ العميق في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6mm and 1.2mm drill burrs</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-G and 30-G needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>REF 305109 and REF305106</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% povidone-iodine solution (Betadine)</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>NDC 67618-151-17</td>
			<td>Surface disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124-1L</td>
			<td>GRIN lens cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-25G</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic ointment</td>
			<td>HeliDerm Technology</td>
			<td>81073087</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc</td>
			<td>30043308</td>
			<td>Acts as pain killer after surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoStereota</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>github.com/liang-bo/autostereota</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)</td>
			<td>Point Grey</td>
			<td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td>
			<td>For recording behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass hex nut</td>
			<td>McMASTER-CARR</td>
			<td>92736A112</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Par Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 4202317905</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commutator</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>BI-OX-CD5C-K</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>OX-M-K</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Microdrill</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Henkel Coorporation</td>
			<td># 1811182</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition controller</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data transmission cable</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>C&#38;B Metabond and Catalyst</td>
			<td>A00253revA306 and A00168revB306</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Duralay</td>
			<td>2249D</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>VETone</td>
			<td>NDC 1398503702</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet gel</td>
			<td>Clear H20</td>
			<td>72-06-5022</td>
			<td>Diet Supplement for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lens</td>
			<td>GRINTECH</td>
			<td>NEM-100-25-10-860-S</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Physitemp Instruments LLC.</td>
			<td>#10023</td>
			<td>To keep the mouse body warm during surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 502017</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 501072</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>WEST-WARD</td>
			<td>NDC 0143-9575-01</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe (Hamilton)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>#178647</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope base</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope holding arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope protection cap</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For protecting the miniscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KMTS50E</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuView</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0622</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinch Clamp</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>14040</td>
			<td>For clamping the tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape</td>
			<td>TegaSeal PTFE Tape</td>
			<td>A-A-58092</td>
			<td>For fastening miniScope to the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>RL 7302</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screw</td>
			<td>DECORAH LLC.</td>
			<td>3BT-P9005-00-0025</td>
			<td>For screwing the brass hex nut in miniscope base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Silicone Rubber tubing, 0.062&#8221;ID, 1/8&#8221;OD</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>2124T3</td>
			<td>For irrigation of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic stage</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>REF 806-WC</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Sofsilk</td>
			<td>REF SS683</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>For filtering aCSF during GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100834-AAV1</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 510650</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging

المجهر الفلوري المصغر (miniscope) هو أداة قوية لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الحيوانات التي تتصرف بحرية. يوفر العديد من المزايا على أنظمة تصوير الكالسيوم التقليدية متعددة الفوتونات: (1) مدمجة. (2) خفيفة الوزن؛ (3) بأسعار معقولة؛ و (4) يسمح بالتسجيل من الحيوانات التي تتصرف بحرية. يصف هذا البروتوكول جراحات الدماغ لتصوير الكالسيوم العميق في الدماغ في الجسم الحي باستخدام نظام تسجيل مصغر تم تطويره خصيصا. يتكون إجراء التحضير من ثلاث خطوات ، بما في ذلك (1) حقن الفيروس بشكل نمطي في منطقة الدماغ المطلوبة من دماغ الفأر لتسمية مجموعة فرعية محددة من الخلايا العصبية باستخدام مستشعر الكالسيوم المشفر وراثيا. (2) زرع عدسة مؤشر التدرج (GRIN) التي يمكنها نقل صورة الكالسيوم من منطقة الدماغ العميقة إلى نظام المنظار المصغر ؛ و (3) تثبيت حامل المنظار المصغر على جمجمة الماوس حيث يمكن إرفاق المنظار المصغر لاحقا. لإجراء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، يتم تثبيت المنظار المصغر على الحامل ، ويتم جمع صور الكالسيوم العصبية جنبا إلى جنب مع تسجيلات السلوك المتزامنة. بروتوكول الجراحة الحالي متوافق مع أي أنظمة تصوير تجارية أو مصممة خصيصا أحادية الفوتون وثنائية الفوتون لتصوير الكالسيوم العميق في الدماغ في الجسم الحي .

