Name: stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Dette arbejde er støttet af tilskud fra National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 og UG3NS115608.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex.">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice.">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li><li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning.">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li><li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information.">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINscope,+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations.">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987 (2020).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice.">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration.">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li><li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior.">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery.">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li><li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient-index+optics:+A+review.">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals.">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging.">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li><li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation.">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173 (2019).</li><li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice.">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li><li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice.">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li><li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases:+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy.">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).</li><li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre/loxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome.">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li><li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-loxP-mediated+recombination:+General+principles+and+experimental+considerations.">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li></ol>

Forfatterne rapporterer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Et centralt spørgsmål i neurovidenskab er at forstå, hvordan neurale dynamikker og kredsløb koder og lagrer information, og hvordan de ændres i hjernesygdomme. Ved hjælp af et miniskop in vivo Ca2+ billeddannelsessystem kan individuel neural aktivitet fra flere hundrede neuroner i et lokalt mikrokredsløb overvåges samtidigt fra et frit opførende dyr. Her beskrives en detaljeret operationsprotokol for viral injektion og IMPLANTATION AF GRIN-linser for at forberede gnavere til en dyb hjerne in vivo Ca2+ billeddannelse via et specialudviklet mikroskopoptagelsessystem. Tabel 1 viser sammenligningerne af vores miniscope-system med andre kommercielt tilgængelige og specialbyggede miniscope-systemer 7,8,9,10,11,13,25,26. Det er værd at bemærke, at GRIN-linseimplantation ved hjælp af den nuværende kirurgiske protokol er kompatibel med enhver kommerciel eller specialbygget enkeltfoton- og to-fotonbilleddannelsessystemer til en dyb hjerne in vivo-calciumbilleddannelse.
Fra viral injektion til dataindsamling af mikroskop in vivo calciumbilleddannelse tager hele den eksperimentelle procedure mindst 2 måneder at gennemføre. Det er en kompliceret og arbejdskrævende proces. Eksperimentets endelige succes afhænger af flere faktorer, herunder korrekt valg af GECIS'er, injektion af virus nøjagtigt i det målrettede hjerneområde, tilstrækkelig viral ekspression i den ønskede neurale population, implantation af GRIN-linsen præcist på det ønskede sted, tilstrækkelig genopretning fra operationer, samt om alvorlig betændelse opstår efter operationen, og om dyrets adfærd er alvorligt påvirket af operationer, og så videre.
To kritiske trin omfatter stereotaksisk injektion af virus og GRIN-linseimplantation. Til demonstrationsformålet blev den stereotaksiske mikroinjektion udført i musens mPFC, hvor adeno-associeret virus (AAV1) koder GCaMP6f under kontrol af CaMKII-promotor, der selektivt mærker pyramidale neuroner i mPFC. GCaMP6f blev valgt, da det er en af de hurtigste og mest følsomme calciumindikatorer med en halv henfaldstid på 71 ms15. Derudover er AAV viral ekspression af GCaMP6f langvarig (dvs. flere måneder), hvilket gør den ideel til at udføre gentagen in vivo Ca2+ billeddannelse over en lang periode til langsgående undersøgelser i musemodeller af neurodegenerative sygdomme27. Den nuværende kirurgiske protokol kan tilpasses til at målrette mod forskellige cellepopulationer i enhver anden hjerneregion. Forskellige tilgængelige virale værktøjer tillader selektiv mærkning af specifikke neurale populationer i den ønskede hjerneregion i den ønskede alder. Derudover kan forskere drage fordel af Cre-LoxP-rekombinationssystemet og forskellige tilgængelige transgene musemodeller til at udføre genetiske modifikationer og studere det adfærdsmæssige og neurale kredsløbsresultat28,29.
Et unikt træk ved den præsenterede protokol er, at den automatiserede lag-for-lag hjernevævsaspiration blev udført før GRIN-linsen (1 mm i diameter) implantation. Dette opnås gennem en 27 G-nål, der er forbundet til et vakuumsystem, styret af en specialbygget robotarm og software23. Baseret på vores erfaring genererer denne metode en ensartet overflade, som GRIN-linsen kan komme i kontakt med, og forårsager mindre skade på nabovævet end manuel vævsaspiration23. Af denne grund giver denne procedure en åbenlys fordel for GRIN-objektiver med en relativt bredere diameter (f.eks. 1 mm). Vævsaspiration er dog muligvis ikke nødvendig for implantering af et GRIN-objektiv med en mindre diameter (0,5 mm eller 0,25 mm). I stedet kan den plantes direkte langs det førende spor lavet med en 30 G nål21.
