Name: stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 ו- UG3NS115608.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex.">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice.">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li><li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning.">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li><li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information.">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINscope,+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations.">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987 (2020).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice.">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration.">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li><li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior.">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery.">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li><li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient-index+optics:+A+review.">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals.">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging.">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li><li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation.">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173 (2019).</li><li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice.">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li><li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice.">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li><li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases:+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy.">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).</li><li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre/loxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome.">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li><li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-loxP-mediated+recombination:+General+principles+and+experimental+considerations.">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li></ol>

המחברים אינם מדווחים על אינטרסים כלכליים מתחרים.

שאלה מרכזית במדעי המוח היא הבנת האופן שבו דינמיקה ומעגלים עצביים מקודדים ומאחסנים מידע, וכיצד הם משתנים במחלות מוח. באמצעות מיניסקופ in vivo Ca2+ הדמיה, ניתן לנטר בו זמנית פעילות עצבית בודדת מכמה מאות נוירונים בתוך מיקרו-מעגל מקומי מבעל חיים שמתנהג באופן חופשי. כאן, פרוטוקול ניתוח מפורט להזרקה ויראלית והשתלת עדשת GRIN מתואר כדי להכין מכרסמים להדמיית מוח עמוק in vivo Ca2+ באמצעות מערכת הקלטה של מיניסקופ שפותחה בהתאמה אישית. טבלה 1 מציגה את ההשוואות של מערכת המיניסקופ שלנו עם מערכות מיניסקופ אחרות הזמינות מסחרית ובהתאמה אישית 7,8,9,10,11,13,25,26. ראוי לציין כי השתלת עדשת GRIN באמצעות הפרוטוקול הכירורגי הנוכחי תואמת לכל מערכת הדמיה מסחרית או מותאמת אישית של פוטון יחיד ושני פוטונים עבור הדמיית סידן in vivo במוח עמוק.
מהזרקה ויראלית ועד רכישת נתונים של הדמיית סידן in vivo של מיניסקופ, כל הליך הניסוי לוקח לפחות חודשיים להשלים. זהו תהליך מסובך ועתיר עבודה. ההצלחה הסופית של הניסוי תלויה במספר גורמים, כולל בחירה נכונה של GECIs, הזרקת וירוס במדויק באזור המוח הממוקד, ביטוי ויראלי מספיק באוכלוסייה העצבית הרצויה, השתלת עדשת GRIN בדיוק במיקום הרצוי, התאוששות נאותה מניתוחים, כמו גם, האם דלקת חמורה מתרחשת לאחר הניתוח, והאם התנהגות בעלי החיים מושפעת קשות מניתוחים, וכן הלאה.
שני שלבים קריטיים כוללים הזרקה סטריאוטקסית של וירוס והשתלת עדשת GRIN. לצורך ההדגמה, המיקרו-איניג'קציה הסטריאוטקסית בוצעה ב-mPFC של העכבר, כאשר נגיף הקשור לאדנו (AAV1) מקודד את GCaMP6f בשליטת מקדם CaMKII שמתייג באופן סלקטיבי נוירונים פירמידליים ב-mPFC. GCaMP6f נבחר מכיוון שהוא אחד ממדדי הסידן המהירים והרגישים ביותר עם זמן של חצי ריקבון של 71 אלפיות השנייה15. בנוסף, הביטוי הנגיפי AAV של GCaMP6f הוא ארוך טווח (כלומר, מספר חודשים), מה שהופך אותו לאידיאלי לביצוע הדמיה חוזרת ונשנית in vivo Ca2+ לאורך תקופה ארוכה עבור מחקרי אורך במודלים של עכברים של מחלות נוירודגנרטיביות27. פרוטוקול הניתוח הנוכחי יכול להיות מותאם למיקוד אוכלוסיות תאים שונות בכל אזור מוח אחר. כלים ויראליים שונים זמינים מאפשרים תיוג סלקטיבי של אוכלוסיות עצביות ספציפיות באזור המוח הרצוי בגיל הרצוי. בנוסף, חוקרים יכולים לנצל את מערכת הרקומבינציה Cre-LoxP ואת מודלי העכברים המהונדסים הזמינים השונים כדי לבצע שינויים גנטיים ולחקור את תוצאות המעגלים ההתנהגותיים והעצביים28,29.
