Name: stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Ce travail est soutenu par des subventions du National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 et UG3NS115608.

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	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex.">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice.">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li><li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINscope,+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations.">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987 (2020).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice.">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration.">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li><li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior.">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Bassett, J. J., Monteith, G. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice.">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li><li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice.">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li><li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases:+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy.">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).</li><li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre/loxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome.">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li><li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. 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Les auteurs ne font état d’aucun intérêt financier concurrent.

Une question centrale en neurosciences est de comprendre comment la dynamique et les circuits neuronaux codent et stockent l’information, et comment ils sont modifiés dans les maladies du cerveau. À l’aide d’un miniscope in vivo Ca2+ système d’imagerie, l’activité neuronale individuelle de plusieurs centaines de neurones dans un microcircuit local peut être surveillée simultanément à partir d’un animal se comportant librement. Ici, un protocole chirurgical détaillé pour l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN est décrit pour préparer les rongeurs à une imagerie cérébrale profonde in vivo Ca2+ via un système d’enregistrement miniscope développé sur mesure. Le tableau 1 montre les comparaisons de notre système de miniscope avec d’autres systèmes de miniscope disponibles dans le commerce et construits sur mesure 7,8,9,10,11,13,25,26. Il convient de noter que l’implantation de lentilles GRIN à l’aide du protocole chirurgical actuel est compatible avec tous les systèmes d’imagerie commerciaux ou sur mesure à photon unique et à deux photons pour une imagerie calcique in vivo du cerveau profond.
De l’injection virale à l’acquisition de données de l’imagerie calcique in vivo miniscope , l’ensemble de la procédure expérimentale prend au moins 2 mois. C’est un processus compliqué et laborieux. Le succès final de l’expérience dépend de multiples facteurs, y compris le choix approprié des GECI, l’injection de virus avec précision dans la zone cérébrale ciblée, une expression virale suffisante dans la population neuronale souhaitée, l’implantation de lentille GRIN précisément à l’endroit souhaité, une récupération adéquate des chirurgies, ainsi que, si une inflammation grave se produit après la chirurgie, et si le comportement de l’animal est gravement affecté par les chirurgies, et ainsi de suite.
Deux étapes critiques comprennent l’injection stéréotaxique du virus et l’implantation de lentilles GRIN. À des fins de démonstration, la microinjection stéréotaxique a été réalisée dans le mPFC de souris, avec le virus adéno-associé (AAV1) codant GCaMP6f sous le contrôle du promoteur CaMKII qui marque sélectivement les neurones pyramidaux dans le mPFC. GCaMP6f a été choisi car c’est l’un des indicateurs de calcium les plus rapides et les plus sensibles avec un temps de demi-désintégration de 71 ms15. De plus, l’expression virale AAV de GCaMP6f est durable (c.-à-d. plusieurs mois), ce qui la rend idéale pour effectuer une imagerie répétitive in vivo Ca2+ sur une longue période pour des études longitudinales sur des modèles murins de maladies neurodégénératives27. Le protocole chirurgical actuel peut être adapté pour cibler différentes populations cellulaires dans toute autre région du cerveau. Divers outils viraux disponibles permettent le marquage sélectif de populations neuronales spécifiques dans la région cérébrale souhaitée à l’âge souhaité. En outre, les chercheurs peuvent tirer parti du système de recombinaison Cre-LoxP et de divers modèles murins transgéniques disponibles pour effectuer des modifications génétiques et étudier le résultat des circuits comportementaux et neuronaux28,29.
Une caractéristique unique du protocole présenté est que l’aspiration automatisée du tissu cérébral couche par couche a été réalisée avant l’implantation de la lentille GRIN (1 mm de diamètre). Ceci est réalisé grâce à une aiguille de 27 G connectée à un système de vide, contrôlé par un bras robotique sur mesure et un logiciel23. Sur la base de notre expérience, cette méthode génère une surface uniforme pour le contact de la lentille GRIN et cause moins de dommages au tissu voisin que l’aspiration manuelledu tissu 23. Pour cette raison, cette procédure apporte un avantage évident pour les lentilles GRIN avec un diamètre relativement plus large (par exemple, 1 mm). Cependant, l’aspiration tissulaire peut ne pas être nécessaire pour implanter une lentille GRIN de plus petit diamètre (0,5 mm ou 0,25 mm). Au lieu de cela, il peut être directement planté le long de la piste de tête faite avec une aiguille de 30 G21.