Udover de to kritiske trin, der er diskuteret ovenfor, skal mange andre faktorer overvejes nøje for en vellykket operation. (1) Alle de instrumenter, der kommer i kontakt med hjernen, skal steriliseres for at forhindre infektion. (2) Alle kirurgiske trin skal udføres for at minimere skader på hjernen for at forhindre yderligere betændelse og overdreven dannelse af arvæv. (3) De anæstesidoser, der gives oprindeligt og vedligeholdes under operationen, især dem, der administreres intraperitonealt, skal overvejes nøje. Anæstesidoserne kan ændres i henhold til forskellige musestammer, da nogle kan være mere modtagelige. (4) Musens tilstand skal konstant overvåges under operationen. Endelig (5) musene skal overvåges regelmæssigt efter operationen, da der kan opstå mange komplikationer efter operationen.
Selvom en del af hjernevævet fjernes ensidigt under GRIN-linseimplantationstrinnet, observerede vi ikke nogen åbenlyse adfærdsunderskud 7,12. Vægten af miniscope er omkring 2 gram, og kablet er specialdesignet til at gøre det let og sikre, at musen let kan bære det. Miniskopet og kablet er kun fastgjort til dyret før in vivo-billeddannelse og løsnes efter billeddannelse. Hele billeddannelsesprocessen tager normalt ikke længere end 30 minutter. Derfor forhindrer disse instrumenteringer ikke musen i frit at opføre sig. Miniscope-installations- og afinstallationstrinnene har brug for en kort anæstesi (mindre end 2 minutter) med isofluran med henblik på dyrebegrænsning. Vi lader typisk musen komme sig efter den korte eksponering af isofluran i 30 minutter, før vi udfører in vivo-billeddannelse. Vi har udført miniscope in vivo calcium imaging en gang om ugen i et par uger uden at bemærke nogen indvirkning på musens sundhed og musens sociale adfærd12.
En væsentlig begrænsning i det nuværende miniscope-optagelsessystem er behovet for at forbinde mikroskopet til et kabel til dataindsamling. Tilstedeværelsen af kablet begrænser undertiden musens opgaveudførelse og begrænser optagelsen af et dyr ad gangen. For nylig er der udviklet et trådløst miniskop25,26. Dette vil udvide opgaveudførelsen og muliggøre samtidig in vivo-billeddannelse fra flere dyr i en gruppe. Desuden vil udvikling af mere følsomme GECIS'er med spektralt adskillelige bølgelængder kombineret med et dobbeltfarvet mikroskop give mere spændende muligheder for neurovidenskabelig forskning.

Intracellulær Ca2+ signalering er en væsentlig regulator af cellevækst, proliferation, differentiering, migration, gentranskription, sekretion og apoptose1. I neuroner styres Ca2+ signalering præcist, da dets rumlige-tidsmæssige mønster er relateret til afgørende funktioner såsom membranexcitabilitet, neurotransmitterfrigivelse og synaptisk plasticitet2.
In vivo calciumbilleddannelse er en kraftfuld teknik, der kan bruges til at afkode neurale kredsløbsrepræsentation elementær til normal dyreadfærd, identificere afvigende neuronale aktiviteter i dyremodeller af hjernesygdomme og optrævle potentielle terapeutiske mål, der kan normalisere disse ændrede kredsløb. De to almindelige in vivo calciumbilleddannelsessystemer er to-foton laser scanning fluorescensmikroskopi 3,4,5,6 og hovedmonteret miniaturiseret mikroskopi (miniscope)7,8,9,10,11,12,13 . Den konventionelle to-fotonmikroskopi giver kommanderende fordele såsom bedre opløsning, lavere støj og lavere fotobleaching; Forsøgsdyrene skal dog være hovedfaste, hvilket begrænser de adfærdsundersøgelser, der kan udføres 3,4,5,6. I modsætning hertil er det hovedmonterede miniscope-system lille og bærbart, hvilket gør det muligt at studere en lang række adfærdstest ved hjælp af frit opførende dyr 7,8,9,10,11,12,13.