מאפיין ייחודי אחד של הפרוטוקול המוצג הוא שהשאיפה האוטומטית של רקמת המוח שכבה אחר שכבה בוצעה לפני השתלת עדשת GRIN (בקוטר 1 מ"מ). זה מושג באמצעות מחט 27 גרם המחוברת למערכת ואקום, הנשלטת על ידי זרוע רובוטית שנבנתה בהתאמה אישית ותוכנה23. בהתבסס על הניסיון שלנו, שיטה זו יוצרת משטח אחיד לעדשת GRIN למגע וגורמת פחות נזק לרקמה השכנה מאשר שאיפת רקמות ידנית23. מסיבה זו, הליך זה מביא יתרון ברור לעדשות GRIN בקוטר רחב יחסית (למשל, 1 מ"מ). עם זאת, ייתכן ששאיפת רקמות אינה נחוצה להשתלת עדשת GRIN בקוטר קטן יותר (0.5 מ"מ או 0.25 מ"מ). במקום זאת, ניתן לשתול אותו ישירות לאורך המסלול המוביל המיוצר עם מחט 30 G21.
מלבד שני השלבים הקריטיים שנדונו לעיל, יש לשקול בזהירות גורמים רבים אחרים לצורך ניתוח מוצלח. (1) יש לעקר את כל המכשירים שבאים במגע עם המוח כדי למנוע זיהום. (2) כל שלבי הניתוח צריכים להתבצע כדי למזער את הנזק למוח כדי למנוע דלקת נוספת ויצירת רקמת צלקת מוגזמת. (3) יש לשקול בקפידה את מינוני ההרדמה שניתנו בתחילה ונשמרו במהלך הניתוח, במיוחד אלה שניתנו באופן תוך-צפקי. מינוני ההרדמה עשויים להשתנות בהתאם לזני עכברים שונים, שכן חלקם עשויים להיות רגישים יותר. (4) מצבו של העכבר צריך להיות מנוטר כל הזמן במהלך הניתוח. לבסוף, (5) העכברים צריכים להיות במעקב קבוע לאחר הניתוח, שכן סיבוכים רבים עלולים להתרחש לאחר הניתוח.
למרות שנתח של רקמת מוח מוסר באופן חד צדדי במהלך שלב השתלת עדשת GRIN, לא ראינו ליקויי התנהגות ברורים 7,12. משקלו של המיניסקופ הוא כ-2 גרם והכבל מתוכנן בהתאמה אישית כדי להפוך אותו לקליל ולהבטיח שהעכבר יוכל לשאת אותו בקלות. המיניסקופ והכבל מחוברים לחיה רק לפני הדמיית in vivo ומנותקים לאחר ההדמיה. תהליך ההדמיה כולו אורך בדרך כלל לא יותר מ-30 דקות. לכן, מכשור זה אינו מונע מהעכבר להתנהג בחופשיות. התקנת המיניסקופ ושלבי הדה-אינסטלציה זקוקים להרדמה קצרה (פחות מ-2 דקות) עם איזופלורן לצורך ריסון בעלי חיים. בדרך כלל אנו מאפשרים לעכבר להתאושש מהחשיפה הקצרה של איזופלורן למשך 30 דקות לפני ביצוע הדמיית in vivo. ביצענו הדמיית סידן in vivo של מיניסקופ פעם בשבוע במשך כמה שבועות מבלי לשים לב להשפעה כלשהי על בריאות העכברים ועל ההתנהגות החברתית של העכבר12.
מגבלה מרכזית אחת של מערכת ההקלטה הנוכחית של המיניסקופ היא הצורך לחבר את המיקרוסקופ לכבל לצורך רכישת נתונים. נוכחות הכבל מגבילה לעתים את ביצועי משימת העכבר ומגבילה את ההקלטה של חיה אחת בכל פעם. לאחרונה פותח מיניסקופ אלחוטי25,26. זה ירחיב את ביצועי המשימה ויאפשר הדמיית in vivo בו זמנית ממספר בעלי חיים בקבוצה. יתר על כן, פיתוח GECIs רגישים יותר עם אורכי גל הניתנים להפרדה ספקטרלית בשילוב עם מיניסקופ דו-צבעי יציעו אפשרויות מרגשות יותר למחקר במדעי המוח.

איתות Ca2+ תוך-תאי הוא מווסת חיוני של גדילת תאים, התפשטות, התמיינות, הגירה, שעתוק גנים, הפרשה ואפופטוזיס1. בתאי עצב, איתות Ca2+ נשלט במדויק מכיוון שהתבנית המרחבית-טמפורלית שלו קשורה לתפקודים חיוניים כגון רגישות ממברנה, שחרור נוירוטרנסמיטורים ופלסטיות סינפטית2.