يوضح الشكل 1 الإجراء التجريبي التخطيطي ، بما في ذلك الحقن الفيروسي ، وزرع عدسة GRIN ، وتثبيت قاعدة المنظار المصغر على جمجمة الفأر ، وتصوير الكالسيوم في الجسم الحي عبر منظار مصغر. الإجراء بأكمله يستغرق ~ 2 أشهر. ويبين الشكل 2 المكونات الرئيسية الموصوفة في بروتوكول تصوير الكالسيوم بالمنظار المصغر في الجسم الحي. يعرض الشكل 3 واجهات برنامج AutoStereota أثناء زرع عدسة GRIN. يعرض الشكل 4 واجهات NeuView وبرنامج تسجيل السلوك أثناء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي.
تعتمد نتائج تصوير الكالسيوم في الجسم الحي على نجاح كل من الحقن الفيروسي وجراحات زرع عدسة GRIN. يوضح الشكل 5 مجموعة من النتائج (أي غير الناجحة ودون المستوى الأمثل والجيدة) من تسجيلات تصوير الكالسيوم في الجسم الحي . في الحالات غير الناجحة ، يمكن أن تظهر صورة الكالسيوم إما مظلمة أو مشرقة ولكنها عادة لا تكشف عن أي خلايا عصبية نشطة أو قليلة جدا. نحن عادة لا نتابع تجارب تسجيل الكالسيوم في الجسم الحي إذا كان هناك أقل من خمس خلايا عصبية نشطة. عادة ما يكشف تصوير الكالسيوم الجيد في الجسم الحي عن عدة مئات من الخلايا العصبية النشطة. إذا كان التسجيل يحتوي على أقل من مائة خلية عصبية نشطة ، فإننا نعتبره تسجيلا دون المستوى الأمثل.
في كل من التسجيلات دون المستوى الأمثل والجيدة في الجسم الحي ، تمت متابعة تجارب تصوير الكالسيوم ، وتم إجراء تحليل البيانات اللاحق. يظهر الفيلم 1 ممثلا في الجسم الحي يسجل تصوير الكالسيوم من الماوس mPFC. عادة ما تتم معالجة مقاطع فيديو السلوك وبيانات تصوير الكالسيوم بشكل منفصل. يمكن تسجيل مقاطع فيديو سلوك الماوس يدويا. تتم معالجة ملفات تصوير الكالسيوم باستخدام صندوق أدوات معالجة صور الكالسيوم CaIman24. يوضح الشكل 6 خريطة خلية تمثيلية والعديد من آثار الكالسيوم من تسجيل جيد لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي .
بعد الانتهاء من تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، فإن الخطوة الأخيرة هي التأكد مما إذا كان الحقن الفيروسي وزرع عدسة GRIN قد حدث في منطقة الدماغ المطلوبة. لهذا الغرض ، تم اختراق الماوس بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يليه 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). تم حصاد دماغ الفأر ، وتثبيته في 4٪ PFA لمدة 12 ساعة ، وتخزينه في PBS عند 4 درجات مئوية. ثم تم تقسيم دماغ الفأر إلى شرائح بسماكة 50 ميكرومتر مع اهتزاز. كانت شرائح الدماغ ملطخة ب DAPI ولوحظت تحت المجهر (غير موصوفة في البروتوكول)12. الشكل 7 عبارة عن شريحة دماغ فأر ~ 1.94 مم أمامية إلى bregma من فأر تجريبي ، توضح المسار الذي زرعت فيه عدسة GRIN. تشير منطقة التألق الأخضر أسفل مسار عدسة GRIN وحوله إلى التعبير عن GCaMP6f في منطقة mPFC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الإجراء التجريبي . (أ) الحقن المجسمة للفيروس في mPFC. (ب) زرع عدسة GRIN في mPFC. (ج) لصق قاعدة منظار مصغرة على جمجمة الماوس. (د) تركيب المنظار المصغر وتصوير الكالسيوم في الجسم الحي . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> الشكل 2: المكونات الرئيسية اللازمة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي . (أ) عدسة GRIN بقطر 1 مم وطول 4.38 مم. (ب) إبرة حادة مصقولة يدويا بوزن 27 جم تستخدم لشفط أنسجة المخ. (ج) الذراع الروبوتية المقترنة بحامل الإبرة. (د) غطاء مصنوع خصيصا من أنبوب PCR لحماية عدسة GRIN المكشوفة حتى تثبيت قاعدة miniscope على جمجمة الماوس. (ه) حامل المنظار المصغر (القاعدة) مع صمولة سداسية عشرية. (و) منظار صغير يتم لف جزء الخيط الخاص به بشريط PTFE. (ز) منظار صغير مثبت