Outre les deux étapes critiques discutées ci-dessus, de nombreux autres facteurs doivent être soigneusement pris en compte pour une opération réussie. (1) Tous les instruments qui entrent en contact avec le cerveau doivent être stérilisés pour prévenir l’infection. (2) Toutes les étapes de la chirurgie doivent être effectuées pour minimiser les dommages au cerveau afin de prévenir une inflammation supplémentaire et la formation excessive de tissu cicatriciel. (3) Les doses d’anesthésie administrées initialement et maintenues pendant la chirurgie, en particulier celles administrées par voie intrapéritonéale, doivent être soigneusement examinées. Les doses d’anesthésie peuvent être modifiées en fonction de différentes souches de souris, car certaines peuvent être plus sensibles. (4) L’état de la souris doit être surveillé en permanence pendant la chirurgie. Enfin, (5) les souris doivent être surveillées régulièrement après la chirurgie, car de nombreuses complications peuvent survenir après la chirurgie.
Bien qu’un morceau de tissu cérébral soit prélevé unilatéralement lors de l’étape d’implantation de la lentille GRIN, nous n’avons observé aucun déficit comportemental évident 7,12. Le poids du miniscope est d’environ 2 grammes et le câble est conçu sur mesure pour le rendre léger et pour s’assurer que la souris peut facilement le transporter. Le miniscope et le câble ne sont fixés à l’animal qu’avant l’imagerie in vivo et détachés après l’imagerie. L’ensemble du processus d’imagerie ne prend généralement pas plus de 30 minutes. Par conséquent, ces instruments n’empêchent pas la souris de se comporter librement. Les étapes d’installation et de désinstallation du miniscope nécessitent une brève anesthésie (moins de 2 minutes) avec de l’isoflurane à des fins de contention animale. Nous laissons généralement la souris récupérer de la brève exposition à l’isoflurane pendant 30 minutes avant d’effectuer une imagerie in vivo. Nous avons effectué une imagerie calcique in vivo miniscope une fois par semaine pendant quelques semaines sans remarquer d’impact sur la santé et le comportement social de la souris12.
L’une des principales limites du système d’enregistrement miniscope actuel est la nécessité de connecter le microscope à un câble pour l’acquisition de données. La présence du câble limite parfois les performances de la tâche de la souris et limite l’enregistrement d’un animal à la fois. Récemment, un miniscope sans fil a été développé25,26. Cela élargira la performance des tâches et permettra l’imagerie in vivo simultanée de plusieurs animaux d’un groupe. De plus, le développement d’IESC plus sensibles avec des longueurs d’onde séparables spectralement combinées à un miniscope bicolore offrira des possibilités plus intéressantes pour la recherche en neurosciences.

La signalisation intracellulaire Ca2+ est un régulateur essentiel de la croissance cellulaire, de la prolifération, de la différenciation, de la migration, de la transcription des gènes, de la sécrétion et de l’apoptose1. Dans les neurones, la signalisation Ca2+ est contrôlée avec précision puisque son schéma spatio-temporal est lié à des fonctions cruciales telles que l’excitabilité membranaire, la libération de neurotransmetteurs et la plasticité synaptique2.
L’imagerie calcique in vivo est une technique puissante qui peut être utilisée pour décoder la représentation des circuits neuronaux élémentaires aux comportements animaux normaux, identifier les activités neuronales aberrantes dans les modèles animaux de troubles cérébraux et démêler les cibles thérapeutiques potentielles qui peuvent normaliser ces circuits altérés. Les deux systèmes d’imagerie calcique in vivo courants sont la microscopie à fluorescence à balayage laser à deux photons 3,4,5,6 et la microendoscopie miniaturisée (miniscope) montée sur la tête 7,8,9,10,11,12,13 . La microscopie conventionnelle à deux photons offre des avantages importants tels qu’une meilleure résolution, un bruit réduit et un photoblanchiment plus faible; cependant, les animaux d’expérimentation doivent être fixés à la tête, ce qui limite les études de comportement pouvant être effectuéesà 3,4,5,6. En revanche, le système de miniscope monté sur la tête est petit et portable, ce qui permet d’étudier une grande variété de tests de comportement utilisant des animaux se comportant librement 7,8,9,10,11,12,13.
