Name: stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Diese Arbeit wird durch Zuschüsse des National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 und UG3NS115608 unterstützt.

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	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex.">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice.">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li><li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning.">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li><li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information.">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINscope,+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations.">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987 (2020).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice.">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration.">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li><li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior.">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery.">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li><li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient-index+optics:+A+review.">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals.">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging.">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li><li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation.">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173 (2019).</li><li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice.">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li><li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice.">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li><li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases:+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy.">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).</li><li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre/loxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome.">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li><li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-loxP-mediated+recombination:+General+principles+and+experimental+considerations.">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li></ol>

Die Autoren berichten von keinen konkurrierenden finanziellen Interessen.

Eine zentrale Frage in den Neurowissenschaften ist das Verständnis, wie neuronale Dynamik und Schaltkreise Informationen kodieren und speichern und wie sie bei Gehirnerkrankungen verändert werden. Mit einem Miniscope in vivo Ca2+ Bildgebungssystem kann die individuelle neuronale Aktivität von mehreren hundert Neuronen innerhalb eines lokalen Mikroschaltkreises gleichzeitig von einem sich frei verhaltenden Tier überwacht werden. Hier wird ein detailliertes Operationsprotokoll für die virale Injektion und GRIN-Linsenimplantation beschrieben, um Nagetiere über ein speziell entwickeltes Miniscope-Aufzeichnungssystem auf eine tiefe Gehirn-in-vivo-Ca 2+-Bildgebung vorzubereiten. Tabelle 1 zeigt die Vergleiche unseres Miniscope-Systems mit anderen handelsüblichen und kundenspezifischen Miniscope-Systemen 7,8,9,10,11,13,25,26. Es ist erwähnenswert, dass die GRIN-Linsenimplantation unter Verwendung des vorliegenden chirurgischen Protokolls mit allen kommerziellen oder kundenspezifischen Einzelphotonen- und Zwei-Photonen-Bildgebungssystemen für eine Deep-Brain-In-vivo-Kalziumbildgebung kompatibel ist.
Von der viralen Injektion bis zur Datenerfassung der Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung dauert das gesamte experimentelle Verfahren mindestens 2 Monate. Es ist ein komplizierter und arbeitsintensiver Prozess. Der letztendliche Erfolg des Experiments hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der richtigen Auswahl der GECIs, der genauen Injektion des Virus in den Zielhirnbereich, der ausreichenden Virusexpression in der gewünschten neuronalen Population, der Implantation der GRIN-Linse genau an der gewünschten Stelle, der ausreichenden Erholung von Operationen sowie der Frage, ob nach der Operation eine schwere Entzündung auftritt und ob das Verhalten des Tieres durch Operationen stark beeinträchtigt wird. Und so weiter.
Zwei kritische Schritte umfassen die stereotaktische Injektion von Viren und die Implantation von GRIN-Linsen. Zu diesem Demonstrationszweck wurde die stereotaktische Mikroinjektion in der mPFC der Maus durchgeführt, wobei das Adeno-assoziierte Virus (AAV1) GCaMP6f unter der Kontrolle eines CaMKII-Promotors kodiert, der pyramidale Neuronen im mPFC selektiv markiert. GCaMP6f wurde ausgewählt, da es mit einer halben Zerfallszeit von 71 ms15 einer der schnellsten und empfindlichsten Kalziumindikatoren ist. Darüber hinaus ist die virale AAV-Expression von GCaMP6f lang anhaltend (d. h. mehrere Monate), was sie ideal für die Durchführung repetitiver In-vivo-Ca 2 + -Bildgebung über einen langen Zeitraum für Längsschnittstudien in Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungenist 27. Das aktuelle Operationsprotokoll kann angepasst werden, um verschiedene Zellpopulationen in jeder anderen Gehirnregion anzusprechen. Verschiedene verfügbare virale Werkzeuge ermöglichen die selektive Markierung spezifischer neuronaler Populationen in der gewünschten Hirnregion im gewünschten Alter. Darüber hinaus können Forscher das Cre-LoxP-Rekombinationssystem und verschiedene verfügbare transgene Mausmodelle nutzen, um genetische Modifikationen durchzuführen und das Ergebnis von Verhaltens- und neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen28,29.
Ein einzigartiges Merkmal des vorgestellten Protokolls ist, dass die automatisierte Schicht-für-Schicht-Hirngewebeaspiration vor der Implantation der GRIN-Linse (1 mm Durchmesser) durchgeführt wurde. Dies wird durch eine 27-G-Nadel erreicht, die mit einem Vakuumsystem verbunden ist, das von einem speziell angefertigten Roboterarm und der Software23 gesteuert wird. Basierend auf unserer Erfahrung erzeugt diese Methode eine gleichmäßige Oberfläche für den Kontakt mit der GRIN-Linse und verursacht weniger Schäden am benachbarten Gewebe als die manuelle Gewebeaspiration23. Aus diesem Grund bringt dieses Verfahren einen offensichtlichen Vorteil für GRIN-Linsen mit einem relativ breiteren Durchmesser (z. B. 1 mm). Für die Implantation einer GRIN-Linse mit einem kleineren Durchmesser (0,5 mm oder 0,25 mm) ist jedoch möglicherweise keine Gewebeaspiration erforderlich. Stattdessen kann es direkt entlang der führenden Spur mit einer 30 G Nadel21 gepflanzt werden.