הדמיית סידן In vivo היא טכניקה רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי לפענח ייצוג מעגלים עצביים יסודיים להתנהגויות נורמליות של בעלי חיים, לזהות פעילויות עצביות חריגות במודלים של בעלי חיים של הפרעות מוחיות, ולחשוף מטרות טיפוליות פוטנציאליות שעשויות לנרמל את המעגלים המשתנים האלה. שתי מערכות ההדמיה הנפוצות של סידן in vivo הן מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לסריקת לייזר דו-פוטונית 3,4,5,6 ומיקרואנדוסקופיה ממוזערת (מיניסקופ) המותקנת על הראש 7,8,9,10,11,12,13 . המיקרוסקופיה הקונבנציונלית של שני פוטונים מציעה יתרונות שולטים כגון רזולוציה טובה יותר, רעש נמוך יותר והלבנת תמונות נמוכה יותר; עם זאת, חיות הניסוי נדרשות להיות קבועות ראש, מה שמגביל את מחקרי ההתנהגות שניתן לבצע 3,4,5,6. לעומת זאת, מערכת המיניסקופ המותקנת על הראש היא קטנה וניידת, מה שמאפשר לחקור מגוון רחב של מבחני התנהגות באמצעות בעלי חיים המתנהגים בחופשיות 7,8,9,10,11,12,13.
ישנם שני אינדיקטורים מובילים של Ca2+, אינדיקטורים כימיים 5,14 ואינדיקטורים לסידן מקודדים גנטית (GECIs)15,16. הדמיית Ca2+ התאפשרה על ידי שימוש ב-GECIs רגישים ביותר המועברים עם וקטורים נגיפיים המאפשרים תיוג ספציפי של נוירונים במעגל הממוקד. המאמץ המתמשך לשפר את הרגישות, אריכות הימים והיכולת לתייג אפילו את התאים התת-תאיים, הופך את ה-GECIs לאידיאליים למחקרי הדמיית סידן in vivo שונים 17,18,19.
פיזור האור ברקמת המוח במהלך ההדמיה מגביל את החדירה האופטית לעומק, אפילו עם המיקרוסקופיה הדו-פוטונית. עם זאת, עדשת ה-Gradient Index (GRIN) מתגברת על בעיה זו מכיוון שעדשת ה-GRIN יכולה להיות מוטמעת ישירות ברקמות הביולוגיות ולהעביר תמונות מאזור המוח העמוק אל מטרת המיקרוסקופ. בניגוד לעדשה קונבנציונלית העשויה מחומר הומוגני אופטי ודורשת משטח בעל צורה מסובכת כדי להתמקד וליצור תמונות, ביצועי עדשת GRIN מבוססים על שינוי הדרגתי במקדם השבירה בתוך חומר העדשה שמשיג מיקוד עם משטח מישור20. ניתן לייצר עדשת GRIN עד לקוטר של 0.2 מ"מ. לכן, עדשת GRIN ממוזערת יכולה להיות מושתלת במוח העמוק מבלי לגרום נזק רב מדי.
במאמר זה, פרוטוקול ניתוח מלא מוצג עבור המוח העמוק in vivo סידן הדמיה. לצורך ההדגמה, אנו מתארים ניתוחי מוח המכוונים באופן ספציפי לקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC) של מוח העכבר והקלטת הדמיית סידן in vivo באמצעות מערכת מיניסקופים שנבנתה בהתאמה אישית שפותחה על ידי קבוצתו של ד"ר לין במכון הלאומי לשימוש בסמים (NIDA/IRP)7,12. ההליך הניסיוני כולל שני ניתוחי מוח גדולים. הניתוח הראשון הוא הזרקה סטריאוטקסית של וקטור ויראלי המבטא GCaMP6f (GECI) ב-mPFC. הניתוח השני הוא להשתיל את עדשת ה-GRIN באותו אזור במוח. לאחר ההחלמה מניתוחי מוח אלה, ההליך הבא הוא להצמיד את מחזיק המיניסקופ (בסיס) על גולגולת העכבר באמצעות מלט דנטלי. In vivo ניתן לבצע הדמיה Ca2+ בכל עת לאחר הרכבת המיניסקופ על בסיסו. פרוטוקול הניתוח להזרקה ויראלית והשתלת עדשות GRIN תואם לכל מערכת הדמיה מסחרית או מותאמת אישית של פוטון יחיד ושני פוטונים עבור הדמיית הסידן in vivo במוח העמוק.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6mm and 1.2mm drill burrs</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-G and 30-G needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>REF 305109 and REF305106</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% povidone-iodine solution (Betadine)</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>NDC 67618-151-17</td>
			<td>Surface disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124-1L</td>
			<td>GRIN lens cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-25G</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic ointment</td>
			<td>HeliDerm Technology</td>
			<td>81073087</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc</td>
			<td>30043308</td>
			<td>Acts as pain killer after surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoStereota</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>github.com/liang-bo/autostereota</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)</td>
			<td>Point Grey</td>
			<td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td>
			<td>For recording behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass hex nut</td>
			<td>McMASTER-CARR</td>
			<td>92736A112</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Par Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 4202317905</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commutator</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>BI-OX-CD5C-K</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>OX-M-K</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Microdrill</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Henkel Coorporation</td>
			<td># 1811182</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition controller</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data transmission cable</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>C&#38;B Metabond and Catalyst</td>