على قاعدته ببرغي قفل. (ح) ذراع عقد المنظار الصغير. (I) وحدة تحكم بمحرك 3D مصممة خصيصا تستخدم لتسهيل حركة المنظار المصغر في مواقع XYZ. (J) غطاء واقي مثبت على القاعدة لحماية عدسة GRIN المكشوفة بينما لا يعمل الماوس في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي . (K) المنظار المصغر المتصل بالكابل. (ل) نظام الحصول على البيانات للتصوير في الجسم الحي Ca2+ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> الشكل 3: واجهات برنامج AutoStereota أثناء شفط أنسجة المخ طبقة تلو الأخرى. (أ) الواجهة المقابلة للخطوات من 2.17.1 إلى 2.17.3. (ب) الواجهة المقابلة للخطوات 2-17-4 إلى 2-17-6. (جيم) الواجهة المقابلة للخطوات 2-17-7 إلى 2-17-9. (د) الواجهة المقابلة للخطوات 2-17-10 إلى 2-17-12. تسلط المربعات الحمراء الضوء على قيم الإدخال. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> الشكل 4: واجهات برنامج NeuView وبرنامج تسجيل السلوك أثناء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي . (أ) واجهة NeuView. (ب، ج) واجهات برنامج تسجيل السلوك. تسلط المربعات الحمراء الضوء على الأزرار التي تحتاج إلى النقر فوقها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> الشكل 5: الحد الأقصى لخرائط خلايا التألق الإسقاطية لإظهار نطاق النتائج المحتملة . (أ ، ب) غير ناجح في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي غير المقبول لتحليل البيانات اللاحقة. (أ) مظلم ويحتوي على أقل من 5 خلايا عصبية نشطة. (B) مشرق ولكن ليس لديه خلايا عصبية نشطة. (ج) خريطة الخلية من تصوير الكالسيوم دون المستوى الأمثل في الجسم الحي الذي يحتوي على بعض الخلايا العصبية النشطة. (د) خريطة الخلية من تصوير الكالسيوم الجيد في الجسم الحي الذي يتضمن عدة مئات من الخلايا العصبية النشطة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> الشكل 6: خريطة الخلية التمثيلية وانتقالات الكالسيوم من تصوير الكالسيوم الناجح في الجسم الحي . اللوحة اليسرى هي الحد الأقصى لخريطة خلية التألق الإسقاط من تسجيل تصوير الكالسيوم في الجسم الحي في mPFC أثناء اختبار ميداني مفتوح. يستمر التسجيل لمدة 5 دقائق. تعرض اللوحة اليمنى انتقالات الكالسيوم من 15 منطقة اهتمام (مطابقة للألوان). شريط المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> الشكل 7: تقييم ما بعد الوفاة لفأر تجريبي. تقييم ما بعد الوفاة لتعبير GCaMP6f وزرع عدسة GRIN في mPFC لفأر تجريبي. تشير المساحة المستطيلة إلى مسار زرع عدسة GRIN. تؤكد المنطقة الخضراء تحت المنطقة المزروعة بعدسة GRIN أنه تم التعبير عن GCaMP6f ، وتم زرع عدسة GRIN بدقة في منطقة الدماغ المطلوبة. Cg ، القشرة الحزامية. PrL ، القشرة المخية قبل الحوض. IL ، القشرة تحت الحليمية. شريط المقياس: 400 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: مقارنات بين نظام المنظار المصغر المصمم خصيصا في الوكالة الوطنية للتنمية الدولية وأنظمة المنظار المصغر الأخرى 7،8،9،10،11،13،25،26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الفيلم 1: تسجيل تصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الماوس mPFC أثناء اختبار ميداني مفتوح. لأغراض العرض التوضيحي ، يعرض هذا الفيديو تسجيل 1 دقيقة فقط. معدل إطارات التسجيل الأصلي هو 10 إطارات / ثانية. الفيديو أسرع 6 مرات من التسجيل الأصلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي هو تقنية قوية لدراسة ديناميكيات الخلايا العصبية والدوائر الدقيقة في الفئران التي تتصرف بحرية. يصف هذا البروتوكول إجراء جراحات الدماغ لتحقيق تصوير الكالسيوم الجيد في الجسم الحي باستخدام منظار مصغر.