Neben den beiden oben besprochenen kritischen Schritten müssen viele weitere Faktoren für eine erfolgreiche Operation sorgfältig abgewogen werden. (1) Alle Instrumente, die das Gehirn berühren, sollten sterilisiert werden, um eine Infektion zu verhindern. (2) Alle chirurgischen Schritte müssen durchgeführt werden, um die Schädigung des Gehirns zu minimieren und weitere Entzündungen und übermäßige Narbengewebebildung zu verhindern. (3) Die Anästhesiedosen, die anfangs verabreicht und während der Operation aufrechterhalten werden, insbesondere diejenigen, die intraperitoneal verabreicht werden, müssen sorgfältig abgewogen werden. Die Anästhesiedosen können je nach Mausstämmen modifiziert werden, da einige anfälliger sein können. (4) Der Zustand der Maus muss während der Operation ständig überwacht werden. Schließlich (5) müssen die Mäuse nach der Operation regelmäßig überwacht werden, da nach der Operation viele Komplikationen auftreten können.
Obwohl während des Implantationsschritts der GRIN-Linse einseitig ein Stück Hirngewebe entfernt wird, haben wir keine offensichtlichen Verhaltensdefizite beobachtet 7,12. Das Gewicht des Miniscopes beträgt etwa 2 Gramm und das Kabel wurde speziell entwickelt, um es leicht zu machen und sicherzustellen, dass die Maus es leicht tragen kann. Das Miniskop und das Kabel werden erst vor der In-vivo-Bildgebung am Tier befestigt und nach der Bildgebung abgelöst. Der gesamte Bildgebungsprozess dauert in der Regel nicht länger als 30 Minuten. Daher hindern diese Instrumentierungen die Maus nicht daran, sich frei zu verhalten. Die Installations- und Deinstallationsschritte des Miniscopes erfordern eine kurze Anästhesie (weniger als 2 Minuten) mit Isofluran zum Zwecke der Tierhaltung. Normalerweise lassen wir die Maus 30 Minuten lang von der kurzen Exposition von Isofluran erholen, bevor wir eine In-vivo-Bildgebung durchführen. Wir haben einige Wochen lang einmal pro Woche eine Miniscope-In-vivo-Kalziumbildgebung durchgeführt, ohne Auswirkungen auf die Gesundheit der Maus und das Sozialverhalten der Maus zu bemerken12.
Eine wesentliche Einschränkung des derzeitigen Miniscope-Aufzeichnungssystems ist die Notwendigkeit, das Mikroskop zur Datenerfassung an ein Kabel anzuschließen. Das Vorhandensein des Kabels schränkt manchmal die Ausführung der Mausaufgabe ein und schränkt die Aufnahme eines Tieres nach dem anderen ein. Vor kurzem wurde ein drahtloses Miniscope entwickelt25,26. Dies erweitert die Aufgabenleistung und ermöglicht die gleichzeitige In-vivo-Bildgebung von mehreren Tieren in einer Gruppe. Darüber hinaus wird die Entwicklung empfindlicherer GECIs mit spektral trennbaren Wellenlängen in Kombination mit einem zweifarbigen Miniscope weitere aufregende Möglichkeiten für die neurowissenschaftliche Forschung bieten.

Die intrazelluläre Ca2 + -Signalgebung ist ein wesentlicher Regulator für Zellwachstum, Proliferation, Differenzierung, Migration, Gentranskription, Sekretion und Apoptose1. In Neuronen wird die Ca2+ -Signalgebung präzise gesteuert, da ihr räumlich-zeitliches Muster mit entscheidenden Funktionen wie der Erregbarkeit der Membran, der Freisetzung von Neurotransmittern und der synaptischen Plastizität2 zusammenhängt.
In vivo Calcium-Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik, die verwendet werden kann, um die Repräsentation neuronaler Schaltkreise elementar zu normalem Tierverhalten zu entschlüsseln, abweichende neuronale Aktivitäten in Tiermodellen von Hirnerkrankungen zu identifizieren und potenzielle therapeutische Ziele zu entschlüsseln, die diese veränderten Schaltkreise normalisieren können. Die beiden gängigen In-vivo-Calcium-Bildgebungssysteme sind Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie 3,4,5,6 und Head-Mounted-Miniatur-Mikroendoskopie (Miniskop) 7,8,9,10,11,12,13 . Die konventionelle Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet entscheidende Vorteile wie bessere Auflösung, geringeres Rauschen und geringeres Photobleichen; Die Versuchstiere müssen jedoch kopffest fixiert werden, was die Verhaltensstudien, die durchgeführt werden können,auf 3,4,5,6 begrenzt. Im Gegensatz dazu ist das am Kopf montierte Miniscope-System klein und tragbar, so dass es möglich ist, eine Vielzahl von Verhaltenstests mit sich frei verhaltenden Tieren 7,8,9,10,11,12,13 zu untersuchen.