			<td>A00253revA306 and A00168revB306</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Duralay</td>
			<td>2249D</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>VETone</td>
			<td>NDC 1398503702</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet gel</td>
			<td>Clear H20</td>
			<td>72-06-5022</td>
			<td>Diet Supplement for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lens</td>
			<td>GRINTECH</td>
			<td>NEM-100-25-10-860-S</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Physitemp Instruments LLC.</td>
			<td>#10023</td>
			<td>To keep the mouse body warm during surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 502017</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 501072</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>WEST-WARD</td>
			<td>NDC 0143-9575-01</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe (Hamilton)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>#178647</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope base</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope holding arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope protection cap</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For protecting the miniscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KMTS50E</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuView</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0622</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinch Clamp</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>14040</td>
			<td>For clamping the tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape</td>
			<td>TegaSeal PTFE Tape</td>
			<td>A-A-58092</td>
			<td>For fastening miniScope to the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>RL 7302</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screw</td>
			<td>DECORAH LLC.</td>
			<td>3BT-P9005-00-0025</td>
			<td>For screwing the brass hex nut in miniscope base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Silicone Rubber tubing, 0.062&#8221;ID, 1/8&#8221;OD</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>2124T3</td>
			<td>For irrigation of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic stage</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>REF 806-WC</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Sofsilk</td>
			<td>REF SS683</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>For filtering aCSF during GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100834-AAV1</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 510650</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי (מיניסקופ) הוא כלי רב עוצמה להדמיית סידן in vivo מחיות המתנהגות בחופשיות. הוא מציע מספר יתרונות על פני מערכות הדמיה קונבנציונליות של סידן מרובה פוטונים: (1) קומפקטי; (2) קל משקל; (3) בר השגה; ו-(4) מאפשר הקלטה מבעלי חיים שמתנהגים בחופשיות. פרוטוקול זה מתאר ניתוחי מוח להדמיית סידן in vivo במוח עמוק באמצעות מערכת הקלטה של מיניסקופ שפותחה בהתאמה אישית. הליך ההכנה מורכב משלושה שלבים, כולל (1) הזרקה סטריאוטקסית של הנגיף באזור המוח הרצוי במוח של מוח עכבר כדי לתייג תת-קבוצה מסוימת של נוירונים עם חיישן סידן מקודד גנטית; (2) השתלת עדשת אינדקס גרדיאנט (GRIN) שיכולה להעביר תמונת סידן מאזור מוח עמוק למערכת המיניסקופ; ו-(3) הצמדת מחזיק המיניסקופ מעל גולגולת העכבר, שם ניתן לחבר מיניסקופ מאוחר יותר. כדי לבצע הדמיית סידן in vivo , המיניסקופ מהודק על המחזיק, ותמונות סידן עצבי נאספות יחד עם הקלטות התנהגות סימולטניות. פרוטוקול הניתוח הנוכחי תואם לכל מערכת הדמיה מסחרית או מותאמת אישית של פוטון יחיד ושני פוטונים להדמיית סידן in vivo עמוקה במוח.

איור 1 מראה את ההליך הניסויי הסכמטי, הכולל הזרקה נגיפית, השתלת עדשת GRIN, הצמדת בסיס המיניסקופ לגולגולת העכבר והדמיית סידן in vivo באמצעות מיניסקופ. ההליך כולו אורך כחודשיים. איור 2 מראה את המרכיבים העיקריים המתוארים בפרוטוקול להדמיית סידן in vivo של מיניסקופ. איור 3 מציג את הממשקים של תוכנת AutoStereota במהלך השתלת עדשת GRIN. איור 4 מציג את הממשקים של NeuView ואת תוכנת הקלטת ההתנהגות במהלך הדמיית סידן in vivo.
התוצאה של הדמיית סידן in vivo תלויה בהצלחתם של ניתוחי הזרקה נגיפית והשתלת עדשות GRIN. איור 5 מראה מגוון של תוצאות (כלומר, לא מוצלחות, לא אופטימליות וטובות) מרישומי הדמיית סידן in vivo . במקרים לא מוצלחים, תמונת הסידן יכולה להיראות כהה או בהירה, אך בדרך כלל חושפת לא או מעט מאוד נוירונים פעילים. בדרך כלל איננו ממשיכים בניסויים ברישום סידן in vivo אם יש פחות מחמישה תאי עצב פעילים. הדמיית סידן in vivo טובה חושפת בדרך כלל כמה מאות נוירונים פעילים. אם הקלטה מכילה פחות ממאה תאי עצב פעילים, אנו רואים בה הקלטה לא אופטימלית.