الحقن الفيروسي المجسم، وزرع عدسة مؤشر التدرج لتصوير الكالسيوم العميق للدماغ في الجسم الحي

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

يمكن التصوير المصغر للكالسيوم في الجسم الحي الباحثين من فحص النشاط المنسق مكانيا وزمنيا من مئات الخلايا العصبية في هياكل الدماغ العميقة للحيوانات التي تتصرف بحرية. يوفر Miniscope في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي العديد من المزايا ، بما في ذلك القدرة على إجراء تسجيلات خاصة بنوع الخلية وواسعة النطاق وطولية. يتوافق بروتوكول الجراحة الخاص بنا للحقن الفيروسي وزرع عدسة GRIN مع أي فوتون واحد تجاري أو مخصص ونظامين لتصوير الفوتون للدماغ العميق في الجسم الحي لتصوير الكالسيوم.سيوضح الإجراء راشمي ثابا ، طالب دراسات عليا من مختبري. بعد تطهير المنطقة الجراحية المحلوقة للفأر المخدر ، استخدم مشرطا لإجراء شق بسنتيمترين عبر الجلد على طول خط الوسط لفضح لامدا وبريجما الجمجمة. بعد تحديد موقع نتوء حفر الأسنان 0.5 ملم إلى موضع من الأمام الخلفي 1.94 ملم والجانبي الإنسي 0.5 ملم من bregma ، ابدأ الحفر من خلال الجمجمة.بعد ذلك ، قم بتحميل الفيروس في حقنة الميكرولتر باستخدام لوحة التحكم في المضخة الصغيرة واسحب 500 نانولتر من فقاعة الهواء متبوعة ب 800 نانولتر من الفيروس بمعدل تدفق 50 نانولتر في الثانية. حرك الإبرة ببطء إلى أسفل في أنسجة المخ إلى إحداثيات Z المستهدفة للظهرية البطنية 1.75 ملم ثم حركها قليلا إلى إحداثيات Z البطنية الظهرية 1.65 ملم. على لوحة التحكم ، اضبط المضخة الصغيرة على حقن 500 نانولتر من الفيروس بمعدل تدفق 50 نانولتر في الدقيقة قبل الضغط على زر التشغيل لحقن الفيروس.عندما ينتهي الحقن ، اصطف حواف الجلد وأغلق الشق بعناية باستخدام خياطة 4-0. ضع مرهم مضاد حيوي على المنطقة المخيطة لمنع العدوى. لزرع مؤشر التدرج أو عدسة GRIN ، قم باستئصال منطقة مثلثة من الجلد يبلغ ارتفاعها 1.5 سم وقاعدة 1.5 سم من الجانب الأمامي بين العينين إلى الجانب الخلفي خلف لامدا باستخدام مقص دقيق.بعد تنظيف الجمجمة وتجفيفها تماما ، ضع سيانواكريليت على حواف الجلد وقم بتوصيل الجلد بالجمجمة. بعد خمس دقائق عندما يجف سيانو أكريليت ، حدد موقع نتوء حفر الأسنان بقطر 1.2 ملم إلى موضع أمامي خلفي 1.94 ملم ، جانبي إنسي على بعد 0.8 ملم من البريما. حفر من خلال الجمجمة، تليها إزالة الجافية باستخدام طرف إبرة قياس 30.نظف جميع قطع حطام العظام باستخدام ملقط حاد بزاوية 45 درجة. بعد ذلك ، قم بتوصيل إبرة نهاية حادة مصقولة يدويا بمقياس 27 بحامل الإبرة إلى جانب ذراع روبوتية مائلة بزاوية 10 درجات وقم بتوصيل الطرف الآخر من حامل الإبرة بنظام تفريغ المنزل. حدد موقع طرف الإبرة لمجرد لمس البريجما قبل النقر على زر بريجما لضبط إحداثيات Z للبريجما على الصفر.اضبط قيمة الإدخال X على 0.8 ، وقيمة الإدخال Y على 1.94 ، وقيمة إدخال Z على 1.0 وانقر فوق الزر Find لتحريك الإبرة إلى الجزء العلوي من الحفرة المحفورة في الجمجمة. قم بتوسيط طرف الإبرة إلى الحفرة المحفورة وقم بإنزالها إلى الموضع Z صفر. قم بتشغيل الفراغ وابدأ في شطف منطقة الدماغ المكشوفة بالسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي ، أو ACSF ، من خلال نظام أنابيب يتم التحكم فيه بالجاذبية متصل بإبرة قياس 30 بطرف منحني.