Es gibt zwei Ca2+-Frühindikatoren, chemische Indikatoren5,14 und genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) 15,16. Die Ca2+-Bildgebung wurde durch die Verwendung hochempfindlicher GECIs erleichtert, die mit viralen Vektoren geliefert werden, die eine spezifische Markierung von Neuronen im Zielschaltkreis ermöglichen. Die kontinuierlichen Bemühungen, die Empfindlichkeit, Langlebigkeit und Fähigkeit, sogar die subzellulären Kompartimente zu kennzeichnen, zu verbessern, machen GECIs ideal für verschiedene In-vivo-Kalziumbildgebungsstudien 17,18,19.
Die Streuung von Licht im Hirngewebe während der Bildgebung begrenzt die optische Durchdringung in der Tiefe, selbst bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die Gradientenindex-Linse (GRIN) überwindet dieses Problem jedoch, da die GRIN-Linse direkt in das biologische Gewebe eingebettet werden kann und Bilder von der tiefen Hirnregion an das Mikroskopobjektiv weiterleitet. Im Gegensatz zu herkömmlichen Linsen aus optisch homogenem Material und einer kompliziert geformten Oberfläche, um zu fokussieren und Bilder zu erzeugen, basiert die GRIN-Linsenleistung auf einer allmählichen Brechungsindexänderung innerhalb des Linsenmaterials, die den Fokus mit einer ebenen Oberfläche20 erreicht. GRIN-Linsen können bis zu einem Durchmesser von 0,2 mm hergestellt werden. Daher kann eine miniaturisierte GRIN-Linse in das tiefe Gehirn implantiert werden, ohne zu viel Schaden anzurichten.
In diesem Artikel wird ein vollständiges Operationsprotokoll für die Deep-Brain-In-vivo-Kalziumbildgebung vorgestellt. Zu diesem Demonstrationszweck beschreiben wir Gehirnoperationen, die speziell auf den medialen präfrontalen Kortex (mPFC) des Mausgehirns abzielen, und die In-vivo-Kalziumbildgebung über ein speziell entwickeltes Miniscope-System, das von Dr. Lins Gruppe am National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) entwickelt wurde) 7,12. Das experimentelle Verfahren umfasst zwei große Gehirnoperationen. Die erste Operation ist die stereotaktische Injektion eines viralen Vektors, der GCaMP6f (ein GECI) im mPFC exprimiert. Die zweite Operation besteht darin, die GRIN-Linse in die gleiche Gehirnregion zu implantieren. Nach der Genesung von diesen Gehirnoperationen besteht das anschließende Verfahren darin, den Miniscope-Halter (Basis) mit Zahnzement am Mausschädel anzubringen. Im lebenden Organismus Ca2+ Bildgebung kann jederzeit nach der Montage des Miniscopes auf seiner Basis durchgeführt werden. Das Operationsprotokoll für die virale Injektion und die Implantation der GRIN-Linse ist mit allen kommerziellen oder kundenspezifischen Einzelphotonen- und Zwei-Photonen-Bildgebungssystemen für die Calcium-Bildgebung des tiefen Gehirns kompatibel.