הן בהקלטות לא אופטימליות והן בהקלטות טובות בוצעו ניסויי הדמיית סידן in vivo , וניתוח הנתונים שלאחר מכן בוצע. סרט 1 מציג הקלטה מייצגת של הדמיית סידן in vivo מ-mPFC של העכבר. סרטוני התנהגות ונתוני הדמיית סידן מעובדים בדרך כלל בנפרד. ניתן להבקיע באופן ידני סרטוני התנהגות עכבר. קבצי הדמיית סידן מעובדים באמצעות ארגז הכלים לעיבוד תמונה של סידן CaImAn24. איור 6 מראה מפת תאים מייצגת וכמה עקבות סידן מרישום טוב של הדמיית סידן in vivo .
לאחר השלמת הדמיית הסידן in vivo , השלב האחרון הוא לאשר אם ההזרקה הנגיפית והשתלת עדשת GRIN התרחשו באזור המוח הרצוי. לשם כך, העכבר הוחדר עם מלח בעל מאגר פוספט (PBS) ואחריו 4% פרפורמלדהיד (PFA). מוח העכבר נקטף, הוצב ב-4% PFA במשך 12 שעות, ואוחסן ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מוח העכבר נחתך אז לפרוסות בעובי 50 מיקרומטר עם ויברטום. פרוסות המוח הוכתמו ב-DAPI ונצפו תחת המיקרוסקופ (לא מתואר בפרוטוקול)12. איור 7 הוא פרוסת מוח של עכבר בגודל של כ-1.94 מ"מ קדמית לברגמא מעכבר ניסיוני, ומראה את המסלול שבו הושתלה עדשת ה-GRIN. אזור הפלואורסצנציה הירוק מתחת למסלול עדשות GRIN ובסביבתו מציין את הביטוי של GCaMP6f באזור mPFC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של ההליך הניסיוני. (B) השתלת עדשת GRIN ב-mPFC. (C) הצמדת בסיס מיניסקופ לגולגולת העכבר. (D) הרכבה של מיניסקופ והדמיית סידן in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> איור 2: רכיבים עיקריים הדרושים להדמיית סידן in vivo . (A) עדשת GRIN בקוטר 1 מ"מ ובאורך 4.38 מ"מ. (B) מחט קהה בעלת קצה קהה מלוטשת באורך 27 גרם המשמשת לשאיפת רקמת המוח. (C) הזרוע הרובוטית המוצמדת למחזיק המחט. (D) מכסה מותאם אישית מצינור PCR להגנה על עדשת ה-GRIN החשופה עד להצמדת בסיס מיניסקופ על גולגולת העכבר. (E) מחזיק המיניסקופ (בסיס) עם אום הקסדצימלי. (F) מיניסקופ שחלק החוט שלו עטוף בקלטת PTFE. (G) מיניסקופ מהודק לבסיסו באמצעות בורג נעילה. (ח) המיניסקופ האוחז בזרועו. (I) בקר ממונע תלת-ממדי שנבנה בהתאמה אישית ומשמש להקלה על תנועת המיניסקופ במיקומי XYZ. (J) מכסה מגן מהודק על הבסיס כדי להגן על עדשת ה-GRIN החשופה בזמן שהעכבר אינו מבצע הדמיית סידן in vivo . (K) המיניסקופ המחובר לכבל. (L) מערכת רכישת הנתונים להדמיה in vivo Ca2+ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> איור 3: ממשקים של תוכנת AutoStereota במהלך שאיפת רקמת מוח שכבה אחר שכבה. (B) הממשק המתאים לשלבים 2.17.4 עד 2.17.6. (C) הממשק המתאים לשלבים 2.17.7 עד 2.17.9. (ד) הממשק המתאים לשלבים 2.17.10 עד 2.17.12. תיבות אדומות מדגישות את ערכי הקלט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> איור 4: הממשקים של תוכנת NeuView ותוכנת הקלטת ההתנהגות במהלך הדמיית סידן in vivo . (A) הממשק של NeuView. (ב,ג) הממשקים של תוכנת הקלטת ההתנהגות. תיבות אדומות מדגישות לחצנים שיש ללחוץ עליהם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> איור 5: הקרנה מקסימלית של תאים פלואורסצנטיים ממפים כדי להראות את טווח התוצאות האפשריות. (A) הוא כהה ומכיל פחות מ-5 תאי עצב פעילים. (B) הוא בהיר אך אין לו נוירונים פעילים. (C) מפת התאים מהדמיית סידן in vivo תת-אופטימלית המכילה כמה תאי עצב פעילים. (D) מפת התאים מהדמיית סידן in vivo טובה הכוללת כמה מאות נוירונים פעילים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> איור 6: מפת תאים מייצגת וחולף סידן מהדמיית סידן in vivo מוצלחת. הפאנל השמאלי הוא מפת התאים הפלואורסצנטיים של ההקרנה המקסימלית מהקלטת הדמיית סידן in vivo ב-mPFC במהלך בדיקת שדה פתוח. ההקלטה נמשכת 5 דקות. הפאנל הימני מציג ארעי סידן מ-15 אזורי עניין (תואמי צבע). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> איור 7: הערכה לאחר המוות של עכבר ניסיוני. ההערכה שלאחר המוות עבור ביטוי GCaMP6f והשתלת עדשת GRIN ב- mPFC של עכבר ניסיוני. האזור המלבני מציין את הנתיב להשתלת עדשת GRIN. האזור הירוק שמתחת לאזור המושתל בעדשת GRIN מאשר כי GCaMP6f הובטא, ועדשת GRIN הושתלה בדיוק באזור המוח הרצוי. Cg, קליפת המוח הסינגולטית; PrL, קליפת המוח הפרה-לימבית; IL, קליפת המוח האינפרא-לימבית. סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה 1: השוואות של מערכת המיניסקופים שנבנתה בהתאמה אישית ב-NIDA עם מערכות מיניסקופ אחרות 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
סרט 1: הקלטת הדמיית סידן in vivo מ-mPFC של העכבר במהלך בדיקת שדה פתוח. למטרות הדגמה, סרטון זה מציג רק הקלטה של דקה אחת. קצב הפריימים המקורי של ההקלטה הוא 10 פריימים לשנייה. הסרטון מהיר פי 6 מההקלטה המקורית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

הדמיית סידן in vivo של Miniscope in vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר דינמיקה עצבית ומיקרו-מעגלים בעכברים המתנהגים בחופשיות. פרוטוקול זה מתאר ביצוע ניתוחי מוח להשגת הדמיית סידן in vivo טובה באמצעות מיניסקופ.

הזרקה נגיפית סטריאוטקסית והשתלת עדשה בעלת אינדקס שיפוע להדמיית סידן עמוקה במוח In Vivo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

הדמיית סידן in vivo של Miniscope מאפשרת לחוקרים לבחון את הפעילות המרחבית והמתואמת באופן זמני ממאות נוירונים במבנים מוחיים עמוקים של בעלי חיים המתנהגים בחופשיות. הדמיית הסידן של Miniscope in vivo מציעה יתרונות רבים, כולל היכולת לבצע הקלטות שהן ספציפיות לסוג התא, בקנה מידה גדול ואורכיות. פרוטוקול הניתוח שלנו להזרקה ויראלית והשתלת עדשת GRIN תואם לכל מערכת הדמיית פוטון בודדת מסחרית או מותאמת אישית ושתי מערכות הדמיית פוטון להדמיית סידן in vivo במוח העמוק.מי שידגים את ההליך יהיה רשמי טאפה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר חיטוי האזור הכירורגי המגולח של עכבר מורדם, השתמש באזמל כדי לבצע חתך של שני סנטימטרים דרך העור לאורך קו האמצע כדי לחשוף את למבדה וברגמה של הגולגולת. לאחר איתור הקידוח הדנטלי בקוטר 0.5 מילימטר למיקום של 1.94 מילימטרים אחוריים קדמיים ו-0.5 מילימטרים רוחביים מדיאליים מהברגמה, התחילו לקדוח דרך הגולגולת.לאחר מכן, טען את הנגיף למזרק המיקרוליטר באמצעות לוח הבקרה של משאבת המיקרו והמשוך 500 ננוליטרים של בועת אוויר ואחריה 800 ננוליטרים של הנגיף בקצב זרימה של 50 ננוליטרים בשנייה. הזיזו באיטיות את המחט לתוך רקמת המוח אל קואורדינטת Z הממוקדת של הגחון הגבי באורך 1.75 מילימטרים, ואז הזיזו אותה מעט עד לקואורדינטת Z של הגחון הגבי באורך 1.65 מילימטרים. בלוח הבקרה, הגדר את משאבת המיקרו להזריק 500 ננו-ליטרים של הנגיף בקצב זרימה של 50 ננו-ליטרים בדקה לפני שתלחץ על כפתור ה-Run כדי להזריק את הנגיף.כאשר ההזרקה מסתיימת, יישרו את קצוות העור וסגרו בזהירות את החתך עם תפר 4-0. יש למרוח משחה אנטיביוטית על האזור התפור כדי למנוע זיהום. כדי להשתיל אינדקס שיפוע או עדשת GRIN, יש לשים אזור משולש של העור בגובה 1.5 ס"מ ובסיס של 1.5 ס"מ מהצד הקדמי בין העיניים לצד האחורי שמאחורי הלמבדה באמצעות מספריים עדינים.