Der er to førende Ca2+ indikatorer, kemiske indikatorer 5,14 og genetisk kodede calciumindikatorer (GEKI'er)15,16. Ca2+ billeddannelse er blevet lettet ved hjælp af meget følsomme GEKI'er leveret med virale vektorer, der tillader specifik mærkning af neuroner i det målrettede kredsløb. Den kontinuerlige indsats for at forbedre følsomheden, levetiden og evnen til at mærke selv de subcellulære rum gør GECI'er ideelle til forskellige in vivo calciumbilleddannelsesundersøgelser 17,18,19.
Spredningen af lys i hjernevæv under billeddannelse begrænser den optiske penetration i dybden, selv med to-fotonmikroskopien. Gradient Index (GRIN) linsen overvinder imidlertid dette problem, da GRIN-linsen kan indlejres direkte i det biologiske væv og videresende billeder fra det dybe hjerneområde til mikroskopmålet. I modsætning til konventionelle objektiver lavet af optisk homogent materiale og kræver en kompliceret formet overflade for at fokusere og skabe billeder, er GRIN-objektivets ydeevne baseret på en gradvis brydningsindeksændring i objektivmaterialet, der opnår fokus med en plan overflade20. GRIN-objektivet kan fremstilles ned til 0,2 mm i diameter. Derfor kan en miniaturiseret GRIN-linse implanteres i den dybe hjerne uden at forårsage for meget skade.
I denne artikel præsenteres en komplet kirurgisk protokol for den dybe hjerne in vivo calciumbilleddannelse. Til demonstrationsformålet beskriver vi hjerneoperationer specifikt rettet mod den mediale præfrontale cortex (mPFC) i musehjernen og in vivo calciumbilleddannelsesoptagelse via et specialbygget mikroskopsystem udviklet af Dr. Lins gruppe ved National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. Den eksperimentelle procedure involverer to store hjerneoperationer. Den første operation er stereotaxisk injektion af en viral vektor, der udtrykker GCaMP6f (en GECI) i mPFC. Den anden operation er at implantere GRIN-linsen i det samme hjerneområde. Efter genopretning fra disse hjerneoperationer er den efterfølgende procedure at anbringe mikroskopholderen (basen) på musekraniet ved hjælp af tandcement. In vivo Ca2+ billeddannelse kan udføres når som helst efter montering af miniscope på dets base. Operationsprotokollen til viral injektion og GRIN-linseimplantation er kompatibel med alle kommercielle eller specialbyggede enkeltfoton- og tofotonbilleddannelsessystemer til den dybe hjerne in vivo-calciumbilleddannelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6mm and 1.2mm drill burrs</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-G and 30-G needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>REF 305109 and REF305106</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% povidone-iodine solution (Betadine)</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>NDC 67618-151-17</td>
			<td>Surface disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124-1L</td>
			<td>GRIN lens cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-25G</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic ointment</td>
			<td>HeliDerm Technology</td>
			<td>81073087</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc</td>
			<td>30043308</td>
			<td>Acts as pain killer after surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoStereota</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>github.com/liang-bo/autostereota</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)</td>
			<td>Point Grey</td>
			<td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td>
			<td>For recording behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass hex nut</td>
			<td>McMASTER-CARR</td>
			<td>92736A112</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Par Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 4202317905</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commutator</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>BI-OX-CD5C-K</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>OX-M-K</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Microdrill</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Henkel Coorporation</td>
			<td># 1811182</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition controller</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data transmission cable</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>C&#38;B Metabond and Catalyst</td>
			<td>A00253revA306 and A00168revB306</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Duralay</td>
			<td>2249D</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>VETone</td>
			<td>NDC 1398503702</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet gel</td>
			<td>Clear H20</td>
			<td>72-06-5022</td>
			<td>Diet Supplement for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lens</td>
			<td>GRINTECH</td>
			<td>NEM-100-25-10-860-S</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Physitemp Instruments LLC.</td>
			<td>#10023</td>