يتم فقاعات ACSF باستمرار بمزيج غاز من 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون أثناء ترشيحه من خلال مرشح 0.2 ميكرون. باستخدام برنامج AutoStereota ، سيكتمل طموح أنسجة المخ في أربع جولات. بالنسبة للجولة الأولى من الطموح، تأكد من أن قيمة Z تعرض صفرا.ثم في جلسة zStep ، انقر فوق الصفين الأول والثاني وتحقق منهما. قم بتعيين قيم الصف الأول إلى 0.2 و 1. اضبط قيم الصف الثاني على 0.15 و4.في جلسة الوضع ، اضبط حجم الإبرة 27 مقياسا و 1.2. تعيين التعتيم 0.9. ستكون جميع القيم الأخرى افتراضية.لبدء الطموح ، انقر بالتتابع على أزرار NotSet و KeepZero و Start. تولد الجولة الأولى من الشفط جيبا عموديا بعمق 0.8 ملم وقطر 1 ملم. في الجولة الثالثة من الطموح ، انقر فوق الصف الأول وتحقق منه لجلسة zStep وقم بتعيين قيم الصف الأول إلى 1.8 و 1.في جلسة الوضع ، اضبط حجم الإبرة 27 مقياسا و 2.2. ابدأ الطموح من خلال الحفاظ على القيم الأخرى كما كانت في الجولة السابقة. بعد الجولة الثالثة من الطموح ، يبلغ عمق جيب العمود 1.8 ملم.الجولة الأخيرة من الطموح هي تنظيف الدم المتراكم في أسفل الجيب. اضبط قيم الصف الأول على 1.6 و 1 في جلسة zStep واضبط حجم الإبرة 27 مقياسا و 2.2 و Dims 0.6 في جلسة الوضع قبل بدء الطموح. بمجرد أن يصبح الجيب خاليا من الدم ، أوقف الفراغ ، وتوقف عن ري ACSF ، وارفع الإبرة بمقدار 2 ملم في إحداثيات Z و 0.5 ملم أمامية للمركز.ضع عدسة GRIN المعقمة مقاس 1 ملليمتر في جيب أنسجة المخ. بعد ذلك ، ضع الأغاروز المذاب في الفجوة بين عدسة GRIN وأنسجة المخ بمساعدة ملعقة. بعد أن يشكل الأغاروز هلام ، قم بإزالة الأغاروز الزائد باستخدام شفرة صغيرة.امزج مسحوق أسمنت الأسنان وسائل التحفيز في خلط مبرد مسبقا جيدا وقم بتطبيق طبقة من الأسمنت الراتنجي اللاصق ذاتي المعالجة على الجمجمة ، بدءا من إحاطة عدسة GRIN ثم تغطية الجمجمة المكشوفة بالكامل. في بئر بلاستيكية نظيفة ، اخلطي مسحوق أسمنت الأسنان والفحم الأسود مع السائل لتطبيق طبقة رقيقة من الخليط فوق الطبقة الأولى من أسمنت الأسنان. اتركه يتصلب لمدة خمس دقائق.قم بتوصيل Miniscope بالكابل وقم بتشغيل برنامج NuView المطور خصيصا. في NuView، انقر فوق الأجهزة، وتحقق من LED1 وانقر فوق الزر بث لعرض الصور الحية. لإيقاف البث المباشر، انقر على الزر إيقاف.بعد ذلك ، قم بتسوية Miniscope في ذراع Miniscope مخصص للإمساك. بمساعدة وحدات التحكم الآلية ، حدد موقع Miniscope فوق عدسة GRIN المكشوفة مباشرة ، مما يجعله موازيا لسطح العدسة. قم بإسقاط Miniscope ببطء نحو عدسة GRIN واضبط موضع Z حتى يتم العثور على أفضل مستوى للتركيز البؤري.ضع الطبقة الأولى من أسمنت الأسنان حول قاعدة Miniscope دون تغيير موضع Miniscope. بعد تصلب الأسمنت ، قم بإزالة ذراع الإمساك برفق بحيث يمكن ل Miniscope الوقوف بمفرده على رأس الماوس. ضع طبقة ثانية من أسمنت الأسنان حول القاعدة لملء جميع الفجوات ، مما يضمن عدم وجود تسرب لضوء LED من الفجوات.دع أسمنت الأسنان يصلب. بعد تخدير الماوس لفترة وجيزة باستخدام الأيزوفلوران ، قم بفك برغي القفل في القاعدة باستخدام مفك براغي صغير قبل إزالة الغطاء الواقي وتنظيف سطح عدسة GRIN باستخدام قطعة قطن منقوعة بالأسيتون. قم بتوصيل Miniscope بالكابل وابدأ تشغيل برنامج NuView لبدء تحديد أفضل مستوى بؤري مع ضبط موضع Miniscope بالنسبة للقاعدة عن طريق التشديد أو التخفيف قليلا بمساعدة ملقط حاد.