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		<tr>
			<td>0.6mm and 1.2mm drill burrs</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-G and 30-G needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>REF 305109 and REF305106</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% povidone-iodine solution (Betadine)</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>NDC 67618-151-17</td>
			<td>Surface disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124-1L</td>
			<td>GRIN lens cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-25G</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic ointment</td>
			<td>HeliDerm Technology</td>
			<td>81073087</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc</td>
			<td>30043308</td>
			<td>Acts as pain killer after surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoStereota</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>github.com/liang-bo/autostereota</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)</td>
			<td>Point Grey</td>
			<td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td>
			<td>For recording behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass hex nut</td>
			<td>McMASTER-CARR</td>
			<td>92736A112</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Par Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 4202317905</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commutator</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>BI-OX-CD5C-K</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>OX-M-K</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Microdrill</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Henkel Coorporation</td>
			<td># 1811182</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition controller</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data transmission cable</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>C&#38;B Metabond and Catalyst</td>
			<td>A00253revA306 and A00168revB306</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Duralay</td>
			<td>2249D</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>VETone</td>
			<td>NDC 1398503702</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet gel</td>
			<td>Clear H20</td>
			<td>72-06-5022</td>
			<td>Diet Supplement for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lens</td>
			<td>GRINTECH</td>
			<td>NEM-100-25-10-860-S</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Physitemp Instruments LLC.</td>
			<td>#10023</td>
			<td>To keep the mouse body warm during surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 502017</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 501072</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>WEST-WARD</td>
			<td>NDC 0143-9575-01</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe (Hamilton)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>#178647</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope base</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope holding arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope protection cap</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For protecting the miniscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KMTS50E</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuView</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0622</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinch Clamp</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>14040</td>
			<td>For clamping the tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape</td>
			<td>TegaSeal PTFE Tape</td>
			<td>A-A-58092</td>
			<td>For fastening miniScope to the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>RL 7302</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screw</td>
			<td>DECORAH LLC.</td>
			<td>3BT-P9005-00-0025</td>
			<td>For screwing the brass hex nut in miniscope base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Silicone Rubber tubing, 0.062&#8221;ID, 1/8&#8221;OD</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>2124T3</td>
			<td>For irrigation of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic stage</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>REF 806-WC</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Sofsilk</td>
			<td>REF SS683</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>For filtering aCSF during GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100834-AAV1</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 510650</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging

Ein Miniatur-Fluoreszenzmikroskop (Miniskop) ist ein wirksames Werkzeug für die In-vivo-Kalziumbildgebung von sich frei verhaltenden Tieren. Es bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Multi-Photonen-Calcium-Bildgebungssystemen: (1) kompakt; (2) leichtgewichtig; (3) erschwinglich; und (4) ermöglicht die Aufzeichnung von sich frei verhaltenden Tieren. Dieses Protokoll beschreibt Gehirnoperationen für die Deep-Brain-in-vivo-Kalziumbildgebung unter Verwendung eines speziell entwickelten Miniscope-Aufzeichnungssystems. Das Präparationsverfahren besteht aus drei Schritten, einschließlich (1) der stereotaktischen Injektion des Virus in die gewünschte Hirnregion eines Mausgehirns, um eine bestimmte Untergruppe von Neuronen mit einem genetisch kodierten Calciumsensor zu kennzeichnen; (2) Implantation einer GRIN-Linse (Gradient-Index), die Kalziumbild von der tiefen Hirnregion an das Miniscope-System weiterleiten kann; und (3) den Miniscope-Halter über dem Mausschädel anbringen, an dem das Miniscope später befestigt werden kann. Um eine In-vivo-Kalziumbildgebung durchzuführen, wird das Miniscope am Halter befestigt und neuronale Kalziumbilder werden zusammen mit gleichzeitigen Verhaltensaufzeichnungen gesammelt. Das vorliegende Operationsprotokoll ist mit allen kommerziellen oder kundenspezifischen Einzelphotonen- und Zwei-Photonen-Bildgebungssystemen für die In-vivo-Kalziumbildgebung des tiefen Gehirns kompatibel.

Abbildung 1 zeigt das schematische experimentelle Verfahren, einschließlich viraler Injektion, GRIN-Linsenimplantation, Anheftung der Miniscope-Base am Mausschädel und In-vivo-Calcium-Bildgebung über ein Miniskop. Der gesamte Eingriff dauert ~2 Monate. Abbildung 2 zeigt die Hauptkomponenten, die im Protokoll für die Miniscope-In-vivo-Calciumbildgebung beschrieben sind. Abbildung 3 zeigt die Schnittstellen der AutoStereota-Software während der Implantation der GRIN-Linse. Abbildung 4 zeigt die Schnittstellen von NeuView und Verhaltensaufzeichnungssoftware während der In-vivo-Kalziumbildgebung.
Das Ergebnis der In-vivo-Kalziumbildgebung hängt vom Erfolg sowohl der viralen Injektion als auch der GRIN-Linsenimplantationsoperationen ab. Abbildung 5 zeigt eine Reihe von Ergebnissen (d. h. erfolglos, suboptimal und gut) aus In-vivo-Calcium-Bildgebungsaufzeichnungen . In erfolglosen Fällen kann das Kalziumbild entweder dunkel oder hell erscheinen, zeigt aber normalerweise keine oder nur sehr wenige aktive Neuronen. Wir verfolgen normalerweise keine In-vivo-Kalzium-Aufzeichnungsexperimente , wenn es weniger als fünf aktive Neuronen gibt. Eine gute In-vivo-Kalziumbildgebung zeigt typischerweise mehrere hundert aktive Neuronen. Wenn eine Aufnahme weniger als hundert aktive Neuronen enthält, betrachten wir sie als suboptimale Aufzeichnung.
Sowohl in suboptimalen als auch in guten Aufzeichnungen in vivo wurden Calcium-Bildgebungsexperimente durchgeführt und die anschließende Datenanalyse durchgeführt. Film 1 zeigt eine repräsentative In-vivo-Calcium-Bildgebungsaufzeichnung von der Maus mPFC. Verhaltensvideos und Kalziumbildgebungsdaten werden in der Regel separat verarbeitet. Videos zum Verhalten der Maus können manuell bewertet werden. Calcium-Bildgebungsdateien werden mit der CaImAn Calcium-Bildverarbeitungs-Toolbox24 verarbeitet. Abbildung 6 zeigt eine repräsentative Zellkarte und mehrere Kalziumspuren aus einer guten In-vivo-Calciumbildaufnahme.