			<td>To keep the mouse body warm during surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 502017</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 501072</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>WEST-WARD</td>
			<td>NDC 0143-9575-01</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe (Hamilton)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>#178647</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope base</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope holding arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope protection cap</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For protecting the miniscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KMTS50E</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuView</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0622</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinch Clamp</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>14040</td>
			<td>For clamping the tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape</td>
			<td>TegaSeal PTFE Tape</td>
			<td>A-A-58092</td>
			<td>For fastening miniScope to the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>RL 7302</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screw</td>
			<td>DECORAH LLC.</td>
			<td>3BT-P9005-00-0025</td>
			<td>For screwing the brass hex nut in miniscope base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Silicone Rubber tubing, 0.062&#8221;ID, 1/8&#8221;OD</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>2124T3</td>
			<td>For irrigation of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic stage</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>REF 806-WC</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Sofsilk</td>
			<td>REF SS683</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>For filtering aCSF during GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100834-AAV1</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 510650</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging

Et miniaturefluorescensmikroskop (miniskop) er et potent værktøj til in vivo calciumbilleddannelse fra frit opførende dyr. Det giver flere fordele i forhold til konventionelle multi-foton calciumbilleddannelsessystemer: (1) kompakt; 2) letvægtet 3) økonomisk overkommelige og (4) tillader optagelse fra frit opførende dyr. Denne protokol beskriver hjerneoperationer for dyb hjerne in vivo calciumbilleddannelse ved hjælp af et specialudviklet mikroskopoptagelsessystem. Forberedelsesproceduren består af tre trin, herunder (1) stereotaksisk injektion af virussen i det ønskede hjerneområde i en musehjerne for at mærke en bestemt undergruppe af neuroner med genetisk kodet calciumsensor; (2) implantation af gradientindekslinse (GRIN), der kan videresende calciumbillede fra dyb hjerneregion til mikroskopsystemet og (3) anbringelse af mikroskopholderen over musekraniet, hvor miniskopet kan fastgøres senere. For at udføre in vivo calciumbilleddannelse fastgøres mikroskopet på holderen, og neuronale calciumbilleder indsamles sammen med samtidige adfærdsoptagelser. Den nuværende kirurgiske protokol er kompatibel med alle kommercielle eller specialbyggede enkeltfoton- og to-fotonbilleddannelsessystemer til dyb hjerne in vivo-calciumbilleddannelse .

Figur 1 viser den skematiske eksperimentelle procedure, herunder viral injektion, GRIN-linseimplantation, anbringelse af minoskopbasen på musekraniet og in vivo-calciumbilleddannelse via et mikroskop. Hele proceduren tager ~ 2 måneder. Figur 2 viser de vigtigste komponenter beskrevet i protokollen for miniscope in vivo calcium imaging. Figur 3 viser grænsefladerne til AutoStereota-software under IMPLANTATION AF GRIN-objektiver. Figur 4 viser grænsefladerne til NeuView og adfærdsoptagelsessoftware under in vivo calciumbilleddannelse.
Resultatet af in vivo calciumbilleddannelse er afhængig af succesen med både viral injektion og GRIN linseimplantationsoperationer. Figur 5 viser en række resultater (dvs. mislykkede, suboptimale og gode) fra in vivo calciumbilleddannelsesoptagelser. I mislykkede tilfælde kan calciumbilledet virke enten mørkt eller lyst, men afslører normalt ingen eller meget få aktive neuroner. Vi forfølger typisk ikke in vivo calciumoptagelsesforsøg, hvis der er færre end fem aktive neuroner. En god in vivo calciumbilleddannelse afslører typisk flere hundrede aktive neuroner. Hvis en optagelse indeholder mindre end hundrede aktive neuroner, betragter vi det som en suboptimal optagelse.
I både suboptimale og gode optagelser in vivo blev calciumbilleddannelseseksperimenter forfulgt, og den efterfølgende dataanalyse blev udført. Film 1 viser en repræsentativ in vivo calciumbilleddannelsesoptagelse fra musens mPFC. Adfærdsvideoer og calciumbilleddannelsesdata behandles normalt separat. Videoer om museadfærd kan scores manuelt. Calciumbilleddannelsesfiler behandles ved hjælp af CaImAn calciumbilledbehandlingsværktøjskassen24. Figur 6 viser et repræsentativt cellekort og flere calciumspor fra en god in vivo calciumbilleddannelsesoptagelse.