Il existe deux indicateurs avancés de Ca2+, les indicateurs chimiques 5,14 et les indicateurs de calcium codés génétiquement (GECI)15,16. L’imagerie Ca2+ a été facilitée par l’utilisation de GECI très sensibles délivrés avec des vecteurs viraux qui permettent un marquage spécifique des neurones dans le circuit ciblé. L’effort continu pour améliorer la sensibilité, la longévité et la capacité à marquer même les compartiments subcellulaires rend les GECI idéaux pour diverses études d’imagerie calcique in vivo 17,18,19.
La diffusion de la lumière dans les tissus cérébraux pendant l’imagerie limite la pénétration optique en profondeur, même avec la microscopie à deux photons. Cependant, la lentille GRIN (Gradient Index) surmonte ce problème car la lentille GRIN peut être directement intégrée dans les tissus biologiques et relayer des images de la région profonde du cerveau à l’objectif du microscope. Contrairement à l’objectif conventionnel fait d’un matériau optiquement homogène et nécessitant une surface de forme compliquée pour faire la mise au point et créer des images, la performance de l’objectif GRIN est basée sur un changement progressif de l’indice de réfraction dans le matériau de l’objectif qui permet d’obtenir une mise au point avec une surface plane20. L’objectif GRIN peut être fabriqué jusqu’à 0,2 mm de diamètre. Par conséquent, une lentille GRIN miniaturisée peut être implantée dans le cerveau profond sans causer trop de dommages.
Dans cet article, un protocole chirurgical complet est présenté pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond. À des fins de démonstration, nous décrivons des chirurgies cérébrales ciblant spécifiquement le cortex préfrontal médian (mPFC) du cerveau de la souris et l’enregistrement in vivo de l’imagerie calcique via un système de miniscope sur mesure développé par le groupe du Dr Lin au National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP)7,12. La procédure expérimentale implique deux chirurgies cérébrales majeures. La première chirurgie consiste à injecter stéréotaxiquement un vecteur viral exprimant GCaMP6f (un GECI) dans le mPFC. La deuxième chirurgie consiste à implanter la lentille GRIN dans la même région du cerveau. Après la récupération de ces chirurgies cérébrales, la procédure suivante consiste à apposer le support de miniscope (base) sur le crâne de la souris à l’aide de ciment dentaire. In vivo L’imagerie Ca2+ peut être effectuée à tout moment après le montage du miniscope sur sa base. Le protocole chirurgical pour l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN est compatible avec tous les systèmes d’imagerie commerciale ou sur mesure à photon unique et à deux photons pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6mm and 1.2mm drill burrs</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-G and 30-G needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>REF 305109 and REF305106</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% povidone-iodine solution (Betadine)</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>NDC 67618-151-17</td>
			<td>Surface disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124-1L</td>
			<td>GRIN lens cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-25G</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic ointment</td>
			<td>HeliDerm Technology</td>
			<td>81073087</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc</td>
			<td>30043308</td>
			<td>Acts as pain killer after surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoStereota</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>github.com/liang-bo/autostereota</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)</td>
			<td>Point Grey</td>
			<td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td>
			<td>For recording behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass hex nut</td>
			<td>McMASTER-CARR</td>
			<td>92736A112</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Par Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 4202317905</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commutator</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>BI-OX-CD5C-K</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>OX-M-K</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Microdrill</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Henkel Coorporation</td>
			<td># 1811182</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition controller</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data transmission cable</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>C&#38;B Metabond and Catalyst</td>
			<td>A00253revA306 and A00168revB306</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Duralay</td>
			<td>2249D</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>VETone</td>
			<td>NDC 1398503702</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet gel</td>
			<td>Clear H20</td>
			<td>72-06-5022</td>
			<td>Diet Supplement for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lens</td>
			<td>GRINTECH</td>
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			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Physitemp Instruments LLC.</td>
			<td>#10023</td>
			<td>To keep the mouse body warm during surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 502017</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 501072</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>WEST-WARD</td>