לאחר ניקוי יסודי של הגולגולת והתייבשות, יש למרוח ציאנואקרילט על קצות העור ולהצמיד את העור לגולגולת. לאחר חמש דקות כאשר הציאנואקרילט מתייבש, אתרו בור מקדחה דנטלי בקוטר 1.2 מילימטר למיקום של 1.94 מילימטרים אחוריים קדמיים, 0.8 מילימטרים רוחביים מדיאליים מהברגמה. קודחים דרך הגולגולת, ולאחר מכן מסירים את הדורה באמצעות קצה מחט של 30 מדים.נקו את כל פיסות פסולת העצם עם מלקחיים חדים בזווית של 45 מעלות. לאחר מכן, חברו מחט קצה קהה מלוטשת ידנית של 27 מדים למחזיק המחט המוצמדת לזרוע רובוטית מוטה בזווית של 10 מעלות וחברו את הקצה השני של מחזיק המחט למערכת הוואקום הביתית. אתר את קצה המחט רק כדי לגעת בברגמא לפני שתלחץ על כפתור Bregma כדי להגדיר את קואורדינטת Z של bregma לאפס.הגדר את ערך הקלט X ל- 0.8, הזן ערך Y ל- 1.94, הזן את ערך Z ל- 1.0 ולחץ על חפש כפתור כדי להזיז את המחט לראש החור שנקדח בגולגולת. מרכזים את קצה המחט אל החור שנקדח ומורידים אותה למצב Z אפס. הפעילו את הוואקום והתחילו לשטוף את אזור המוח החשוף בנוזל מוחי מלאכותי, או ACSF, באמצעות מערכת צינורות מבוקרת כבידה המחוברת למחט של 30 מדים עם קצה כפוף.ACSF מבעבע באופן רציף עם תערובת גזים של 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני תוך כדי סינון דרך מסנן של 0.2 מיקרון. באמצעות תוכנת AutoStereota, השאיפה של רקמת המוח תושלם בארבעה סבבים. עבור הסיבוב הראשון של השאיפה, ודא שהערך Z מציג אפס.לאחר מכן, בהפעלה zStep, לחץ ובדוק את השורה הראשונה והשנייה. הגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 0.2 ו- 1. הגדר את הערכים עבור השורה השנייה ל- 0.15 ו- 4.בהפעלה 'מצב', הגדר את גודל המחט 27 ו-1.2. סט דימס 0.9. כל הערכים האחרים יהיו ברירת המחדל.כדי להתחיל את השאיפה, לחץ ברצף על הלחצנים NotSet, KeepZero ו-Start. הסיבוב הראשון של השאיפה יוצר כיס עמוד עם עומק של 0.8 מילימטרים וקוטר של מילימטר אחד. בסיבוב השלישי של השאיפה, לחץ ובדוק את השורה הראשונה עבור הפעלת zStep והגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 1.8 ו- 1.בהפעלה 'מצב', הגדר את גודל המחט 27 ו- 2.2. התחל את השאיפה על ידי שמירה על ערכים אחרים זהים לאלה של הסיבוב הקודם. לאחר הסיבוב השלישי של השאיפה, עומק כיס העמוד הוא 1.8 מילימטרים.הסיבוב האחרון של השאיפה הוא לנקות את הדם שהצטבר בתחתית הכיס. הגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 1.6 ו- 1 בהפעלת zStep והגדר גודל מחט 27 מד ו- 2.2 ו- Dims 0.6 בהפעלת מצב לפני תחילת השאיפה. ברגע שהכיס נקי מדם, עצרו את הוואקום, הפסיקו את ההשקיה של ACSF והביאו את המחט למעלה 2 מילימטרים בקואורדינטות Z ו-0.5 מילימטרים קדמיים למרכז.הכניסו את עדשת ה-GRIN הסטרילית בקוטר 1 מילימטר לכיס רקמת המוח. לאחר מכן, יש למרוח את האגרוז המומס במרווח שבין עדשת ה-GRIN לרקמת המוח בעזרת מרית. לאחר agarose יוצר ג'ל, להסיר עודף agarose באמצעות להב מיקרו.מערבבים את אבקת המלט הדנטלית ואת נוזל הזרזים בבאר ערבוב מצוננת מראש ומורחים שכבה של מלט שרף דבק מרפא את עצמו על הגולגולת, החל מהקפת עדשת ה-GRIN ולאחר מכן כיסוי כל הגולגולת החשופה. בבאר פלסטיק נקייה, מערבבים אבקת מלט דנטלית ופחם שחור עם נוזל כדי למרוח שכבה דקה של התערובת על גבי השכבה הראשונה של המלט הדנטלי. תנו לו להתקשות במשך חמש דקות.חבר את המיניסקופ לכבל והפעל את התוכנה שפותחה בהתאמה אישית NuView. ב- NuView, לחץ על חומרה, בדוק את LED1 ולחץ על הזרם כפתור כדי להציג את התמונות החיות. כדי להפסיק את ההזרמה בשידור חי, לחץ על עצור כפתור.