Efter at have afsluttet in vivo calciumbilleddannelse er det sidste trin at bekræfte, om den virale injektion og GRIN-linseimplantation har fundet sted i den ønskede hjerneregion. Til dette formål blev musen perfunderet med fosfatbufret saltvand (PBS) efterfulgt af 4% paraformaldehyd (PFA). Musehjernen blev høstet, postfixeret i 4% PFA i 12 timer og opbevaret i PBS ved 4 °C. Musehjernen blev derefter opdelt i 50 μm tykke skiver med et vibratom. Hjerneskiverne blev farvet med DAPI og observeret under mikroskopet (ikke beskrevet i protokollen)12. Figur 7 er en musehjerneskive ~ 1,94 mm forreste til bregma fra en eksperimentel mus, der viser sporet, hvor GRIN-linsen blev implanteret. Det grønne fluorescensområde under og omkring GRIN-objektivsporet indikerer udtrykket af GCaMP6f i mPFC-regionen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk oversigt over forsøgsproceduren. (A) Stereotaksisk injektion af virus i mPFC. (B) IMPLANTATION AF GRIN-objektiv i mPFC'en. C) Anbringelse af minoskopbase på musekraniet. (D) Montering af miniskop og in vivo-calciumbilleddannelse . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Figur 2: Hovedkomponenter, der er nødvendige for in vivo calciumbilleddannelse. (A) Et GRIN-objektiv med en diameter på 1 mm og en længde på 4,38 mm. (B) En 27 G manuelt poleret stump nål, der anvendes til hjernevævsaspiration. C) Robotarmen koblet til nåleholderen. (D) En specialfremstillet hætte fra et PCR-rør for at beskytte det eksponerede GRIN-objektiv indtil anbringelsen af minoskopbasen på musekraniet. (E) Miniscopeholderen (bunden) med en sekskantet møtrik. F) Et miniskop, hvis gevinddel er viklet ind i PTFE-båndet. (G) Et miniskop fastgjort til bunden med en låseskrue. (H) Miniskopets holdearm. (I) En specialbygget 3D-motoriseret controller, der bruges til at lette bevægelsen af miniscope i XYZ-positioner. (J) En beskyttelseshætte fastgjort på basen for at beskytte det eksponerede GRIN-objektiv, mens musen ikke udfører in vivo-calciumbilleddannelse . (K) Det miniskop, der er tilsluttet kablet. (L) Dataindsamlingssystemet til in vivo Ca2+ billeddannelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Figur 3: Grænseflader til AutoStereota-software under lag-for-lag hjernevævsaspiration. (A) Grænsefladen svarende til trin 2.17.1 til 2.17.3. B) Den grænseflade, der svarer til trin 2.17.4 til 2.17.6. C) Den grænseflade, der svarer til trin 2.17.7 til 2.17.9. D) Den grænseflade, der svarer til trin 2.17.10 til 2.17.12. Røde felter fremhæver inputværdierne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Figur 4: Grænseflader til NeuView-software og adfærdsoptagelsessoftwaren under in vivo-calciumbilleddannelse . (A) Grænsefladen til NeuView. (B,C) Grænsefladerne til adfærdsoptagelsessoftwaren. Røde felter fremhæver knapper, der skal klikkes på. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Figur 5: Maksimal projektionsfluorescenscelle kortlægger for at vise rækkevidden af mulige resultater. (A,B) Mislykket in vivo calciumbilleddannelse, der ikke er acceptabel til efterfølgende dataanalyse. (A) er mørk og indeholder mindre end 5 aktive neuroner. (B) er lys, men har ingen aktive neuroner. (C) Cellekortet fra en suboptimal in vivo calciumbilleddannelse, der indeholder nogle aktive neuroner. (D) Cellekortet fra en god in vivo calciumbilleddannelse, der omfatter flere hundrede aktive neuroner. Vægtstang: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Figur 6: Repræsentativt cellekort og calciumtransienter fra en vellykket in vivo calciumbilleddannelse. Det venstre panel er det maksimale projektionsfluorescenscellekort fra en in vivo-calciumbilleddannelsesoptagelse i mPFC under en åben felttest. Optagelsen varer i 5 min. Det højre panel viser calciumtransienter fra 15 regioner af interesse (farvematchet). Vægtstang: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Figur 7: Postmortem vurdering af en eksperimentel mus. Postmortem-vurderingen