Nach Abschluss der In-vivo-Calcium-Bildgebung besteht der letzte Schritt darin, zu bestätigen, ob die virale Injektion und GRIN-Linsenimplantation in der gewünschten Hirnregion stattgefunden hat. Zu diesem Zweck wurde die Maus mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durchblutet, gefolgt von 4% Paraformaldehyd (PFA). Das Gehirn der Maus wurde geerntet, in 4% PFA für 12 h postfixiert und in PBS bei 4 °C gelagert. Das Mäusegehirn wurde dann in 50 μm dicke Scheiben mit einem Vibratom geschnitten. Die Hirnschnitte wurden mit DAPI gefärbt und unter dem Mikroskop beobachtet (nicht im Protokoll beschrieben)12. Abbildung 7 zeigt eine Maus-Gehirnscheibe ~ 1,94 mm vor Bregma von einer experimentellen Maus, die die Spur zeigt, wo die GRIN-Linse implantiert wurde. Der grüne Fluoreszenzbereich unter und um die GRIN-Linsenspur zeigt die Expression von GCaMP6f im mPFC-Bereich an.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematischer Überblick über das experimentelle Vorgehen . (A) Stereotaktische Injektion des Virus in den mPFC. (B) Implantation von GRIN-Linsen in den mPFC. (C) Anbringen der Miniscope-Basis am Mausschädel. (D) Miniscope-Montage und In-vivo-Calcium-Bildgebung . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Abbildung 2: Hauptkomponenten, die für die In-vivo-Kalziumbildgebung benötigt werden. (A) Eine GRIN-Linse mit 1 mm Durchmesser und 4,38 mm Länge. (B) Eine manuell polierte stumpfe Nadel mit 27 G, die für die Aspiration des Hirngewebes verwendet wird. (C) Der Roboterarm, der mit dem Nadelhalter gekoppelt ist. (D) Eine maßgeschneiderte Kappe aus einem PCR-Tubus zum Schutz der exponierten GRIN-Linse bis zur Anbringung der Miniscope-Basis am Mausschädel. (E) Der Miniscope-Halter (Sockel) mit einer Sechskantmutter. (F) Ein Miniscope, dessen Gewindeteil mit dem PTFE-Band umwickelt ist. (G) Ein Miniskop, das mit einer Verriegelungsschraube an seiner Basis befestigt ist. (H) Der Miniscope-Haltearm. (I) Ein speziell angefertigter motorisierter 3D-Controller, der die Bewegung des Miniskops in XYZ-Positionen erleichtert. (J) Eine Schutzkappe, die an der Basis befestigt ist, um die exponierte GRIN-Linse zu schützen, während die Maus keine In-vivo-Kalziumbildgebung durchführt. (K) Das Miniscope, das mit dem Kabel verbunden ist. (L) Das Datenerfassungssystem für die In-vivo-Ca 2+- Bildgebung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Abbildung 3: Schnittstellen der AutoStereota-Software während der Schicht-für-Schicht-Hirngewebeaspiration. (A) Die Grenzfläche, die den Schritten 2.17.1 bis 2.17.3 entspricht. (B) Die Schnittstelle, die den Schritten 2.17.4 bis 2.17.6 entspricht. c) Die Schnittstelle gemäß den Schritten 2.17.7 bis 2.17.9. (D) Die Schnittstelle, die den Schritten 2.17.10 bis 2.17.12 entspricht. Rote Kästchen heben die Eingabewerte hervor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Abbildung 4: Schnittstellen der NeuView-Software und der Verhaltensaufzeichnungssoftware während der In-vivo-Kalziumbildgebung . (A) Die Schnittstelle von NeuView. (B,C) Die Schnittstellen der Verhaltensaufzeichnungssoftware. Rote Kästchen markieren Schaltflächen, auf die geklickt werden muss. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Abbildung 5: Maximale Projektion Fluoreszenzzellkarten, um die Bandbreite der möglichen Ergebnisse zu zeigen. (A,B) Erfolglose In-vivo-Calcium-Bildgebung, die für die nachfolgende Datenanalyse nicht akzeptabel ist. (A) ist dunkel und enthält weniger als 5 aktive Neuronen. (B) ist hell, hat aber keine aktiven Neuronen. (C) Die Zellkarte aus einer suboptimalen In-vivo-Kalziumbildgebung, die einige aktive Neuronen enthält. (D) Die Zellkarte aus einer guten In-vivo-Kalziumbildgebung, die mehrere hundert aktive Neuronen umfasst. Maßstabsstab: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Zellkarte und Calciumtransienten aus einer erfolgreichen in vivo Calciumbildgebung. Das linke Feld zeigt die maximale Projektionsfluoreszenzzellkarte aus einer in vivo Calcium-Bildgebungsaufzeichnung im mPFC während eines Freifeldtests. Die Aufnahme dauert 5 min. Das rechte Feld zeigt Calciumtransienten aus 15 Regionen von Interesse (farblich abgestimmt). Maßstabsstab: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Abbildung 