بمجرد تحديد أفضل مستوى بؤري ، قم بتشديد برغي القفل قبل فصل الكابل ووضع الماوس مرة أخرى في قفصه المنزلي. قم بتشغيل برنامج كاميرا السلوك لعرض ساحة سلوك الماوس من خلال وظيفة البث المباشر. اضبط تركيز الكاميرا العلوية يدويا.حدد Trigger Strobe وحدد تمكين / تعطيل المشغل ، متبوعا بالنقر فوق الزر تسجيل. ثم استخدم استعراض لتحديد موقع حيث سيتم حفظ تسجيلات السلوك. حدد تنسيق الصورة المطلوب.اجعل الماوس قريبا من الساحة وقم بتوصيل Miniscope بالكابل المرتبط بنظام الحصول على البيانات. ثم ضع الماوس في وسط الساحة. في برنامج كاميرا السلوك، انقر فوق بدء التسجيل.في NuView ، تحقق من LED1 ، وانقر فوق التقاط ثم قم بتشغيل الأزرار لبدء التسجيل. هذا يسمح بالتسجيلات المتزامنة لتصوير الكالسيوم وسلوك الماوس. اضغط على إيقاف بعد 3،000 إطار وحفظ الملفات.عند الانتهاء من التسجيل ، قم بتخدير الماوس لفترة وجيزة باستخدام الأيزوفلوران ، وافصل Miniscope عن القاعدة وضع الغطاء الواقي فوق القاعدة قبل وضع الماوس مرة أخرى في قفصه المنزلي. احتوت خريطة الخلية من تصوير الكالسيوم دون المستوى الأمثل في الجسم الحي على بعض الخلايا العصبية النشطة ، في حين أن التصوير الناجح شمل عدة مئات من الخلايا العصبية النشطة في المنطقة المركزة. في المثال النموذجي لتصوير الكالسيوم غير الناجح في الجسم الحي ، لوحظ أن المنطقة مظلمة وتحتوي على أقل من خمس خلايا عصبية نشطة ، أو كانت المنطقة مشرقة ولكن لم يكن لديها خلايا عصبية نشطة.في التحليل التمثيلي ، يتم عرض خريطة الخلايا الفلورية القصوى للإسقاط وانتقالات الكالسيوم من تسجيل تصوير الكالسيوم المتتالي في الجسم الحي. أشار تقييم ما بعد الوفاة لتعبير GCaMP6f وزرع عدسة GRIN في PFC الإنسي لفأر تجريبي إلى أنه تم التعبير عن GCaMP6f وتم زرع عدسة GRIN بدقة في منطقة الدماغ المطلوبة. للحصول على تصوير جيد للكالسيوم ، من الضروري التأكد من توقف النزيف تماما وأن المجال خال من جلطات الدم قبل زرع عدسة GRIN.يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة تغيرات الدائرة العصبية في نموذج الفأر لاضطرابات الدماغ البشرية المختلفة واختبار ما إذا كان مرشح الدواء يمكنه تطبيع الدوائر المتغيرة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

تحفيز الدماغ العميق مع الرنين المغناطيسي الوظيفي في وقت واحد في القوارض

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

حقن الفيروسي Intracerebroventricular من حديثي الولادة ماوس الدماغ للاستمرار وانتشار تنبيغ العصبية

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

متني غير الغازية، والأوعية الدموية والتمثيل الغذائي عالية التردد الموجات فوق الصوتية والضوئي الجرذ أعماق الدماغ التصوير

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

في فيفو الدماغ أسلوب التصوير النهج القائم على الكالسيوم إضاءة الحيوية المؤشر GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم في الزيتون السفلي الماوس

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

الدماغ بيريسيت الكالسيوم والتصوير الدموي في الفئران المعدلة وراثيا في فيفو

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...