for GCaMP6f-ekspression og GRIN-linseimplantation i mPFC af en eksperimentel mus. Det rektangulære område angiver vejen for IMPLANTATION AF GRIN-objektiver. Det grønne område under det IMPLANTEREDE REGION MED GRIN-linse bekræfter, at GCaMP6f blev udtrykt, og GRIN-linsen blev implanteret præcist i det ønskede hjerneområde. Cg, cingulat cortex; PrL, prælimbisk cortex; IL, infralimbisk cortex. Vægtstang: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1: Sammenligninger af det specialbyggede miniscope-system på NIDA med andre mikroskopsystemer 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Film 1: En in vivo calciumbilleddannelsesoptagelse fra musens mPFC under en åben felttest. Til demonstrationsformål viser denne video kun 1 minuts optagelse. Den originale optagelsesbilledhastighed er 10 billeder / s. Videoen er 6 gange hurtigere end den originale optagelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne film.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging er en kraftfuld teknik til at studere neuronal dynamik og mikrokredsløb i frit opførende mus. Denne protokol beskriver udførelse af hjerneoperationer for at opnå god in vivo calciumbilleddannelse ved hjælp af et mikroskop.

Stereotaksisk viral injektion og gradientindekslinseimplantation til dyb hjerne in vivo-calciumbilleddannelse

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Miniscope in vivo calcium imaging giver forskere mulighed for at undersøge den rumligt og tidsmæssigt koordinerede aktivitet fra hundredvis af neuroner i dybe hjernestrukturer af frit opførende dyr. Miniscope in vivo calciumbilleddannelse giver mange fordele, herunder evnen til at udføre optagelser, der er celletypespecifikke, store skala og langsgående. Vores kirurgiske protokol til viral injektion og GRIN-linseimplantation er kompatibel med enhver kommerciel eller specialbygget enkelt foton og to fotonbilleddannelsessystemer til den dybe hjerne in vivo calciumbilleddannelse.Demonstration af proceduren vil være Rashmi Thapa, en kandidatstuderende fra mit laboratorium. Efter desinfektion af det barberede kirurgiske område af en bedøvet mus, skal du bruge en skalpel til at lave et snit på to centimeter gennem huden langs midterlinjen for at udsætte kraniets lambda og bregma. Efter at have lokaliseret 0,5 millimeter tandboret til en position på forreste bageste 1,94 millimeter og mediale laterale 0,5 millimeter fra bregma, skal du begynde at bore gennem kraniet.Læg derefter virussen i mikrolitersprøjten ved hjælp af mikropumpens kontrolpanel og træk 500 nanoliter luftboble tilbage efterfulgt af 800 nanoliter af virussen med en strømningshastighed på 50 nanoliter i sekundet. Flyt langsomt ned ad nålen ind i hjernevævet til den målrettede Z-koordinat af dorsale ventrale 1,75 millimeter og flyt den derefter lidt op til Z-koordinaten for dorsale ventrale 1,65 millimeter. På kontrolpanelet skal du indstille mikropumpen til at injicere 500 nanoliter af virussen med en strømningshastighed på 50 nanoliter i minuttet, før du trykker på knappen Kør for at injicere virussen.Når injektionen er overstået, skal du rette hudkanterne op og forsigtigt lukke snittet med en 4-0 sutur. Påfør antibiotika salve på det syede område for at forhindre infektion. For at implantere gradientindeks eller GRIN-linse skal du skære et trekantet område af huden på 1,5 centimeter højde og 1,5 centimeter base fra den forreste side mellem øjnene til den bageste side bag lambdaen ved hjælp af en fin saks.Når kraniet er grundigt rengjort og tørret, påføres cyanoacrylat på hudens kanter og fastgør huden til kraniet. Efter fem minutter, når cyanoacrylatet tørrer, skal du finde en tandboremaskine med en diameter på 1,2 millimeter til en position på forreste bageste 1,94 millimeter, mediale laterale 0,8 millimeter fra bregma. Bor gennem kraniet, efterfulgt af at fjerne dura ved hjælp af en 30 gauge nålespids.Rengør alle stykker knogleaffald med 