			<td>NDC 0143-9575-01</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe (Hamilton)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>#178647</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope base</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope holding arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope protection cap</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For protecting the miniscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KMTS50E</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuView</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0622</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinch Clamp</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>14040</td>
			<td>For clamping the tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape</td>
			<td>TegaSeal PTFE Tape</td>
			<td>A-A-58092</td>
			<td>For fastening miniScope to the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>RL 7302</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screw</td>
			<td>DECORAH LLC.</td>
			<td>3BT-P9005-00-0025</td>
			<td>For screwing the brass hex nut in miniscope base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Silicone Rubber tubing, 0.062&#8221;ID, 1/8&#8221;OD</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>2124T3</td>
			<td>For irrigation of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic stage</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>REF 806-WC</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Sofsilk</td>
			<td>REF SS683</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>For filtering aCSF during GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100834-AAV1</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 510650</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging

Un microscope à fluorescence miniature (miniscope) est un outil puissant pour l’imagerie calcique in vivo d’animaux se comportant librement. Il offre plusieurs avantages par rapport aux systèmes d’imagerie calcique multiphotoniques conventionnels : (1) compact ; 2° légère; 3° abordable; et (4) permet l’enregistrement d’animaux se comportant librement. Ce protocole décrit les chirurgies cérébrales pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond à l’aide d’un système d’enregistrement miniscope développé sur mesure. La procédure de préparation comprend trois étapes, y compris (1) l’injection stéréotaxique du virus dans la région cérébrale souhaitée du cerveau d’une souris pour marquer un sous-groupe spécifique de neurones avec un capteur de calcium génétiquement codé; (2) implantation d’une lentille à indice de gradient (GRIN) capable de relayer l’image calcique de la région profonde du cerveau vers le système miniscope; et (3) l’apposition du support de miniscope sur le crâne de la souris où le miniscope peut être fixé plus tard. Pour effectuer une imagerie calcique in vivo , le miniscope est fixé sur le support et des images neuronales du calcium sont collectées avec des enregistrements de comportement simultanés. Le protocole chirurgical actuel est compatible avec tous les systèmes d’imagerie à photon unique et à deux photons commerciaux ou construits sur mesure pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond.

La figure 1 montre la procédure expérimentale schématique, y compris l’injection virale, l’implantation de lentilles GRIN, l’apposition de la base du miniscope sur le crâne de la souris et l’imagerie calcique in vivo via un miniscope. L’ensemble de la procédure prend environ 2 mois. La figure 2 montre les principaux composants décrits dans le protocole d’imagerie calcique in vivo miniscope. La figure 3 montre les interfaces du logiciel AutoStereota lors de l’implantation de la lentille GRIN. La figure 4 montre les interfaces de NeuView et du logiciel d’enregistrement du comportement lors de l’imagerie calcique in vivo.
Le résultat de l’imagerie calcique in vivo dépend du succès des chirurgies d’injection virale et d’implantation de lentilles GRIN. La figure 5 montre une gamme de résultats (c.-à-d. infructueux, sous-optimaux et bons) provenant d’enregistrements d’imagerie calcique in vivo . En cas d’échec, l’image du calcium peut apparaître sombre ou brillante, mais ne révèle généralement pas ou très peu de neurones actifs. Nous ne poursuivons généralement pas d’expériences d’enregistrement in vivo du calcium s’il y a moins de cinq neurones actifs. Une bonne imagerie calcique in vivo révèle généralement plusieurs centaines de neurones actifs. Si un enregistrement contient moins d’une centaine de neurones actifs, nous le considérons comme un enregistrement sous-optimal.
Dans des enregistrements sous-optimaux et bons, des expériences d’imagerie calcique in vivo ont été poursuivies et l’analyse ultérieure des données a été effectuée. Le film 1 montre un enregistrement représentatif de l’imagerie calcique in vivo de la souris mPFC. Les vidéos comportementales et les données d’imagerie calcique sont généralement traitées séparément. Les vidéos sur le comportement de la souris peuvent être notées manuellement. Les fichiers d’imagerie calcique sont traités à l’aide de la boîte à outils de traitement d’image calcium CaImAn24. La figure 6 montre une carte cellulaire représentative et plusieurs traces de calcium provenant d’un bon enregistrement in vivo par imagerie calcique.