7: Postmortale Beurteilung einer Versuchsmaus. Die postmortale Beurteilung für GCaMP6f-Expression und GRIN-Linsenimplantation in den mPFC einer experimentellen Maus. Der rechteckige Bereich gibt den Weg für die Implantation der GRIN-Linse an. Der grüne Bereich unter der implantierten GRIN-Linsenregion bestätigt, dass GCaMP6f exprimiert wurde und die GRIN-Linse genau in die gewünschte Hirnregion implantiert wurde. Cg, cingulärer Kortex; PrL, prälimbischer Kortex; IL, infralimbischer Kortex. Maßstabsstab: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Tabelle 1: Vergleiche des speziell angefertigten Miniscope-Systems am NIDA mit anderen Miniscope-Systemen 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Film 1: Eine In-vivo-Calcium-Bildgebungsaufzeichnung von der Maus mPFC während eines Freifeldtests. Zu Demonstrationszwecken zeigt dieses Video nur 1 Minute Aufnahme. Die ursprüngliche Aufnahmebildrate beträgt 10 Bilder/s. Das Video ist 6-mal schneller als die Originalaufnahme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung neuronaler Dynamik und Mikroschaltkreise in sich frei verhaltenden Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von Gehirnoperationen, um eine gute In-vivo-Kalziumbildgebung mit einem Miniskop zu erreichen.

Stereotaktische virale Injektion und Gradientenindex-Linsenimplantation für Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung ermöglicht es Forschern, die räumlich und zeitlich koordinierte Aktivität von Hunderten von Neuronen in tiefen Gehirnstrukturen frei verhaltender Tiere zu untersuchen. Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung bietet viele Vorteile, einschließlich der Möglichkeit, Aufnahmen durchzuführen, die zelltypspezifisch, groß und längs sind. Unser Operationsprotokoll für die virale Injektion und die Implantation der GRIN-Linse ist mit allen kommerziellen oder kundenspezifischen Einzelphotonen- und Zwei-Photonen-Bildgebungssystemen für die Deep-Brain-In-vivo-Kalziumbildgebung kompatibel.Rashmi Thapa, ein Doktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Nachdem Sie den rasierten chirurgischen Bereich einer betäubten Maus desinfiziert haben, verwenden Sie ein Skalpell, um einen zwei Zentimeter großen Schnitt durch die Haut entlang der Mittellinie zu machen, um das Lambda und das Bregma des Schädels freizulegen. Nachdem Sie den 0,5 Millimeter Zahnbohrgrat in eine Position von vorderen hinteren 1,94 Millimetern und medialen lateralen 0,5 Millimetern vom Bregma lokalisiert haben, beginnen Sie mit dem Bohren durch den Schädel.Als nächstes laden Sie das Virus mit dem Bedienfeld der Mikropumpe in die Mikroliterspritze und ziehen 500 Nanoliter Luftblase ab, gefolgt von 800 Nanolitern des Virus mit einer Durchflussrate von 50 Nanolitern pro Sekunde. Bewegen Sie sich langsam die Nadel hinunter in das Hirngewebe zur angestrebten Z-Koordinate der dorsalen ventralen 1,75 Millimeter und bewegen Sie sie dann leicht bis zur Z-Koordinate der dorsalen ventralen 1,65 Millimeter. Stellen Sie auf dem Bedienfeld die Mikropumpe so ein, dass 500 Nanoliter des Virus mit einer Durchflussrate von 50 Nanolitern pro Minute injiziert werden, bevor Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken, um das Virus zu injizieren.Wenn die Injektion vorbei ist, richten Sie die Hautränder aus und schließen Sie den Schnitt vorsichtig mit einer 4-0-Naht. Tragen Sie eine antibiotische Salbe auf die genähte Stelle auf, um eine Infektion zu verhindern. Um den Gradientenindex oder die GRIN-Linse zu implantieren, entfernen Sie mit einer feinen Schere einen dreieckigen Bereich der Haut von 1,5 Zentimeter Höhe und 1,5 Zentimeter Basis von der Vorderseite zwischen den Augen bis zur hinteren Seite hinter dem Lambda.Nachdem der Schädel gründlich gereinigt und getrocknet wurde, tragen Sie Cyanacrylat auf die Hautränder auf und befestigen Sie die Haut am Schädel. Nach fünf Minuten, wenn das Cyanacrylat trocknet, lokalisieren Sie einen Zahnbohrgrat von 1,2 Millimetern Durchmesser zu einer Position von vorderen hinteren 1,94 Millimetern, medial lateral 0,8 Millimeter vom Bregma entfernt. Bohren Sie durch den Schädel, gefolgt von der Entfernung der Dura mit einer 30-Gauge-Nadelspitze.Reinigen Sie alle Knochenreste mit einer um 45 Grad abgewinkelten