45 graders vinklede skarpe tang. Fastgør derefter en 27 gauge manuelt poleret stump endenål til nåleholderen koblet til en robotarm vippet med en vinkel på 10 grader og tilslut den anden ende af nåleholderen til husets vakuumsystem. Find spidsen af nålen til bare at røre ved bregma, før du klikker på Bregma-knappen for at indstille Z-koordinaten for bregma til nul.Indstil input X-værdi til 0,8, indtast Y-værdi til 1,94, indtast Z-værdi til 1,0, og klik på knappen Find for at flytte nålen til toppen af det borede hul på kraniet. Centrer spidsen af nålen til det borede hul, og bring det ned til Z-positionen nul. Tænd for vakuumet, og begynd at skylle det udsatte hjerneområde med kunstig cerebrospinalvæske eller ACSF gennem et tyngdekraftsstyret rørsystem, der er forbundet til en 30 gauge nål med en bøjet spids.ACSF bliver kontinuerligt boblet med en gasblanding af 95% ilt og 5% kuldioxid, mens den filtreres gennem et 0,2 mikron filter. Ved hjælp af AutoStereota-software vil aspiration af hjernevævet fuldføres i fire runder. I den første aspirationsrunde skal du sørge for, at Z-værdien viser nul.Klik derefter i zStep-sessionen og kontroller den første og anden række. Indstil værdierne for den første række til 0,2 og 1. Indstil værdierne for den anden række til 0,15 og 4.I Tilstandssession skal du indstille nålestørrelse 27 måler og 1.2. Indstil Dims 0,9. Alle andre værdier vil være standardværdier.For at starte aspiration skal du sekventielt klikke på notSet,KeepZero og Start-knapperne. Den første runde af aspiration genererer en søjlelomme med 0,8 millimeter i dybden og 1 millimeter i diameter. I den tredje aspirationsrunde skal du klikke og kontrollere den første række for zStep-session og indstille værdierne for den første række til 1,8 og 1.I Tilstandssession skal du indstille nålestørrelse 27 måler og 2.2. Start ambitionen ved at holde andre værdier de samme som i den foregående runde. Efter den tredje aspirationsrunde er dybden af søjlelommen 1,8 millimeter.Den sidste runde af aspiration er at rydde op i blod akkumuleret i bunden af lommen. Indstil værdierne for den første række til 1,6 og 1 i zStep-session, og indstil nålestørrelse 27-måler og 2,2 og Dims 0,6 i Tilstand-session, før du starter aspirationen. Når lommen er blodfri, skal du stoppe vakuumet, stoppe vandingen af ACSF og bringe nålen op 2 millimeter i Z-koordinat og 0,5 millimeter forrest til midten.Anbring den sterile 1 millimeter GRIN-linse i hjernevævslommen. Påfør derefter den smeltede agarose i mellemrummet mellem GRIN-linsen og hjernevævet ved hjælp af en spatel. Når agarose danner en gel, skal du fjerne overskydende agarose ved hjælp af et mikroblad.Bland tandcementpulveret og katalysatorvæsken i en forkølet blandingsbrønde, og påfør et lag selvhærdende klæbende harpikscement på kraniet, startende med at omringe GRIN-linsen og derefter dække hele det udsatte kranium. I en ren plastbrønd blandes tandcementpulver og sort trækul med væske for at påføre et tyndt lag af blandingen oven på det første lag tandcement. Lad det hærde i fem minutter.Tilslut Miniscope til kablet, og tænd for den specialudviklede software NuView. I NuView skal du klikke på Hardware, kontrollere LED1 og klikke på knappen Stream for at se livebillederne. For at stoppe live streaming skal du klikke på Stop-knappen.Sæt derefter Miniscope i en specialbygget Miniscope-holdearm. Ved hjælp af motoriserede controllere skal du placere Miniscope lige over det eksponerede GRIN-objektiv, hvilket gør det parallelt med objektivets overflade. Bring langsomt miniskopet ned mod GRIN-objektivet, og juster dets Z-position, indtil det bedste fokusplan er fundet.Påfør det første lag tandcement omkring Miniscope-basen uden at ændre Miniscope-basens position. Når cementen er hærdet, skal du forsigtigt fjerne holdearmen, så Miniscope kan stå alene på musehovedet. Påfør et andet lag tandcement omkring bunden for at udfylde alle hullerne, sikre, at der