Après avoir terminé l’imagerie calcique in vivo , la dernière étape consiste à confirmer si l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN ont eu lieu dans la région cérébrale souhaitée. À cette fin, la souris a été perfusée avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de 4% de paraformaldéhyde (PFA). Le cerveau de la souris a été récolté, postfixé dans 4% de PFA pendant 12 h et stocké dans du PBS à 4 °C. Le cerveau de la souris a ensuite été sectionné en tranches de 50 μm d’épaisseur avec un vibratome. Les tranches de cerveau ont été colorées avec du DAPI et observées au microscope (non décrites dans le protocole)12. La figure 7 est une tranche de cerveau de souris d’environ 1,94 mm antérieure à bregma d’une souris expérimentale, montrant la piste où la lentille GRIN a été implantée. La région de fluorescence verte sous et autour de la piste de lentille GRIN indique l’expression de GCaMP6f dans la région mPFC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Figure 1: Aperçu schématique de la procédure expérimentale. (A) Injection stéréotaxique de virus dans le mPFC. (B) Implantation de lentilles GRIN dans le mPFC. (C) Fixation de la base du miniscope sur le crâne de la souris. (D) Montage du miniscope et imagerie calcique in vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Figure 2 : Principaux composants nécessaires à l’imagerie calcique in vivo. (A) Un objectif GRIN de 1 mm de diamètre et 4,38 mm de longueur. (B) Aiguille à extrémité émoussée polie manuellement de 27 G utilisée pour l’aspiration du tissu cérébral. (C) Le bras robotique couplé au porte-aiguille. (D) Un capuchon sur mesure à partir d’un tube PCR pour protéger la lentille GRIN exposée jusqu’à l’apposition de la base du miniscope sur le crâne de la souris. (E) Le support de miniscope (base) avec un écrou hexagonal. (F) Un miniscope dont la partie filetée est enveloppée avec le ruban PTFE. (G) Un miniscope fixé à sa base avec une vis de verrouillage. (H) Le bras de maintien du miniscope. (I) Un contrôleur motorisé 3D sur mesure utilisé pour faciliter le mouvement du miniscope dans les positions XYZ. (J) Un capuchon de protection fixé à la base pour protéger la lentille GRIN exposée pendant que la souris n’effectue pas d’imagerie calcique in vivo. (K) Le miniscope connecté au câble. (L) Le système d’acquisition de données pour l’imagerie in vivo Ca2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Figure 3 : Interfaces du logiciel AutoStereota lors de l’aspiration du tissu cérébral couche par couche. (A) Interface correspondant aux étapes 2.17.1 à 2.17.3. B) L’interface correspondant aux étapes 2.17.4 à 2.17.6. (C) L’interface correspondant aux étapes 2.17.7 à 2.17.9. D) L’interface correspondant aux étapes 2.17.10 à 2.17.12. Les zones rouges mettent en surbrillance les valeurs d’entrée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Figure 4 : Interfaces du logiciel NeuView et du logiciel d’enregistrement du comportement lors de l’imagerie calcique in vivo. (A) L’interface de NeuView. (B,C) Les interfaces du logiciel d’enregistrement de comportement. Les cases rouges mettent en surbrillance les boutons sur lesquels il faut cliquer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Figure 5 : Cartes des cellules de fluorescence de projection maximale pour montrer l’éventail des résultats possibles. (A,B) Imagerie calcique in vivo infructueuse qui n’est pas acceptable pour l’analyse ultérieure des données. (A) est sombre et contient moins de 5 neurones actifs. (B) est brillant mais n’a pas de neurones actifs. (C) La carte cellulaire d’une imagerie calcique in vivo sous-optimale qui contient des neurones actifs. (D) La carte cellulaire d’une bonne imagerie calcique in vivo qui comprend plusieurs centaines de neurones actifs. Barre d’échelle: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Figure 6 : Carte cellulaire représentative et transitoires calciques provenant d’une imagerie calcique in vivo réussie. Le panneau de gauche est la carte de la cellule de fluorescence de projection maximale d’un enregistrement in vivo d’imagerie calcique dans le mPFC lors d’un test en champ ouvert. L’enregistrement dure 5 min. Le panneau de droite montre les transitoires de calcium de 15 régions d’intérêt (couleur assortie). Barre d’échelle: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Figure 7 : Évaluation post-mortem d’une souris expérimentale. L’évaluation post-mortem de l’expression de GCaMP6f et de l’implantation de lentilles GRIN dans le mPFC d’une souris expérimentale. La zone rectangulaire indique le chemin d’implantation de la lentille GRIN. La zone verte sous la région implantée de la lentille GRIN confirme que GCaMP6f a été exprimé et que la lentille GRIN a été implantée avec précision dans la région cérébrale souhaitée. Cg, cortex cingulaire; PrL, cortex prélimbique; IL, cortex infralimbique. Barre d’échelle: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Comparaisons du système de miniscope sur mesure du NIDA avec d’autres systèmes de miniscope 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Film 1 : Un enregistrement in vivo d’imagerie calcique de la souris mPFC lors d’un test en champ ouvert. À des fins de démonstration, cette vidéo ne montre que 1 min d’enregistrement. La fréquence d’images d’enregistrement d’origine est de 10 images/s. La vidéo est 6 fois plus rapide que l’enregistrement original. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

L’imagerie calcique in vivo Miniscope est une technique puissante pour étudier la dynamique neuronale et les microcircuits chez des souris qui se comportent librement. Ce protocole décrit la réalisation de chirurgies cérébrales pour obtenir une bonne imagerie calcique in vivo à l’aide d’un miniscope.

Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

L’imagerie calcique in vivo Miniscope permet aux chercheurs d’examiner l’activité coordonnée spatialement et temporellement de centaines de neurones dans les structures cérébrales profondes d’animaux se comportant librement. L’imagerie calcique in vivo Miniscope offre de nombreux avantages, notamment la possibilité d’effectuer des enregistrements spécifiques au type de cellule, à grande échelle et longitudinal. Notre protocole chirurgical pour l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN est compatible avec tous les systèmes d’imagerie à photon unique et à deux photons commerciaux ou personnalisés pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond.Rashmi Thapa, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après avoir désinfecté la zone chirurgicale rasée d’une souris anesthésiée, utilisez un scalpel pour faire une incision de deux centimètres à travers la peau le long de la ligne médiane pour exposer le lambda et le bregma du crâne. Après avoir localisé la bavure de forage dentaire de 0,5 millimètre dans une position antérieure postérieure de 1,94 millimètre et latérale médiale de 0,5 millimètre à partir de la bregma, commencez à percer le crâne.Ensuite, chargez le virus dans la seringue de microlitre à l’aide du panneau de commande de la micropompe et retirez 500 nanolitres de bulle d’air suivis de 800 nanolitres du virus à un débit de 50 nanolitres par seconde. Descendez lentement l’aiguille dans le tissu cérébral jusqu’à la coordonnée Z ciblée de 1,75 millimètre ventral dorsal, puis déplacez-la légèrement jusqu’à la coordonnée Z de ventral dorsal de 1,65 millimètre. Sur le panneau de commande, réglez la micro-pompe pour injecter 500 nanolitres du virus au débit de 50 nanolitres par minute avant d’appuyer sur le bouton Exécuter pour injecter le virus.Lorsque l’injection est terminée, alignez les bords de la peau et fermez soigneusement l’incision avec une suture 4-0. Appliquez une pommade antibiotique sur la zone cousue pour prévenir l’infection. Pour implanter un indice de gradient ou une lentille GRIN, excisez une zone triangulaire de la peau de 1,5 centimètre de hauteur et une base de 1,5 centimètre de la face antérieure entre les yeux vers la face postérieure derrière le lambda à l’aide de ciseaux fins.Une fois le crâne soigneusement nettoyé et séché, appliquez du cyanoacrylate sur les bords de la peau et attachez la peau au crâne. Après cinq minutes, lorsque le cyanoacrylate sèche, localisez une bavure de forage dentaire de 1,2 millimètre de diamètre à une position postérieure antérieure de 1,94 millimètre, latérale médiale de 0,8 millimètre du bregma. Percez à travers le crâne, puis retirez la dure-mère à l’aide d’une pointe d’aiguille