scharfen Pinzette. Als nächstes befestigen Sie eine manuell polierte stumpfe Endnadel mit 27 Messgeräten an dem Nadelhalter, der mit einem um 10 Grad geneigten Roboterarm gekoppelt ist, und verbinden Sie das andere Ende des Nadelhalters mit dem Hausvakuumsystem. Suchen Sie die Spitze der Nadel, um nur die Bregma zu berühren, bevor Sie auf die Bregma-Schaltfläche klicken, um die Z-Koordinate von Bregma auf Null zu setzen.Setzen Sie den Wert für Eingang X auf 0,8, den Wert für Eingabe Y auf 1,94, den Wert für die Eingabe Z auf 1,0 und klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen, um die Nadel auf die Oberseite des gebohrten Lochs am Schädel zu bewegen. Zentrieren Sie die Nadelspitze auf das gebohrte Loch und bringen Sie es auf die Z-Position Null. Schalten Sie das Vakuum ein und beginnen Sie, den exponierten Gehirnbereich mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) durch ein schwerkraftgesteuertes Schlauchsystem zu spülen, das mit einer 30-Gauge-Nadel mit einer gebogenen Spitze verbunden ist.ACSF wird kontinuierlich mit einem Gasgemisch aus 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid gesprudelt, während es durch einen 0,2-Mikron-Filter gefiltert wird. Mit der AutoStereota-Software wird die Aspiration des Hirngewebes in vier Runden abgeschlossen. Stellen Sie für die erste Aspirationsrunde sicher, dass der Z-Wert Null anzeigt.Klicken Sie dann in der zStep-Sitzung auf und überprüfen Sie die erste und zweite Zeile. Legen Sie die Werte für die erste Zeile auf 0,2 und 1 fest. Legen Sie die Werte für die zweite Zeile auf 0,15 und 4 fest.Stellen Sie in der Modussitzung die Nadelgröße 27 und 1,2 ein. Setzen Sie Dims 0.9. Alle anderen Werte sind Standardwerte.Um die Aspiration zu starten, klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen NotSet, KeepZero und Start. Die erste Aspirationsrunde erzeugt eine Säulentasche mit 0,8 Millimeter Tiefe und 1 Millimeter Durchmesser. Klicken Sie in der dritten Aspirationsrunde auf die erste Zeile für die zStep-Sitzung, und legen Sie die Werte für die erste Zeile auf 1,8 und 1 fest.Stellen Sie in der Modussitzung die Nadelgröße 27 und 2,2 ein. Beginnen Sie die Aspiration, indem Sie andere Werte wie in der vorherigen Runde beibehalten. Nach der dritten Aspirationsrunde beträgt die Tiefe der Säulentasche 1,8 Millimeter.Die letzte Runde des Bestrebens besteht darin, Blut zu reinigen, das sich am Boden der Tasche angesammelt hat. Stellen Sie die Werte für die erste Zeile in der zStep-Sitzung auf 1,6 und 1 ein und legen Sie die Nadelgröße 27 Gauge und 2.2 und Dims 0.6 in der Mode-Sitzung fest, bevor Sie mit der Aspiration beginnen. Sobald die Tasche blutfrei ist, stoppen Sie das Vakuum, stoppen Sie die Bewässerung von ACSF und bringen Sie die Nadel um 2 Millimeter in Z-Koordinate und 0,5 Millimeter vor die Mitte.Legen Sie die sterile 1 Millimeter GRIN-Linse in die Hirngewebetasche. Als nächstes tragen Sie die geschmolzene Agarose mit Hilfe eines Spatels in der Lücke zwischen der GRIN-Linse und dem Hirngewebe auf. Nachdem Agarose ein Gel gebildet hat, entfernen Sie überschüssige Agarose mit einer Mikroklinge.Mischen Sie das Zahnzementpulver und die Katalysatorflüssigkeit in einer vorgekühlten Mischung und tragen Sie eine Schicht selbsthärtenden Haftharzements auf den Schädel auf, beginnend mit der Umfassung der GRIN-Linse und dann mit dem gesamten freiliegenden Schädel. Mischen Sie in einem sauberen Kunststoffbrunnen Zahnzementpulver und schwarze Holzkohle mit Flüssigkeit, um eine dünne Schicht der Mischung auf die erste Schicht Zahnzement aufzutragen. Lassen Sie es fünf Minuten aushärten.Schließen Sie das Miniscope an das Kabel an und schalten Sie die speziell entwickelte Software NuView ein. Klicken Sie in NuView auf Hardware, aktivieren Sie LED1 und klicken Sie auf die Schaltfläche Stream, um die Livebilder anzuzeigen. Um das Live-Streaming zu stoppen, klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp.Als nächstes setzen Sie das Miniscope in einen speziell angefertigten Miniscope-Haltearm. Mit Hilfe von motorisierten Controllern positionieren Sie das Miniscope direkt über der belichteten GRIN-Linse, so dass es parallel zur Oberfläche des Objektivs verläuft. Bringen Sie das Miniscope langsam in Richtung