ikke er nogen LED-lyslækage fra hullerne.Lad tandcementen hærde. Efter kortvarig bedømning af musen med isofluran løsnes låseskruen i bunden med en lille skruetrækker, inden du fjerner beskyttelseshætten og rengør overfladen af GRIN-linsen med en acetone-gennemblødt vatpind. Tilslut Miniscope til kablet, og start NuView-softwaren for at begynde at identificere det bedste brændplan med justering af Miniscope's position i forhold til basen ved let at stramme eller løsne ved hjælp af stump tang.Når det bedste brændplan er bestemt, skal du stramme låseskruen, før du frakobler kablet og placerer musen tilbage i sit hjemmebur. Tænd for adfærdskamerasoftwaren for at se musens adfærdsarena gennem en livestream-funktion. Juster fokus manuelt på det øverste kamera.Vælg Trigger Strobe, og kontroller aktiver/deaktiver udløser, efterfulgt af at klikke på knappen Optag. Brug derefter Gennemse til at vælge et sted, hvor adfærdsoptagelser gemmes. Vælg det ønskede billedformat.Bring musen tæt på arenaen, og tilslut Miniscope til kablet, der er knyttet til dataindsamlingssystemet. Placer derefter musen i midten af arenaen. Klik på Start optagelse i adfærdskamerasoftwaren.I NuView skal du kontrollere LED1, klikke på Capture og derefter udløse knapper for at starte optagelsen. Dette muliggør samtidige optagelser af calciumbilleddannelse og museadfærd. Hit Stop efter 3.000 billeder, og gem filerne.Når optagelsen er færdig, skal du kortvarigt betage musen med isofluran, løsne miniskopet fra basen og lægge beskyttelseshætten over basen, før musen placeres tilbage i sit hjemmebur. Cellekortet fra suboptimal in vivo calciumbilleddannelse indeholdt nogle aktive neuroner, mens det fra vellykket billeddannelse omfattede flere hundrede aktive neuroner i det fokuserede område. I det typiske eksempel på en mislykket in vivo calciumbilleddannelse blev regionen observeret at være mørk og indeholdt mindre end fem aktive neuroner, eller regionen var lys, men havde ingen aktive neuroner.I den repræsentative analyse vises det maksimale projektionsfluorescenscellekort og calciumtransienter fra en successiv in vivo-calciumbilleddannelsesoptagelse. Postmortem-vurderingen for GCaMP6f-ekspression og GRIN-linseimplantation i den mediale PFC af en eksperimentel mus viste, at GCaMP6f blev udtrykt, og GRIN-linsen blev implanteret præcist i den ønskede hjerneregion. For at opnå en god calciumbilleddannelse er det nødvendigt at sikre, at blødningen er helt stoppet, og at feltet er fri for blodpropper, før grin-linsen implanteres.Denne teknik kan bruges til at studere neurale kredsløbsændringer i musemodellen af forskellige menneskelige hjernesygdomme og teste, om en lægemiddelkandidat kan normalisere det ændrede kredsløb.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Ekspansion af embryoniske og voksne neurale stamceller ved<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporering eller viral stereotaktisk injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Stereotaktisk injektion af en virusvektor til Betinget Gene Manipulation i Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Dyb Brain Stimulation med samtidig fMRI i Gnavere

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventrikulær Viral Injektion af Neonatal Mouse Hjerne for Vedvarende og Udbredt Neuronal transduktion

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Ikke-invasiv Parenkymalt, vaskulære og metaboliske højfrekvent ultralyd og Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Funktionel Brain Imaging tilgang baseret på Bioluminescent Calcium Indikator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging til at visualisere hjernen svar til hormonforstyrrende signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging i Mus Ringere Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Hjerne pericyt calcium og hæmodynamisk billeddannelse i transgene mus In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...