de calibre 30.Nettoyez tous les débris osseux avec des pinces pointues inclinées à 45 degrés. Ensuite, fixez une aiguille d’extrémité émoussée polie manuellement de calibre 27 au porte-aiguille couplé à un bras robotique incliné avec un angle de 10 degrés et connectez l’autre extrémité du porte-aiguille au système d’aspirateur de la maison. Localisez la pointe de l’aiguille pour simplement toucher le bregma avant de cliquer sur le bouton Bregma pour régler la coordonnée Z du bregma sur zéro.Définissez la valeur x d’entrée sur 0,8, la valeur d’entrée Y sur 1,94, la valeur d’entrée Z sur 1,0 et cliquez sur le bouton Rechercher pour déplacer l’aiguille sur le dessus du trou percé sur le crâne. Centrez la pointe de l’aiguille sur le trou percé et ramenez-la à la position Z zéro. Allumez le vide et commencez à rincer la zone cérébrale exposée avec du liquide céphalo-rachidien artificiel, ou ACSF, à l’aide d’un système de tuyauterie à gravité contrôlée relié à une aiguille de calibre 30 avec une pointe pliée.ACSF est continuellement bouillonné avec un mélange gazeux de 95% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone tout en étant filtré à travers un filtre de 0,2 micron. En utilisant le logiciel AutoStereota, l’aspiration du tissu cérébral se terminera en quatre tours. Pour le premier tour d’aspiration, assurez-vous que la valeur Z affiche zéro.Ensuite, dans la session zStep, cliquez et vérifiez les première et deuxième lignes. Définissez les valeurs de la première ligne sur 0,2 et 1. Définissez les valeurs de la deuxième ligne sur 0,15 et 4.En mode session, réglez la taille de l’aiguille 27 jauge et 1.2. Réglez Dims 0,9. Toutes les autres valeurs seront par défaut.Pour démarrer l’aspiration, cliquez séquentiellement sur les boutons NotSet, KeepZero et Start. Le premier cycle d’aspiration génère une poche colonne de 0,8 millimètre de profondeur et 1 millimètre de diamètre. Dans le troisième cycle d’aspiration, cliquez et vérifiez la première ligne de la session zStep et définissez les valeurs de la première ligne sur 1,8 et 1.En mode session, réglez la taille de l’aiguille 27 jauge et 2.2. Commencez l’aspiration en gardant les autres valeurs les mêmes que celles du tour précédent. Après le troisième cycle d’aspiration, la profondeur de la poche de la colonne est de 1,8 millimètre.La dernière série d’aspirations consiste à nettoyer le sang accumulé au fond de la poche. Définissez les valeurs de la première ligne sur 1,6 et 1 dans la session zStep et définissez la taille de l’aiguille 27 jauge et 2,2 et Dims 0,6 dans la session Mode avant de commencer l’aspiration. Une fois que la poche est libre de sang, arrêtez le vide, arrêtez l’irrigation de l’ACSF et amenez l’aiguille de 2 millimètres en coordonnée Z et de 0,5 millimètre avant au centre.Placez la lentille GRIN stérile de 1 millimètre dans la poche de tissu cérébral. Ensuite, appliquez l’agarose fondue dans l’espace entre la lentille GRIN et le tissu cérébral à l’aide d’une spatule. Après que l’agarose a formé un gel, éliminer l’excès d’agarose à l’aide d’une micro lame.Mélangez la poudre de ciment dentaire et le liquide catalyseur dans un puits de mélange pré-refroidi et appliquez une couche de ciment de résine adhésive auto-durcissant sur le crâne, en commençant par entourer la lentille GRIN, puis en recouvrant tout le crâne exposé. Dans un puits en plastique propre, mélangez la poudre de ciment dentaire et le charbon de bois noir avec du liquide pour appliquer une fine couche du mélange sur la première couche de ciment dentaire. Laissez durcir pendant cinq minutes.Connectez le Miniscope au câble et allumez le logiciel personnalisé NuView. Dans NuView, cliquez sur Matériel, cochez LED1 et cliquez sur le bouton Flux pour afficher les images en direct. Pour arrêter la diffusion en direct, cliquez sur le bouton Arrêter.Ensuite, installez le Miniscope dans un bras de maintien Miniscope sur mesure. À l’aide de contrôleurs motorisés, localisez le Miniscope juste au-dessus de l’objectif GRIN exposé, en le rendant parallèle à la surface de l’objectif. Abaissez lentement le Miniscope vers l’objectif GRIN et ajustez sa position Z jusqu’à ce que le meilleur plan de mise au point soit trouvé.Appliquez la première couche de ciment dentaire autour