לאחר מכן, התיישבו המיניסקופ בזרוע האחיזה של מיניסקופ שנבנתה בהתאמה אישית. בעזרת בקרים ממונעים, אתרו את המיניסקופ ממש מעל עדשת ה-GRIN החשופה, מה שהופך אותה למקבילה לפני השטח של העדשה. הורידו באיטיות את המיניסקופ לכיוון עדשת ה-GRIN והתאימו את מיקום ה-Z שלו עד שיימצא מישור המיקוד הטוב ביותר.יש למרוח את השכבה הראשונה של מלט דנטלי סביב בסיס המיניסקופ מבלי לשנות את מיקום המיניסקופ. לאחר הקשחת המלט, הסר בעדינות את הזרוע המחזיקה כך שהמיניסקופ יוכל לעמוד בפני עצמו על ראש העכבר. יש למרוח שכבה שנייה של מלט דנטלי סביב הבסיס כדי למלא את כל הפערים, ולוודא שאין דליפת נורת LED מהמרווחים.תנו למלט הדנטלי להתקשות. לאחר הרדמה קצרה של העכבר עם איזופלורן, שחררו את בורג הנעילה בבסיס עם מברג קטן לפני הסרת מכסה המגן ונקו את פני השטח של עדשת GRIN עם צמר גפן ספוג אצטון. חברו את המיניסקופ לכבל והפעילו את תוכנת NuView כדי להתחיל לזהות את מישור המוקד הטוב ביותר עם התאמת מיקום המיניסקופ ביחס לבסיס על ידי הידוק קל או התרופפות בעזרת מלקחיים קהים.לאחר קביעת מישור המוקד הטוב ביותר, הדקו את בורג הנעילה לפני ניתוק הכבל והנחת העכבר בחזרה בכלוב הביתי שלו. הפעל את תוכנת מצלמת ההתנהגות כדי להציג את זירת התנהגות העכבר באמצעות פונקציית שידור חי. כוונו באופן ידני את המיקוד של המצלמה העליונה.בחר הפעל Strobe ובדוק את הפעל /השבת את ההדק, ולאחר מכן לחץ על לחצן הקלט. לאחר מכן השתמש ב- Browse כדי לבחור מיקום שבו יישמרו הקלטות התנהגות. בחר את תבנית התמונה הרצויה.קירבו את העכבר לזירה וחברו את המיניסקופ לכבל המקושר למערכת איסוף הנתונים. לאחר מכן הניחו את העכבר במרכז הזירה. בתוכנת מצלמת ההתנהגות, לחץ על התחל הקלטה.ב- NuView, בדוק את LED1, לחץ על Capture ולאחר מכן הפעל לחצנים כדי להתחיל להקליט. זה מאפשר הקלטות בו זמנית של הדמיית סידן והתנהגות עכבר. לחץ על עצור אחרי 3, 000 מסגרות ושמור את הקבצים.בסיום ההקלטה, הרדימו לזמן קצר את העכבר עם איזופלורן, נתקו את המיניסקופ מהבסיס והניחו את מכסה המגן מעל הבסיס לפני שהחזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו. מפת התאים מהדמיית סידן in vivo תת-אופטימלית הכילה כמה תאי עצב פעילים, בעוד שמתוך הדמיה מוצלחת כללה כמה מאות נוירונים פעילים באזור הממוקד. בדוגמה הטיפוסית של הדמיית סידן in vivo לא מוצלחת, האזור נצפה כהה והכיל פחות מחמישה נוירונים פעילים, או שהאזור היה בהיר אך לא היו בו נוירונים פעילים.בניתוח הייצוגי מוצגים מפת התאים הפלואורסצנטיים של ההקרנה המקסימלית וחלופי סידן מרישום רציף של הדמיית סידן in vivo. ההערכה שלאחר המוות לביטוי GCaMP6f והשתלת עדשת GRIN ב-PFC המדיאלי של עכבר ניסיוני הצביעה על כך ש-GCaMP6f הובטא ועדשת ה-GRIN הושתלה במדויק באזור המוח הרצוי. כדי לקבל הדמיית סידן טובה, יש צורך להבטיח כי הדימום נעצר לחלוטין ואת השדה נקי קרישי דם לפני השתלת עדשת GRIN.ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור שינויים במעגלים עצביים במודל העכברים של הפרעות מוחיות אנושיות שונות ולבדוק אם מועמד לתרופה יכול לנרמל את המעגלים שהשתנו.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

גירוי מוחי עמוק עם fMRI סימולטני במכרסמים

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

רקמת ריאה, כלי דם וחילוף חומרים בתדר גבוהים לא פולשני אולטראסאונד וphotoacoustic עכברוש Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...