GRIN-Objektiv und passen Sie seine Z-Position an, bis die beste Fokusebene gefunden ist.Tragen Sie die erste Schicht Zahnzement um die Miniscope-Basis auf, ohne die Position des Miniscopes zu verändern. Nachdem der Zement ausgehärtet ist, entfernen Sie vorsichtig den Haltearm, so dass das Miniscope alleine auf dem Mauskopf stehen kann. Tragen Sie eine zweite Schicht Zahnzement um die Basis auf, um alle Lücken zu füllen, und stellen Sie sicher, dass kein LED-Licht aus den Lücken austritt.Lassen Sie den Zahnzement aushärten. Nachdem Sie die Maus kurz mit Isofluran betäubt haben, lösen Sie die Verriegelungsschraube in der Basis mit einem kleinen Schraubendreher, bevor Sie die Schutzkappe entfernen, und reinigen Sie die Oberfläche der GRIN-Linse mit einem acetongetränkten Wattestäbchen. Schließen Sie das Miniscope an das Kabel an und starten Sie die NuView-Software, um die beste Brennebene zu identifizieren, indem Sie die Position des Miniscopes relativ zur Basis anpassen, indem Sie sie mit Hilfe einer stumpfen Pinzette leicht anziehen oder lockern.Sobald die beste Fokusebene ermittelt wurde, ziehen Sie die Verriegelungsschraube fest, bevor Sie das Kabel trennen und die Maus wieder in den Hauskäfig legen. Aktivieren Sie die Verhaltenskamera-Software, um die Mausverhaltensarena über eine Livestream-Funktion anzuzeigen. Stellen Sie den Fokus der Top-Kamera manuell ein.Wählen Sie Trigger Strobe und aktivieren Sie Trigger/Trigger aktivieren/deaktivieren, gefolgt von einem Klick auf die Schaltfläche Aufnahme. Verwenden Sie dann Durchsuchen, um einen Speicherort auszuwählen, an dem Verhaltensaufzeichnungen gespeichert werden. Wählen Sie das gewünschte Bildformat aus.Bringen Sie die Maus in die Nähe der Arena und verbinden Sie das Miniscope mit dem Kabel, das mit dem Datenerfassungssystem verbunden ist. Platzieren Sie dann die Maus in der Mitte der Arena. Klicken Sie in der Verhaltenskamera-Software auf Aufzeichnung starten.Aktivieren Sie in NuView LED1, klicken Sie auf Capture und lösen Sie dann Schaltflächen aus, um die Aufnahme zu starten. Dies ermöglicht die gleichzeitige Aufzeichnung von Kalziumbildgebung und Mausverhalten. Klicken Sie nach 3.000 Bildern auf Stop und speichern Sie die Dateien.Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, betäuben Sie die Maus kurz mit Isofluran, lösen Sie das Miniscope von der Basis und legen Sie die Schutzkappe über die Basis, bevor Sie die Maus wieder in ihren Heimatkäfig legen. Die Zellkarte aus der suboptimalen In-vivo-Kalziumbildgebung enthielt einige aktive Neuronen, während die aus der erfolgreichen Bildgebung mehrere hundert aktive Neuronen im fokussierten Bereich umfasste. Im typischen Beispiel einer erfolglosen In-vivo-Kalziumbildgebung wurde beobachtet, dass die Region dunkel war und weniger als fünf aktive Neuronen enthielt, oder die Region war hell, hatte aber keine aktiven Neuronen.In der repräsentativen Analyse werden die maximale Projektionsfluoreszenzzellkarte und Calciumtransienten aus einer sukzessiven in vivo Calciumbildgebung gezeigt. Die postmortale Beurteilung der GCaMP6f-Expression und der GRIN-Linsenimplantation in das mediale PFC einer experimentellen Maus ergab, dass GCaMP6f exprimiert wurde und die GRIN-Linse genau in die gewünschte Hirnregion implantiert wurde. Um eine gute Kalziumbildgebung zu erhalten, muss sichergestellt werden, dass die Blutung vollständig gestoppt wurde und das Feld frei von Blutgerinnseln ist, bevor die GRIN-Linse implantiert wird.Diese Technik kann verwendet werden, um neuronale Schaltkreisänderungen im Mausmodell verschiedener menschlicher Gehirnstörungen zu untersuchen und zu testen, ob ein Arzneimittelkandidat die veränderten Schaltkreise normalisieren kann.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Forschung

Neurowissenschaften

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Deep Brain Stimulation mit gleichzeitiger fMRT in Nagetiere

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Nicht-invasive Parenchymale, Gefäß- und Stoffwechselhochfrequenz-Ultraschall und Photoakustische Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Gehirn Perizyten-Kalzium und hämodynamische Bildgebung bei transgenen Mäusen in Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...