de la base du Miniscope sans modifier la position du Miniscope. Une fois le ciment durci, retirez doucement le bras de maintien de sorte que le Miniscope puisse se tenir seul sur la tête de la souris. Appliquez une deuxième couche de ciment dentaire autour de la base pour combler tous les espaces, en vous assurant qu’il n’y a pas de fuite de lumière LED des espaces.Laissez le ciment dentaire durcir. Après avoir brièvement anesthésié la souris avec de l’isoflurane, desserrez la vis de verrouillage de la base avec un petit tournevis avant de retirer le capuchon de protection et nettoyez la surface de la lentille GRIN avec un coton-tige imbibé d’acétone. Connectez le Miniscope au câble et démarrez le logiciel NuView pour commencer à identifier le meilleur plan focal en ajustant la position du Miniscope par rapport à la base en resserrant ou en desserrant légèrement à l’aide de pinces contondantes.Une fois le meilleur plan focal déterminé, serrez la vis de verrouillage avant de déconnecter le câble et de replacer la souris dans sa cage d’origine. Activez le logiciel de la caméra de comportement pour afficher l’arène de comportement de la souris via une fonction de diffusion en direct. Réglez manuellement la mise au point de l’appareil photo supérieur.Sélectionnez Trigger Strobe et cochez activer/désactiver le déclencheur, puis cliquez sur le bouton Enregistrer. Utilisez ensuite Parcourir pour sélectionner un emplacement où les enregistrements de comportement seront enregistrés. Sélectionnez le format d’image souhaité.Rapprochez la souris de l’arène et connectez le Miniscope au câble relié au système d’acquisition de données. Placez ensuite la souris au centre de l’arène. Dans le logiciel de la caméra de comportement, cliquez sur Démarrer l’enregistrement.Dans NuView, cochez LED1, cliquez sur Capturer, puis déclenchez des boutons pour démarrer l’enregistrement. Cela permet des enregistrements simultanés de l’imagerie calcique et du comportement de la souris. Appuyez sur Arrêter après 3 000 images et enregistrez les fichiers.Lorsque l’enregistrement est terminé, anesthésiez brièvement la souris avec de l’isoflurane, détachez le Miniscope de la base et placez le capuchon de protection sur la base avant de replacer la souris dans sa cage d’origine. La carte cellulaire de l’imagerie calcique in vivo sous-optimale contenait des neurones actifs, tandis que celle de l’imagerie réussie comprenait plusieurs centaines de neurones actifs dans la zone ciblée. Dans l’exemple typique d’une imagerie calcique in vivo infructueuse, on a observé que la région était sombre et contenait moins de cinq neurones actifs, ou que la région était brillante mais n’avait pas de neurones actifs.Dans l’analyse représentative, la carte cellulaire de fluorescence de projection maximale et les transitoires calciques d’un enregistrement in vivo successif d’imagerie calcique sont montrés. L’évaluation post-mortem de l’expression de GCaMP6f et de l’implantation de lentilles GRIN dans le PFC médial d’une souris expérimentale a indiqué que GCaMP6f a été exprimé et que la lentille GRIN a été implantée avec précision dans la région cérébrale souhaitée. Pour obtenir une bonne imagerie calcique, il est nécessaire de s’assurer que le saignement s’est complètement arrêté et que le champ est exempt de caillots sanguins avant d’implanter la lentille GRIN.Cette technique peut être utilisée pour étudier les changements de circuit neuronal dans le modèle murin de différents troubles cérébraux humains et tester si un candidat médicament peut normaliser les circuits altérés.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Recherche

Neurosciences

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

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Expansion du embryonnaires et cellules souches neurales adultes par<em&gt; In Utero</em&gt; Électroporation ou virale par injection stéréotaxique

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Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

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Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Calcium péricyte cérébral et imagerie hémodynamique chez des souris transgéniques in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...